SSR分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用

劉奇燕

摘要 概述了SSR分子標(biāo)記原理和特點(diǎn)，闡述了SSR分子標(biāo)記鑒定雜交水稻種子純度技術(shù)要點(diǎn)，對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期為該技術(shù)在種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 SSR分子標(biāo)記；種子；純度檢測(cè)；應(yīng)用

中圖分類號(hào) S339.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）13-0049-01

Abstract This paper summarized principle and characteristics of SSR molecular marker，introduced technical points of hybrid rice seed purity identification by SSR molecular marker，and its application prospect was prospected，in order to provide reference for application of seed purity test.

Key words SSR molecular marker；seed；purity test；application

種子純度是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的主要指標(biāo)。在雜交水稻生產(chǎn)中，由于忽視種子真實(shí)性和品種純度檢驗(yàn)，偽劣摻假種子傷農(nóng)事件時(shí)有發(fā)生，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了不可彌補(bǔ)的損失。因此，對(duì)雜交種子純度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、有效的鑒定顯得十分重要。

SSR標(biāo)記由于具有重復(fù)性好、遺傳上呈共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、引物序列易交流、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已成為雜交水稻種子純度鑒定的一種理想分子標(biāo)記方法。

1 SSR分子標(biāo)記原理

SSR即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，不同水稻品種基因組DNA中，存在著能夠穩(wěn)定遺傳的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）重復(fù)次數(shù)的差異，這種差異可以通過(guò)從水稻種子、幼苗等組織中提取DNA，用SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)電泳獲得DNA指紋圖譜加以區(qū)別。利用這一原理，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了水稻品種真實(shí)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，即《水稻品種鑒定——指紋分析方法》（2007年），利用該原理和SSR標(biāo)記技術(shù)，在分子水平上鑒定品種純度也成為必然的發(fā)展趨勢(shì)[1-3]。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)用于雜交水稻種子純度鑒定，是基于F1雜交種子（父母本雜交后代）具有父母本共同的遺傳基礎(chǔ)，而父母本之間又在特定的SSR位點(diǎn)存在多態(tài)性，通過(guò)篩選引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳后觀察不同DNA譜帶類型，F(xiàn)1具有雙親互補(bǔ)的帶型，很容易將雜交組合與其親本及其他混雜種子分辨開(kāi)來(lái)（圖1）。

2 SSR分子標(biāo)記鑒定雜交水稻種子純度技術(shù)要點(diǎn)

2.1 DNA提取

多數(shù)研究者以新鮮葉片或發(fā)芽幼苗為材料來(lái)提取樣品中DNA，提取的DNA質(zhì)量應(yīng)符合PCR擴(kuò)增的要求，常見(jiàn)的DNA提取方法主要有以下幾種：CTAB提取法、SDS提取法、磁珠提取法、堿煮法。CTAB提取法：DNA質(zhì)量高、得率高，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，成本低，但程序復(fù)雜；SDS提取法：DNA質(zhì)量高，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，程序較復(fù)雜；磁珠提取法：DNA質(zhì)量高、得率較低，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，程序較簡(jiǎn)單；堿煮法：質(zhì)量較低，存儲(chǔ)時(shí)間短、程序簡(jiǎn)單，成本極低[4-6]。

2.2 PCR擴(kuò)增

2.2.1 引物篩選。引物篩選原則：一是雜合率高、具有雙親共顯性；二是多態(tài)性高、區(qū)分異品種能力強(qiáng)；三是綜合考慮多重電泳組合潛力、堿基基序重復(fù)、擴(kuò)增效果好（特異性擴(kuò)增強(qiáng)、非特異性擴(kuò)增少、引物擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好）。

2.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。通常PCR擴(kuò)增在10 μL反應(yīng)體積下進(jìn)行，包含DNA聚合酶0.2 U、SSR標(biāo)記引物1 μmol、模板DNA 2～10 ng、dNTP 1 μmol、10倍PCR反應(yīng)液（含MgCl2）1 μL，其中選用的引物為在父母本間具有差異性的引物。

2.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序。94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s（不同引物退火溫度有別），72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存，經(jīng)過(guò)32個(gè)循環(huán)后，單個(gè)SSR位點(diǎn)特定片段可得到幾百萬(wàn)倍的擴(kuò)增，從而可在凝膠上顯現(xiàn)出來(lái)。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

目前，應(yīng)用于SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的方法主要有溫度掃描凝膠電泳、DNA測(cè)序、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、普通瓊脂糖凝膠電泳、phor瓊脂糖凝膠電泳等[7-9]。

2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)

檢測(cè)純度的幾對(duì)引物分別讀出結(jié)果，標(biāo)出含有父本多少粒、母本多少粒、雜株多少粒，再用總的供檢粒數(shù)減去異品種粒數(shù)，再除以總的供檢粒數(shù)，得出的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，推薦使用其中最小值作為純度鑒定的結(jié)果[10-14]。圖2為水稻雜交種兩優(yōu)培九100粒種子用一個(gè)SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增后瓊脂糖電泳檢測(cè)的圖譜。100粒種子中含3粒母本、4粒父本，因而該水稻種子純度為（100-3-4）/100=93%。

3 應(yīng)用前景

經(jīng)多家科研單位、多位學(xué)者的努力，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已小范圍應(yīng)用于種子純度檢測(cè)實(shí)踐[15-17]。隨著SSR分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展成熟，其應(yīng)用于雜交水稻種子純度檢測(cè)的實(shí)踐將展示出更廣闊的前景[18-21]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 彭鎖堂，莊杰云，顏啟傳，等.我國(guó)主要雜交水稻組合及其親本SSR標(biāo)記和純度鑒定[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2003，17（1）：1-5.

[2] 方宣鈞，劉思衡，江樹(shù)業(yè).品種純度和真?zhèn)蔚腄NA分子標(biāo)記鑒定及其應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2000，8（2）：106-110.

[3] 劉之熙，陳祖武，朱克永，等.利用SSR分子標(biāo)記快速鑒定雜交水稻種子純度技術(shù)體系的優(yōu)化[J].雜交水稻，2008，23（1）：60-63.

[4] 束愛(ài)萍，劉增兵，余麗琴，等.水稻SSR標(biāo)記的遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（5）：778-783.

[5] 閆雙勇，蘇京平，王勝軍，等.一種同時(shí)適用于水稻種子和葉片的簡(jiǎn)單快速DNA提取方法[J].中國(guó)稻米，2011，17（5）：11-13.

[6] 趙國(guó)珍，賈育林，嚴(yán)宗卜，等.一種高效便捷的水稻DNA提取法及其應(yīng)用[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2012，26（4）：495-499.

[7] 黎裕，王建康，邱麗娟，等.中國(guó)作物分子育種現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J].作物學(xué)報(bào)，2010，36（9）：1425-1430.

[8] 蔣曉英，楊春文，林清，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻和雜交玉米種子質(zhì)量鑒定中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（21）：41-46.

[9] 詹慶才.利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行雜交水稻種子純度鑒定的研究[J].雜交水稻，2002，17（5）：46-50.

[10] 周會(huì)，蘇秀，毛雙林，等.雜交水稻品種真實(shí)性和純度的SSR分子標(biāo)記鑒定[J].種子世界，2014（3）：34-35.

[11] 孫立娜，王璐.分子標(biāo)記及其在玉米研究中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（19）：8044-8046.

[12] 黃成志，黃文章，嚴(yán)明建，等.利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜交水稻真?zhèn)闻c純度[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：3437-3438.

[13] 譚智丹，余顯權(quán)，高健強(qiáng)，等.利用SSR鑒定雜交水稻種子純度的研究[J].種子，2006（4）：27-29.

[14] 辛業(yè)蕓，張展，熊易平，等.應(yīng)用SSR分子標(biāo)記鑒定超級(jí)雜交水稻組合及其純度[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2005，25（2）：27-29.

[15] 王鳳格，趙久然，王璐，等.適于玉米雜交種純度鑒定的SSR核心引物的確定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007（6）：964-969.

[16] 殷兆晴，王玉平，周黎軍，等.雜交稻種子純度的SSR分子檢測(cè)及應(yīng)用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15（6）：964-969.

[17] 胡侃，何德銀，王悅，等.基于SSR分子標(biāo)記的三組水稻品種真實(shí)性鑒定分析[J].氨基酸和生物資源，2014（4）：44-46.

[18] 任輝.SSR分子標(biāo)記在雜交水稻品種純度鑒定中的應(yīng)用研究[D].臨安：浙江農(nóng)林大學(xué)，2013.

[19] 戴劍，洪德林.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻品種鑒定中的應(yīng)用[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（1）：45-51.

[20] 趙虹，徐國(guó)華，廖芳麗.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的作用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（17）：3490-3491.

[21] 李召華，朱克永，陳祖武，等.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].雜交水稻，2006（4）：11-14.