側(cè)腦室注射微量GnIH大鼠的血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織POMC蛋白表達(dá)觀察

司麗娜，吳迪，蘇瑋，魏萌，楊旭慶，陳磊，楊松鶴，程露陽(yáng)，喬躍兵，4

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；3陸軍總醫(yī)院263臨床部；4滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

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側(cè)腦室注射微量GnIH大鼠的血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織POMC蛋白表達(dá)觀察

司麗娜1，吳迪2，蘇瑋3，魏萌1，楊旭慶1，陳磊1，楊松鶴1，程露陽(yáng)1，喬躍兵1，4

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；3陸軍總醫(yī)院263臨床部；4滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

目的 觀察側(cè)腦室微量注射促性腺激素抑制激素(GnIH)后雄性大鼠血漿促性腺激素釋放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)水平變化，及下丘腦組織中阿片促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(POMC)蛋白的表達(dá)變化。方法 雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各30只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，實(shí)驗(yàn)組于大鼠側(cè)腦室一次性注射GnIH 5 μL，于5 min內(nèi)注射完畢，留針10 min。對(duì)照組給予等量生理鹽水。兩組分別于注射后60、120、240 min各取10只大鼠心房取血，采用ELISA法檢測(cè)血漿GnRH、FSH；心房取血后斷頭處死大鼠，取下丘腦組織，采用Western blotting法檢測(cè)下丘腦組織中的POMC蛋白。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組注射后60、120、240 min血漿GnRH、FSH水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)注射后不同時(shí)點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組注射后60、120、240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組注射后240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量低于注射后60、120 min(P均<0.05)。結(jié)論 側(cè)腦室微量注射GnIH后雄性大鼠血漿GnRH、FSH水平降低，下丘腦組織中POMC蛋白表達(dá)下調(diào)。GnIH對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸有一定調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與抑制POMC神經(jīng)元功能有關(guān)。

促性腺激素抑制激素；促性腺激素釋放激素；卵泡刺激素；阿片促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原；下丘腦-垂體-性腺軸

哺乳動(dòng)物的生殖功能主要依賴于下丘腦、垂體和性腺通過(guò)自分泌和旁分泌方式所分泌的各種激素進(jìn)行調(diào)控，此神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)體系即為下丘腦-垂體-性腺軸。下丘腦以脈沖方式合成并分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)。GnRH在生殖內(nèi)分泌的調(diào)控中起到核心作用，其可以興奮或抑制下丘腦及其他一些神經(jīng)元產(chǎn)生效應(yīng)。很多學(xué)者認(rèn)為下丘腦分泌GnRH是生殖功能調(diào)控的惟一途徑，而促性腺激素抑制激素(GnIH)的發(fā)現(xiàn)改變了人們對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌生殖軸的認(rèn)識(shí)。GnIH是一種由日本鵪鶉腦中分離純化的新型神經(jīng)肽[1]，GnIH可通過(guò)其受體G蛋白耦聯(lián)受體147(GPR147)作用于垂體和下丘腦的GnRH神經(jīng)元，抑制促性腺激素釋放和合成[2]，但具體作用機(jī)制還沒(méi)有明確報(bào)道。雖然在GnRH神經(jīng)元上有GnIH受體表達(dá)，但鑒于GnIH的多效性，不排除它可以通過(guò)投射到其他神經(jīng)元而間接影響GnRH分泌。阿片促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(POMC)是一種很強(qiáng)的抑制食欲因子，在調(diào)節(jié)攝食能量平衡和生殖方面發(fā)揮重要作用。但是POMC神經(jīng)元是如何調(diào)節(jié)生殖功能的，是直接還是間接作用于GnRH神經(jīng)元，說(shuō)法不一。有研究觀察到POMC神經(jīng)元與GnIH神經(jīng)元之間存在突觸聯(lián)系，而有學(xué)者則否認(rèn)這種聯(lián)系的存在。因此，本研究觀察了側(cè)腦室微量注射GnIH后雄性大鼠血漿GnRH、FSH水平變化，及下丘腦組織中POMC蛋白表達(dá)變化，以此探討GnIH對(duì)HPG軸的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 健康成年雄性SD大鼠60只購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司(合格證號(hào)11401300016009)，體質(zhì)量220～250 g，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫維持25 ℃左右，通風(fēng)良好，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)兩周后用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各30只。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，大鼠的腦立體定位儀購(gòu)自日本Narishige公司，大鼠ELISA試劑盒(GnRH、FSH)購(gòu)自上海酶連生物有限公司，蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，GnIH購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，POMC與GAPDH均購(gòu)自Bioworld公司，二抗(山羊抗兔IgG)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 GnIH給藥方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，實(shí)驗(yàn)組于大鼠側(cè)腦室一次性注射GnIH 5 μL，于5 min內(nèi)注射完畢，留針10 min。對(duì)照組給予等量生理鹽水。

1.3 血漿GnRH、FSH檢測(cè) 在麻醉狀態(tài)下，兩組大鼠分別于側(cè)腦室注射后60、120、240 min各取10只大鼠開(kāi)胸，快速自右心房采集靜脈血，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min后取其上清液，-80 ℃儲(chǔ)存。采用ELISA法檢測(cè)血漿GnRH、FSH。

1.4 下丘腦組織中POMC蛋白檢測(cè) 在麻醉狀態(tài)下，兩組大鼠分別于側(cè)腦室注射后60、120、240 min各取10只大鼠，心房采血后立即斷頭處死，取下丘腦組織，用PBS清洗，稱重。將下丘腦組織放入勻漿器并加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)，勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白含量，調(diào)整電泳上樣量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，加入一抗[兔抗POMC(1∶500)，兔抗CAPDH(1∶8 000)]4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3次后加入二抗[羊抗兔IgG(1∶4 000)]孵育2 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯色。掃描圖像后采用Image J軟件分析蛋白條帶的平均灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比代表POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組注射后60、120、240 min血漿GnRH、FSH水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)注射后不同時(shí)點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組注射后60、120、240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組注射后240 min下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量低于注射后60、120 min(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

3 討論

GnIH及其同系肽(RFRP)分布于哺乳動(dòng)物[3]、鳥(niǎo)類[4]、兩棲動(dòng)物[5]和魚(yú)類[6]中。哺乳動(dòng)物的GnIH神經(jīng)元主要存在于下丘腦的室周核、背內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核與下丘腦腹內(nèi)側(cè)核中間的區(qū)域[3]。同時(shí)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物的垂體、間腦、端腦、視頂蓋等組織都能表達(dá)GnIH的內(nèi)源受體GPR147。有研究[7]顯示GPR147在垂體的促黃體激素(LH)、促卵泡素(FSH)細(xì)胞中都有表達(dá)。哺乳動(dòng)物的GnRH1神經(jīng)元上也有GnIH受體的表達(dá)[3]，證明GnIH可能通過(guò)GnRH1神經(jīng)元來(lái)抑制生殖功能。有學(xué)者認(rèn)為GnIH通過(guò)抑制GnRH神經(jīng)元進(jìn)而抑制促黃體激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成與釋放[8]。GnIH及其受體可以在垂體水平抑制促性腺激素的合成與釋放[9]。此外，GnIH在性腺中也有表達(dá)[10,11]，這表明GnIH不僅能抑制促性腺激素的釋放，還可能通過(guò)某種方式調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育。GnIH神經(jīng)纖維可以投射到NPY神經(jīng)元、POMC神經(jīng)元、MCH神經(jīng)元，這些神經(jīng)元在控制攝食方面發(fā)揮著重要作用[12]。因此，GnIH可能通過(guò)與這些神經(jīng)元相互作用，從而調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)。

表1 藥物注射后不同時(shí)點(diǎn)兩組大鼠血漿GnRH、FSH水平及下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注: 與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組相比，*P<0.05。

POMC神經(jīng)元廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物及所有脊椎動(dòng)物的下丘腦中，是調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)的重要神經(jīng)元[13]。POMC是在垂體、下丘腦弓狀核表達(dá)的一種含有267個(gè)氨基酸序列的神經(jīng)肽，是腦內(nèi)多種激素的前體，具有調(diào)節(jié)能量平衡和抑制食欲的重要作用[14]。有學(xué)者[15]在大鼠胚胎第12天的下丘腦中就發(fā)現(xiàn)POMC的表達(dá)，證實(shí)POMC神經(jīng)元在下丘腦能量平衡調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究[16]發(fā)現(xiàn)GnIH能降低小鼠腦中POMC細(xì)胞的電生理功能，而POMC及其受體表達(dá)可提高GnRH神經(jīng)元的活性[17]。由此推測(cè)，GnIH通過(guò)其受體可作用于GnRH神經(jīng)元，可通過(guò)其神經(jīng)纖維投射至POMC神經(jīng)元，還可能通過(guò)POMC神經(jīng)元間接作用于GnRH，進(jìn)而影響生殖功能。

GnIH是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要參與者，前期研究已證實(shí)GnIH受體存在GnRH神經(jīng)元上，GnIH可直接作用于GnRH神經(jīng)元發(fā)揮對(duì)生殖系統(tǒng)的抑制作用。但GnIH的多效性暗示其不只限于這一種作用途徑，它能進(jìn)一步投射到腦部其他區(qū)域，與該區(qū)域的神經(jīng)元相聯(lián)系并發(fā)揮作用[18]。由此，POMC神經(jīng)元可能作為GnIH調(diào)節(jié)GnRH的一個(gè)中間神經(jīng)元，影響GnIH神經(jīng)元對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)作用。我們?cè)趥?cè)腦室微量注射GnIH后，觀察雄性大鼠GnRH、FSH水平變化，結(jié)果顯示側(cè)腦室微量注射GnIH后60、120、240 min大鼠血漿GnRH、FSH水平均降低，提示GnIH在一定時(shí)間內(nèi)可抑制GnRH和FSH的分泌，此抑制作用在一定時(shí)間范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴性。GnIH可抑制下丘腦GnRH神經(jīng)元的分泌作用，進(jìn)而抑制垂體FSH的分泌，提示GnIH對(duì)下丘腦-垂體生殖軸有一定的抑制作用。本研究還發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室微量注射GnIH 60、120、240 min后，實(shí)驗(yàn)組下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，且注射240 min后下丘腦組織中POMC蛋白相對(duì)表達(dá)量低于注射后60、120 min，表明GnIH在一定時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)大鼠下丘腦POMC分泌具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，可抑制POMC的分泌。本實(shí)驗(yàn)提示GnIH可能通過(guò)抑制POMC神經(jīng)元抑制下丘腦GnRH的釋放，進(jìn)而抑制垂體促性腺素FSH的釋放，從而發(fā)揮對(duì)下丘腦-垂體生殖軸的調(diào)節(jié)作用。然而，GnIH神經(jīng)元對(duì)POMC神經(jīng)元的調(diào)節(jié)是直接作用還是間接作用，或是綜合作用的結(jié)果，還需要進(jìn)一步研究來(lái)證明。本實(shí)驗(yàn)受河北省高校人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助、河北省高校病原生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目資助。

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河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2013406115)；河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(08276101D-20)；河北省高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(QN2015121)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目(20130021)。

喬躍兵(E-mail:qiaoyuebing@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.009

R-332

A

1002-266X(2017)27-0034-03

2017-03-23)