人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化及其意義

張緒美，徐政秀，張燕，陳敏，李曉蕾，王丹

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261041；2日照市五蓮縣中醫(yī)醫(yī)院)

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人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化及其意義

張緒美1，徐政秀2，張燕1，陳敏1，李曉蕾1，王丹1

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261041；2日照市五蓮縣中醫(yī)醫(yī)院)

目的 觀察人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化，并探討其意義。方法 采用免疫組化SP二步法檢測55例份腦膠質(zhì)瘤組織和20例份正常腦組織中的Gab2、IgG、Integrinβ6。分析腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6表達的相關(guān)性，及Gab2、IgG、Integrinβ6表達與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 腦膠質(zhì)瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為38(69.0%)、29(52.7%)、45(81.8%)例，正常腦組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為1(5.0%)、1(5.0%)、0例，腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達率均高于正常腦組織(P均<0.05)。腦膠質(zhì)瘤組織中IgG與Gab2表達呈正相關(guān)(r=0.312 4，P<0.05﹚，IgG與Integrinβ6表達呈正相關(guān)(r=0.398 8，P<0.05﹚。腦膠質(zhì)瘤未完整切除者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于腫瘤完整切除者，腫瘤直徑>5 cm者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于直徑≤5 cm者，腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于Ⅰ～Ⅱ級者(P均<0.05)。結(jié)論 人腦膠質(zhì)瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6呈高表達，并與腫瘤直徑、腫瘤完整切除情況和腫瘤分級有關(guān)。IgG、Gab2、Integrinβ6可能協(xié)同參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

腦膠質(zhì)瘤；Gab2蛋白；免疫球蛋白G；整合素β6

腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%，預(yù)后差。隨著研究的深入，支架蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用漸漸引起學(xué)界關(guān)注。支架蛋白在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究的熱點。Gabs家族蛋白是一類支架蛋白，是細(xì)胞信號系統(tǒng)的集合平臺[1]。Gabs蛋白包括Gab1～4多個家族成員，其中Gab2調(diào)控細(xì)胞生長增殖、分化、凋亡、侵襲等生命過程，具有潛在的原癌基因特性，在人卵巢癌、肺癌、乳腺癌組織中高表達，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[2～4]。免疫球蛋白G(IgG)是免疫球蛋白的一種，腫瘤源性IgG能夠促進腫瘤細(xì)胞的生長[5]。整合素表達于惡性上皮性腫瘤組織[6]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著非常密切的關(guān)系。Integrinβ6是整合素家族分子之一。本研究觀察了人腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6的表達變化，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、濰坊市人民醫(yī)院2011年1月～2013年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本55例份。腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本來源患者男30例，女25例；年齡11～74歲，中位年齡44歲；按WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ級(低級別)25例，Ⅲ～Ⅳ級(高級別)30例。所有標(biāo)本均用甲醛固定，石蠟包埋，做厚4 μm切片。另取20例正常腦組織(腦外傷患者減壓術(shù)中取得)作為對照，標(biāo)本來源患者男14例、女6例，年齡20～64歲(中位年齡46歲)。腦膠質(zhì)瘤組與對照組患者的年齡、性別資料具有可比性。

1.2 試劑與材料 Gab2多克隆抗體購自Santa Cruz公司。IgG多克隆抗體購自Sigma公司。Integrinβ6抗體由濰坊醫(yī)學(xué)院李文通博士提供。SP試劑盒、DAB試劑盒、AEC試劑盒均購自福州邁新生物公司，抗體均為工作液。

1.3 Gab2、IgG、Integrinβ6檢測方法 采用免疫組化SP二步法檢測腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的Gab2、IgG、Integrinβ6。將石蠟標(biāo)本做5 μm厚切片，常規(guī)脫蠟入水，熱抗原修復(fù)，免疫組化SP法染色，Gab2、Integrinβ6兩種抗體DAB鏡下控制顯色，IgG抗體AEC鏡下控制顯色。以PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒為IgG陽性，以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Gab2陽性，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Integrinβ6陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強度進行結(jié)果判定：陽性細(xì)胞百分比<5%計0分，5%～<25%計1分，25%～<50%計2分，≥50%計3分；細(xì)胞無著色計0分，淺棕黃色(淡紅色)計1分，棕黃色(紅色)計2分，棕褐色(深紅色)計3分；兩項得分相加，0～1分為蛋白表達陰性，≥2分為蛋白表達陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS9.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6表達變化及其相關(guān)性 腦膠質(zhì)瘤組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為38(69.0%)、29(52.7%)、45(81.8%)例，正常腦組織中IgG、Gab2、Integrinβ6表達陽性分別為1(5.0%)、1(5.0%)、0例，腦膠質(zhì)瘤組織中Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達率均高于正常腦組織(P均<0.05)。腦膠質(zhì)瘤組織中IgG與Gab2表達呈正相關(guān)(r=0.312 4，P<0.05﹚，IgG與Integrinβ6表達呈正相關(guān)(r=0.398 8，P<0.05﹚。

2.2 Gab2、IgG、Integrinβ6表達與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤未完整切除者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于腫瘤完整切除者，腫瘤直徑>5 cm者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于直徑≤5 cm者，腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級者Gab2、IgG、Integrinβ6陽性表達比例高于Ⅰ～Ⅱ級者(P均<0.05)。詳見表1。

3 討論

彌漫浸潤性生長是腦膠質(zhì)瘤的顯著特征，手術(shù)難以切除或根本無法手術(shù)。膠質(zhì)瘤的浸潤和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，研究膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制，尋找有效的治療靶點是膠質(zhì)瘤治療中迫切需要解決的問題。

近年來，支架蛋白的結(jié)構(gòu)及功能成為人們關(guān)注的熱點。支架蛋白是底物分子，它們能與酪氨酸激酶結(jié)合，發(fā)揮聯(lián)系各種細(xì)胞內(nèi)外信號蛋白之間交互調(diào)控的功能，并可以放大信號的傳導(dǎo)，含有多個結(jié)構(gòu)域和錨定位點[1]。作為一類支架蛋白，Gab2是Gabs家族中的重要成員。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Gab2具有潛在的原癌基因特性，常在人類乳腺癌、卵巢癌、肺癌中高表達，并且其表達與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。多項研究表明，Gab2調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生長增殖、侵襲遷移等過程。對肺癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，Gab2可促進人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的侵襲能力[8]。但是到目前為止，Gab2在腦膠質(zhì)瘤中的表達及作用機制罕見報道。

表1 Gab2、IgG、Integrinβ6表達與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

孫磊等[9]報道應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)降低Gab2表達使膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN-229侵襲轉(zhuǎn)移能力降低，說明Gab2與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。另有研究[10]報道，腫瘤抑制因子miRNA-302a可通過抑制Gab2在膠質(zhì)瘤中的表達，降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和入侵能力。本研究結(jié)果顯示，Gab2在正常腦組織中低表達，而在膠質(zhì)瘤組織中高表達，并且隨著臨床分級增高、腫瘤直徑增大其表達也增高，與文獻報道一致，說明Gab2的表達與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病、惡性進展有關(guān)，Gab2有望作為預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)，并可能成為一個抗膠質(zhì)瘤治療的新靶點。IgG是免疫球蛋白的一種。腫瘤細(xì)胞分泌的IgG是一種新發(fā)現(xiàn)的分子，主要來源于上皮源性腫瘤細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、局部侵入和患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Chen等[11]證實上皮來源的腫瘤細(xì)胞分泌的IgG能夠促進腫瘤細(xì)胞的生長和生存。在結(jié)直腸癌組織中，IgG的表達與腫瘤的惡性程度(包括分化程度、Dukes分期)具有顯著相關(guān)性，即結(jié)直腸癌分化程度越差、Dukes分期越高，IgG表達量越高[12]。最近，Lv等[13]發(fā)現(xiàn)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞中IgG表達，并且IgG表達越高，腫瘤細(xì)胞之間的黏附性越低，其浸潤侵襲能力越強。本研究中我們觀察到，IgG在正常腦組織中低表達，在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達，且隨著腦膠質(zhì)瘤惡性度的增加，IgG表達水平逐漸升高，提示IgG異常高表達可促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性增殖[14]。另外，Xu等[15]在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IgG對腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移和入侵具有增強作用；通過小干擾RNA技術(shù)抑制前列腺癌細(xì)胞中IgG的表達后，細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA表達降低，凋亡標(biāo)志物Caspase-3表達增高，認(rèn)為IgG是前列腺癌治療的潛在靶點。

整合素家族是細(xì)胞表面的黏附分子，常表達于腫瘤細(xì)胞表面，通過介導(dǎo)細(xì)胞之間及細(xì)胞與外界之間的信號傳導(dǎo)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。趙艷霞等[16]報道整合素家族成員α6可能與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性增殖和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。近年來，以Integrinβ6為靶點的靶向治療為結(jié)腸癌的臨床治療提供了新的方向[17]。研究[18]證實，通過小干擾RNA技術(shù)抑制Integrinβ6基因表達后，可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，Integrinβ6在正常腦組織中不表達，而在膠質(zhì)瘤組織中高表達，隨著腦膠質(zhì)瘤分級升高、腫瘤直徑增大、腫瘤切除難度增大，其表達也升高，這提示Integrinβ6表達與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切，檢測Integrinβ6可能對評估膠質(zhì)瘤患者預(yù)后具有一定價值，Integrinβ6也有望成為腦膠質(zhì)瘤新的治療靶點。

本研究結(jié)果還顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中IgG表達與Gab2、Integrinβ6表達均呈正相關(guān)，提示三者之間存在一定相互作用，共同參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，其作用機制有待于進一步探討。對這一現(xiàn)象繼續(xù)深入研究，有望為腦膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后評估及靶向治療提供新的思路。

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山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2015ws0054)；濰坊市衛(wèi)生局科研項目計劃(2014011)；濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年創(chuàng)新基金(K12QC1002)。

張緒美(E-mail：zhang2005033@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.018

R739.41

B

1002-266X(2017)27-0061-03

2017-03-24)