生物化學(xué)教學(xué)中加強(qiáng)小分子非編碼RNA介紹的必要性

喬梁+劉彥禮

摘要：隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的小分子非編碼RNA（Small non-coding RNA，sncRNA）被人們發(fā)現(xiàn)，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生物體內(nèi)一種新的調(diào)控模式。目前，microRNA（miRNA）、small interferi ng RNA（siRNA）和PIWl-interacti ng RNA（piRNA）是sncRNA中研究最為透徹的三個(gè)成員。筆者在簡述三者的生物合成及作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，建議在《生物化學(xué)》的教學(xué)中增加sncRNA知識(shí)的介紹。

關(guān)鍵詞：小分子非編碼RNA；生物化學(xué)，教學(xué)

自從1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)首個(gè)非編碼RNA分子一lin-4并證明其調(diào)控功能后，開啟了研究基因組內(nèi)“暗物質(zhì)”的新時(shí)代。小分子非編碼RNA（sncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的小RNA分子，長度小于200個(gè)核苷酸（Nucleotide，nt），通常約20-30 nt。近年的研究發(fā)現(xiàn)，sncRNA具有重要的調(diào)控功能，參與了生物體的各種活動(dòng)，如生長發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖分化和凋亡，以及多種疾病的發(fā)生等。經(jīng)過數(shù)年的探索，miRNA、siRNA和piRNA的功能和分子機(jī)制已被深入研究。除此之外，其他類型的sncRNA正逐漸為人所知（表1）。這些發(fā)現(xiàn)提示我們生物體內(nèi)可能存在著一種全新的調(diào)控模式，將有助于我們深入了解生物體復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

目前，sncRNA研究已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的熱門領(lǐng)域，并獲得了2006年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，但是在傳統(tǒng)《生物化學(xué)》課程的教學(xué)中嚴(yán)重缺乏sncRNA知識(shí)的介紹。在此，筆者簡要闡述sncRNA中研究深入的miRNA、siRNA和piRNA，從生物合成和作用機(jī)制入手，加強(qiáng)sncRNA知識(shí)的介紹，期望能夠?yàn)椤渡锘瘜W(xué)》課程的教學(xué)提供參考。

一、miRNA的生物合成和作用機(jī)制

miRNA是一類長約20-24 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它可以通過mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因。目前，人類有接近1/3的基因受到miRNA的調(diào)控。進(jìn)一步研究表明，同一個(gè)miRNA存在眾多的靶基因，而同一個(gè)靶基因經(jīng)常受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)控，miRNA及其靶基因構(gòu)建了生物體內(nèi)全方位多層次的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生原始的miRNA轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA），pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)RNA內(nèi)切酶Ⅲ一Drosha加工，得到miRNA前體（pre-miRNA）。然后被Exportin-5蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，再經(jīng)RNA內(nèi)切酶Ⅲ一Dicer進(jìn)一步加工得到約22個(gè)核苷酸的成熟雙鏈RNA分子（miRNA：miRNA*），其中一條成熟鏈（miRNA）插入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencingcomplex，RISC）中形成miRISC行使功能，而另外一條鏈（miRNA*）會(huì)被快速降解。

miRNA通過兩種不同的機(jī)制下調(diào)靶基因的表達(dá)：mRNA剪切和翻譯抑制。miRNA作用靶基因的3非翻譯區(qū)（3UTR）內(nèi)調(diào)控位點(diǎn)，以完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)的形式結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解或抑制蛋白翻譯，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)合成缺失或減少，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與生物體內(nèi)某些生理及病理過程。絕大多數(shù)的植物miRNA與其靶基因幾乎完全互補(bǔ)，并且互補(bǔ)位點(diǎn)散布于整個(gè)mRNA而非局限于3UTR區(qū)，引發(fā)靶基因mRNA的降解。而絕大多數(shù)的動(dòng)物miRNA與其靶基因互補(bǔ)程度較低，通過抑制翻譯的方式調(diào)控靶基因表達(dá)。

二、siRNA的生物合成和作用機(jī)制

siRNA是一類長約21bP（Base pair，bP）的小分子非編碼雙鏈RNA，同樣由Dicer切割完全互補(bǔ)的雙鏈RNA復(fù)合物產(chǎn)生，廣泛存在于真核生物中。早期（1999）發(fā)現(xiàn)外源導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的雙鏈小RNA分子（dsRNA）形成siRNA，通過RNAi途徑導(dǎo)致基因沉默，但是直到最近（2008）才在果蠅和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源siRNA（Endogenous siRNA，endo-siRNA）?，F(xiàn)今，由外源性合成的siRNA引發(fā)RNAi導(dǎo)致目的基因沉默，已成為基因功能研究不可或缺的方法，而且在疾病治療中具有重要的意義。

外源性導(dǎo)入、病毒激活、轉(zhuǎn)座子侵入及特異重復(fù)序列等因素均可誘導(dǎo)dsRNA產(chǎn)生，dsRNA轉(zhuǎn)錄后被Dicer剪切生成21-22 nt、3末端2 nt突出的RNA二聚體。在RISC形成過程中，siRNA二聚體會(huì)解聚形成兩條單鏈siRNA，均可有效參與RISC的形成。同miRNA作用機(jī)制相同，siRNA可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因mRNA結(jié)合（結(jié)合位點(diǎn)一般都位于mRNA的中間部位），導(dǎo)致靶基因mRNA的裂解或降解。

endo-siRNA廣泛分布于真核生物中，成簇分布于生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)座子、假基因、基因內(nèi)含子、外顯子以及間隔區(qū)等。endo-siRNA是由基因組中的重復(fù)序列（轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子元件等）編碼，其主要功能有：第一，介導(dǎo)移動(dòng)元件的基因沉默，導(dǎo)致靶基因的甲基化或靶基因mRNA的降解：第二，介導(dǎo)DNA的異染色質(zhì)化；第三，調(diào)控基因組的重排。目前，雖然在endo-siRNA的主要特點(diǎn)及生物學(xué)功能上取得了一定的研究進(jìn)展，仍有許多問題需要深入研究。

三、piRNA的生物合成和作用機(jī)制

piRNA是2006年發(fā)現(xiàn)的一類與生殖細(xì)胞特異性PIWI家族蛋白相互作用，長約26-30 nt的小分子非編碼RNA。PIWI蛋白為piRNA生物發(fā)生和功能形式所必須，piRNA對(duì)生殖細(xì)胞干性的維持、配子形成、胚胎發(fā)育等多種生殖相關(guān)事件至關(guān)重要。

piRNA來源于基因組中的piRNA簇或轉(zhuǎn)座子區(qū)域，有長的單鏈轉(zhuǎn)錄本切割產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，piRNA生成有兩條途徑：初級(jí)生成途徑和次級(jí)生成途徑。與miRNA和siRNA不同的是，piRNA形成途徑都不需要Dicer的參與。在初級(jí)途徑中，長的單鏈轉(zhuǎn)錄本被某種核酸內(nèi)切酶剪切形成5端帶有尿嘧啶的初級(jí)piRNA，隨后，初級(jí)piRNA完成3端的2氧甲基化修飾。研究推測果蠅中PIWI、Aub和Ag03蛋白可能就是這種核酸內(nèi)切酶。

基于對(duì)果蠅和哺乳動(dòng)物piRNA的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，乒乓模型（Ping-pang model）被用來解釋piRNA從轉(zhuǎn)錄前體物中循環(huán)增生。首先，初級(jí)piRNA互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被PIWI蛋白識(shí)別并激活PIWI的內(nèi)切酶活性，初級(jí)piRNA被切割形成一條新的piRNA（次級(jí)piRNA）。其次，次級(jí)piRNA3端的腺嘌呤與初級(jí)piRNA 5端的尿嘧啶互補(bǔ)。同樣，次級(jí)piRNA也可通過識(shí)別和切割互補(bǔ)的RNA序列，產(chǎn)生新的piRNA，即次級(jí)生成的乒乓擴(kuò)增途徑。

piRNA的作用機(jī)制與miRNA和siRNA不同，miRNA和siRNA主要通過Ago亞家族蛋白相互作用，而piRNA則是通過與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄階段的基因沉默作用，可能取決于piRNA與靶基因mRNA的配對(duì)程度及參與調(diào)控的其他蛋白質(zhì)因子等。

四、總結(jié)

miRNA、siRNA與piRNA的共性是它們都通過一種序列特異的方式指導(dǎo)效應(yīng)蛋白結(jié)合到基因組位點(diǎn)或靶基因RNA上。同樣也存在著區(qū)別：第一，發(fā)生的生物途徑。miRNA是由具有“發(fā)夾”二級(jí)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA經(jīng)Drosha和Dicer剪切加工形成。siRNA來源與長的dsRNA前體，經(jīng)Dicer剪切形成。piRNA的生成途徑依賴PIWI蛋白，不需要Dicer的參與。第二，功能機(jī)制。miRNA是在轉(zhuǎn)錄后水平降解或抑制蛋白翻譯從而調(diào)控基因表達(dá)。siRNA主要功能是裝載至Ago蛋白介導(dǎo)蛋白編碼基因及轉(zhuǎn)座子等沉默。piRNA主要功能是介導(dǎo)生殖細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座子的沉默、生殖細(xì)胞的發(fā)育及完整等，通過表觀遺傳調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后水平等發(fā)揮基因沉默作用。第三，分布特點(diǎn)。miRNA成簇分布在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中。endo-siRNA分布在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中，成簇的分布在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)座子、假基因、基因內(nèi)含子、外顯子以及間隔區(qū)等。piRNA主要分布在生殖細(xì)胞中，并主要成簇的分布在基因間隔區(qū)。

sncRNA在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用拓展和豐富了以往人們對(duì)小分子RNA的認(rèn)識(shí)。最新的高通量測序技術(shù)，將會(huì)使人們對(duì)真核生物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解提高到一個(gè)新的水平。對(duì)sncRNA不斷深入的研究，不僅在理論上豐富了我們對(duì)基因調(diào)控的認(rèn)識(shí)，而且在實(shí)際應(yīng)用中可以使sncRNA成為疾病診斷的新生物學(xué)標(biāo)記和藥物靶標(biāo)，最終為疾病治療提供新的策略和思路。因此，在《生物化學(xué)》的教學(xué)中增加sncRNA相關(guān)的知識(shí)介紹顯得尤為重要。我們可以從生物合成和作用機(jī)制等方面加強(qiáng)教學(xué)，有利于開拓學(xué)生的視野、培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和科學(xué)素養(yǎng)，從而為培養(yǎng)高素質(zhì)的醫(yī)學(xué)創(chuàng)新型人才做出積極的貢獻(xiàn)。