過表達CUEDC2人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251的構(gòu)建

唐傳喜，劉鑫峰，李風，高殿帥

(徐州醫(yī)科大學，江蘇徐州221004)

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·論著·

過表達CUEDC2人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251的構(gòu)建

唐傳喜，劉鑫峰，李風，高殿帥

(徐州醫(yī)科大學，江蘇徐州221004)

目的 構(gòu)建過表達CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2(CUEDC2)的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞系。方法 PCR擴增CUEDC2基因全長序列，將其連接于GV358載體質(zhì)粒。酶切鑒定GV358-CUEDC后采用慢病毒包裝三質(zhì)粒系統(tǒng)(GV358-CUEDC2、Helper 1.0、Helper 2.0)轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染48、72 h后收集病毒上清并感染U251細胞。將U251細胞分為空白對照組、過表達CUEDC2組、空載體組?？瞻讓φ战M不進行感染操作，過表達CUEDC2組、空載體組分別感染GV358-CUEDC和GV-vector。流式篩選后采用實時熒光定量PCR法檢測U251細胞中的CUEDC2 mRNA，采用Western blotting法檢測CUEDC2蛋白。結(jié)果 GV358-CUEDC酶切結(jié)果顯示在900 bp處有一條明顯條帶，CUEDC2測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對完全一致。流式篩選感染GV358-CUEDC慢病毒的U251細胞，得到陽性率95%以上的U251細胞。U251細胞在感染GV358-CUEDC2及GV-vector病毒后熒光顯微鏡下均可見綠色熒光?？瞻讓φ战M、空載體組、過表達CUEDC2組U251細胞中CUEDC2 mRNA相對表達量分別為5.290±0.663、0.823±0.059、1，CUEDC2蛋白相對表達量分別為0.48±0.020、0.51±0.015、0.92±0.150，過表達CUEDC2組CUEDC2 mRNA及蛋白相對表達量均高于空載體組和空白對照組(P均<0.01)。結(jié)論 成功構(gòu)建了過表達CUEDC2的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞系。

膠質(zhì)瘤；膠質(zhì)母細胞瘤；CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2；慢病毒

膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是一種中樞系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近30年來發(fā)生率逐年遞增[1]。盡管手術(shù)切除及術(shù)后放化療等綜合治療方法不斷更新，該病預(yù)后仍不樂觀。GBM呈浸潤性生長，與周圍組織無明顯分界，手術(shù)很難完全切除[2]。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤干細胞(GSCs)的存在是膠質(zhì)瘤發(fā)病、放化療耐受、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[3]；且JAK1-STAT3通路的過度激活在其中起著重要作用[4]。如何阻滯或減緩膠質(zhì)瘤干細胞生長是當前研究熱點之一。CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2(CUEDC2)是一個包含CUE結(jié)構(gòu)域的功能未知的蛋白質(zhì)，分子量約為32 kDa，由287個氨基酸組成。CUEDC2在人體所有組織器官中均有表達，在大腦、心臟、睪丸中高表達[5]，在多種腫瘤中也有異常表達。在高級別的膠質(zhì)瘤中，尤其是GBM中，CUEDC2表達低于正常腦組織，而關(guān)于CEUDC2在膠質(zhì)瘤及GSCs中的調(diào)節(jié)機制尚未有報道。為此，我們構(gòu)建了過表達CUEDC2基因的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞系，為后續(xù)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 目的基因CUEDC2(870 bp，NM_024040)，載體質(zhì)粒GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin，上海吉凱基因公司)，293T細胞系、U251細胞系(中科院細胞庫)，DH5α感受態(tài)(天根生化公司)。RNA提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(PromeIga公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化公司)，DNA Marker(Fermentas公司、捷瑞公司)，限制性內(nèi)切酶AgeI(NEB公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)，Lipofectmine2000(Invitrogen公司)，NC膜(VICMED生物公司)，蛋白裂解液(南京凱基生物有限公司)，CUEDC2抗體(Proteintech公司)。

1.2 CUEDC2基因擴增 以含有CUEDC2基因的cDNA庫為模板，擴增CUEDC2基因序列。上游引物序列為5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′，下游引物序列為5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。引物有上海吉凱生物合成提供。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min、98 ℃變性10 s、56 ℃退火10 s、72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃保溫8 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離產(chǎn)物，DNA凝膠回收試劑盒回收并純化CUEDC2片段。

1.3 攜帶CUEDC2基因的慢病毒載體GV358-CUEDC的構(gòu)建 使用AgeⅠ對GV358載體進行酶切，使其線性化，對載體酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。GV358載體和CUEDC2基因酶切產(chǎn)物進行連接反應(yīng)，于冰水浴中配制反應(yīng)體系(ddH2O 2.5 μL，5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，酶切后的載體DNA 2.5 μL，純化后的PCR產(chǎn)物片段2 μL，Exnase Ⅱ 1 μL)，于37 ℃反應(yīng)30 min，隨后置于冰水浴中冷卻5 min。

1.4 GV358-CUEDC重組子篩選及鑒定 將10 μL“1.3”中的反應(yīng)產(chǎn)物加入到100 μL感受態(tài)細胞中，冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，冰水浴孵育2 min。加入LB培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。取適量菌液均勻涂布在含有相應(yīng)抗生素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。在超凈工作臺中，用無菌槍頭挑單個菌落至20 μL鑒定體系，置于PCR儀中進行反應(yīng)。反應(yīng)體系包括ddH2O 9.2 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，單個菌落。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。將陽性轉(zhuǎn)化的重組子接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基，搖菌擴增后，取適量菌液測序。

1.5 GV358-CUEDC慢病毒包裝 慢病毒包裝系統(tǒng)包括GV358-CUEDC2、病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper1.0、Helper2.0。慢病毒顆粒的包裝采用脂質(zhì)體介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法進行。轉(zhuǎn)染前24 h用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，調(diào)整細胞密度為5×106/15 mL，重新接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞密度為70%～80%時即可用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h更換為無血清培養(yǎng)基。將GV358-CUEDC載體質(zhì)粒 20 μg、Helper1.0載體質(zhì)粒15 μg、Helper2.0載體質(zhì)粒10 μg的混合液緩慢滴加至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后棄培養(yǎng)基，換成含10%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。之后收集病毒上清，離心去細胞碎片，用0.45 μm濾器過濾，于超速離心管中4 ℃條件下25 000 r/min離心2 h。

1.6 GV358-CUEDC感染U251細胞 將U251細胞培養(yǎng)于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期U251細胞接種于6孔板中，待融合約60%左右進行病毒感染。將U251細胞分為空白對照組、過表達CUEDC2組、空載體組，空白對照組不進行感染操作，過表達CUEDC2組、空載體組分別感染GV358-CUEDC和GV-vector(均攜帶GFP基因)。感染24 h后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞數(shù)量足夠，收集細胞進行流式分選。

1.7 U251細胞中CUEDC2 mRNA及蛋白檢測 采用實時熒光定量RCR法檢測各組細胞中的CUEDC2 mRNA。CUEDC2基因上游引物序列為5′-CTGAGCGATGCCAGGAAC-3′、下游引物序列為5′-CACCGAACAGGTAGGGAACAC-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃10 min，4 ℃保存，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。將篩選后的細胞收集加蛋白裂解液進行總蛋白提取，測定各組蛋白濃度后，配置10%的SDS-PAGE，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗CUEDC2、β-actin，4 ℃過夜，孵育二抗2 h，Odyssey掃描條帶，利用Image J軟件分析條帶灰度值，用CUEDC2灰度值比內(nèi)參actin灰度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 GV358-CUEDC2質(zhì)粒鑒定結(jié)果 成功構(gòu)建GV358-CUEDC2質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示有900 bp處有一條明顯條帶。經(jīng)PCR擴增鑒定，所挑取得菌落全為陽性轉(zhuǎn)化子(見圖1)。對挑取的陽性克隆菌測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對完全一致。

圖1 GV358-CUEDC2質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 慢病毒GV358-CUEDC2包裝制備及感染U251細胞情況 GV358-CUEDC2/GV358-vector、Helper 1.0、Helper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后可見熒光，48 h后細胞內(nèi)綠色熒光表達明顯增強(見圖2)。收集感染48、72 h時的上清液，濃縮病毒后4 ℃暫存，感染目的細胞U251，72 h后收集細胞做流式分選并經(jīng)流式分析，結(jié)果顯示空白對照組感染率為8.8%，感染病毒組感染率為99.8%，可認為流式分選后獲得較純的細胞系。U251細胞在感染GV358-CUEDC2及GV-vector病毒后熒光顯微鏡下均可見綠色熒光(見圖3)。

圖2 GV358-CUEDC2轉(zhuǎn)染293T細胞24、48、72 h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果

圖3 感染GV358-CUEDC2的U251細胞經(jīng)流式篩選后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果

2.3 各組U251細胞中CUEDC2 mRNA及蛋白相對表達量 空白對照組、空載體組、過表達CUEDC2組U251細胞中CUEDC2 mRNA相對表達量分別為1、0.823±0.059、5.290±0.663，CUEDC2蛋白相對表達量分別為0.48±0.020、0.51±0.015、0.92±0.150，過表達CUEDC2組CUEDC2 mRNA及蛋白相對表達量均高于空載體組和空白對照組(P均<0.01)。

3 討論

CUEDC2是近年新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，作為多功能蛋白，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起到的作用也備受爭議。有研究表明，CUEDC2可促使APC/Cdc20更早活化[6]，可以推動細胞周期進展，引發(fā)染色體錯誤分裂進而引起腫瘤發(fā)生[7]。目前已發(fā)現(xiàn)慢性髓性白血病、肝癌、肺腺癌等腫瘤細胞中CUEDC2蛋白表達下調(diào)，進而影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移或細胞周期。在乳腺癌中，CUEDC2可促使雌激素受體和孕激素受體降解，導致腫瘤對激素治療不敏感[7]。在肺腺癌中，CUEDC2表達下調(diào)者臨床預(yù)后更差、生存期更短[8]。研究[4]表明JAK1-STAT3通路過激活是腫瘤發(fā)生的重要因素，有學者[9]報道CUEDC2參與了該通路激活的調(diào)控。

GBM臨床常規(guī)治療后易復(fù)發(fā)，難以根治。GBM生物學特性是呈浸潤性生長，與周圍組織無明顯分界，手術(shù)很難以完全切除[2]。隨著對腫瘤研究的深入，腫瘤干細胞[10]開始引起學者們的關(guān)注。腫瘤干細胞是一簇兼具正常干細胞特征和誘導腫瘤發(fā)生能力的小細胞團，首次發(fā)現(xiàn)是在血液病中[11]，后在多種實體腫瘤中陸續(xù)被分離發(fā)現(xiàn)[12, 13]。GSCs被認為參與了膠質(zhì)瘤放化療耐受，同時被視為腫瘤發(fā)生根源所在[14]。有報道稱JAK1-STAT3、NF-κB、Notch、Wnt[15]等信號通路參與腫瘤干細胞的干性維持。對GSCs相關(guān)基因及蛋白進行分析，尋找其干性維持的分子機制，對惡性膠質(zhì)瘤的分子治療相關(guān)研究有很大幫助[16]。對Oncomine數(shù)據(jù)深入分析后，我們發(fā)現(xiàn)CUEDC2的表達量與膠質(zhì)瘤的級別有相關(guān)性。而在膠質(zhì)瘤中，CUEDC2蛋白的作用及其機制尚未明確。為進一步分析CUEDC2在膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后評估中的應(yīng)用價值，我們決定在體外和體內(nèi)分別對CUEDC2在膠質(zhì)瘤中的生物學作用及其機制開展研究。

應(yīng)用慢病毒感染結(jié)合流式分選可獲得高純度的穩(wěn)定細胞系，能夠使細胞免于高濃度抗生素長期篩選導致的非特異表達，從而更好地保護細胞狀態(tài)，便于研究目的基因CUEDC2的功能。同時我們前期已經(jīng)比較了正常人星形膠質(zhì)細胞(HA)和膠質(zhì)瘤細胞系中CUEDC2的表達情況，構(gòu)建穩(wěn)定過表達CUEDC2的U251細胞系對后續(xù)探討CUEDC2在膠質(zhì)瘤細胞中的功能及具體機制有重要價值。

我們所構(gòu)建的攜帶CUEDC2基因的慢病毒載體質(zhì)粒，酶切結(jié)果顯示在900 bp和9 000 bp左右分別有兩條明顯的條帶，證明成功將目的基因和病毒載體連接在一起。流式篩選感染GV358-CUEDC慢病毒的U251細胞，得到陽性率95%以上的U251細胞，可認為流式分選后獲得較純的細胞系。U251細胞在感染GV358-CUEDC2及GV-vector病毒后熒光顯微鏡下均可見綠色熒光，說明GV358-CUEDC2成功感染U251細胞。過表達CUEDC2組CUEDC2 mRNA及蛋白相對表達量均高于空載體組和空白對照組，進一步佐證過表達CUEDC2的U251細胞系構(gòu)建成功。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了過表達CUEDC2的U251細胞系，能為后續(xù)各種膠質(zhì)瘤生物學行為實驗提供源源不斷的細胞供給，探索CUEDC2在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

[1] Chen R, Cohen AL, Colman H. Targeted therapeutics in patients with high-grade gliomas: past, present and future[J]. Curr Treat Options Oncol, 2016,17(8):42.

[2] Helseth R, Helseth E, Johannesen TB, et al. Overall survival, prognostic factors, and repeated surgery in a consecutive series of 516 patients with glioblastoma multiforme[J]. Acta Neurol Scand, 2010,122(3):159-167.

[3] Chen J, McKay RM, Parada LF. Malignant glioma: lessons from genomics, mouse models, and stem cells[J]. Cell, 2012,149(1):36-47.

[4] Yu H, Jove R. The STATs of cancer--new molecular targets come of age[J]. Nat Rev Cancer, 2004,4(2):97-105.

[5] Man J, Zhang X. CUEDC2: an emerging key player in inflammation and tumorigenesis[J]. Protein Cell, 2011,2(9):699-703.

[6] Zhang WN, Zhou J, Zhou T, et al. Phosphorylation-triggered CUEDC2 degradation promotes UV-induced G1 arrest through APC/C(Cdh1) regulation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(27):11017-11022.

[7] Pan X, Zhou T, Tai YH, et al. Elevated expression of CUEDC2 protein confers endocrine resistance in breast cancer[J]. Nat Med, 2011,17(6):708-714.

[8] Sun L, Bai L, Lin G, et al. CUEDC2 down-regulation is associated with tumor growth and poor prognosis in lung adenocarcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(24):20685-20696.

[9] Zhang WN, Wang L, Wang Q, et al. CUEDC2 (CUE domain-containing 2) and SOCS3 (suppressors of cytokine signaling 3) cooperate to negatively regulate Janus kinase 1/signal transducers and activators of transcription 3 signaling[J]. J Biol Chem, 2012,287(1):382-392.

[10] Williams ED, Williams GT. Cancer, somatic mutation and stem cells[J]. J Theor Biol, 2000,205(1):165-166.

[11] Shih SC, Prag G, Francis SA, et al. A ubiquitin-binding motif required for intramolecular monoubiquitylation, the CUE domain[J]. EMBO J, 2003,22(6):1273-1281.

[12] Kim CF, Jackson EL, Woolfenden AE, et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer[J]. Cell, 2005,121(6):823-835.

[13] Noh MS, Jun BH, Kim S, et al. Magnetic surface-enhanced Raman spectroscopic (M-SERS) dots for the identification of bronchioalveolar stem cells in normal and lung cancer mice[J]. Biomaterials, 2009,30(23-24):3915-3925.

[14] Abou-Antoun TJ, Hale JS, Lathia JD, et al. Brain Cancer Stem Cells in Adults and Children: Cell Biology and Therapeutic Implications[J]. Neurotherapeutics, 2017,14(2):372-384.

[15] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001,414(6859):105-111.

[16] Tu, Y, Zhong Y, Fu J, et al. Activation of JAK/STAT signal pathway predicts poor prognosis of patients with gliomas[J]. Med Oncol, 2011,28(1):15-23.

Establishment of human glioma U251 cell line with overexpression of CUEDC2

TANGChuanxi,LIUXinfeng,LIFeng,GAODianshuai

(XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China)

Objective To construct human glioma U251 cell line with overexpression of CUE domain containing 2 (CUEDC2). Methods Full-length CUEDC2 gene fragment was amplified by RT-PCR and linked to GV358 plasmid vector. After identifying GV358-CUEDC, we transfected and packaged it using lentivral packaging system (GV358-CUEDC2, Helper 1.0, and Helper 2.0) into renal epithelial cells (293T) by lipofectamin 2000 in order to obtain the LV-CUEDC2 lentivirus. After 48 and 72 h, we collected the virus supernatant and infected the U251 cells. Cells were divided into the blank control group (without any infection), LV-CUEDC2 group (transfected with GV358-CUEDC), and LV-vector group (transfected with GV-vector).After Flow cytometry sorting, Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the mRNA and protein expression levels of CUEDC2. Results GV358-CUEDC digestion showed that there was an obvious band at 900 bp. CUEDC2 sequencing results were consistent with the GenBank database. The results of flow cytometry confirmed the positive rate up to 95%. LV-CUEDC2 group and LV-vector group cells showed green fluorescence under fluorescence microscope after infection with GV358-CUEDC2 and GV-vector. The CUEDC2 mRNA levels of the blank control group, LV-vector group and LV-CUEDC2group were 5.290±0.663, 0.823±0.059, and 1, respectively. The CUEDC2 protein expression levels of the three groups were 0.48±0.02, 0.51±0.015, and 0.92±0.15, respectively. The CUEDC2 protein and mRNA expression levels of LV-CUEDC2 group were both higher than those of the other groups (bothP<0.01). Conclusions We successfully constructed the human glioma U251 cell line with CUEDC2 overexpression.

glioma; glioblastoma; CUE domain containing 2; lentivirus

唐傳喜(1992-)男，碩士研究生，主要研究方向為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。E-mail: 972251692@qq.com

高殿帥(1965-)，男，博士，教授，主要研究方向為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。E-mail: gds@xzhmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.001

R739.41

A

1002-266X(2017)27-0001-04

2017-01-04)