腎移植術(shù)后患者西羅莫司血藥濃度的測(cè)定

鄒 靜，肖洪濤，李晉奇，師健友，王 婷

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072)

腎移植術(shù)后患者西羅莫司血藥濃度的測(cè)定

鄒 靜，肖洪濤，李晉奇，師健友，王 婷

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072)

目的 建立腎移植術(shù)后患者西羅莫司血藥濃度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)測(cè)定方法。方法選取服用FK506/CsA+西羅莫司+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫治療的腎移植術(shù)后患者20例，采集西羅莫司谷濃度全血樣本，以達(dá)那唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，經(jīng)沉淀蛋白及液液萃取處理后，經(jīng)液相色譜分離，采用ESI離子源，以SIR正離子方式進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)離子為m/z 936.76(西羅莫司)，m/z 338.26(內(nèi)標(biāo))。同時(shí)將所建立的HPLC-MS法和微粒子酶免疫法(MEIA)分別測(cè)定腎移植患者全血西羅莫司濃度，評(píng)價(jià)兩種分析方法測(cè)定結(jié)果的一致性。結(jié)果西羅莫司在0.2～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9992)，最低定量限為0.2 μg/L。日內(nèi)、日間精密度均小于6%，方法學(xué)回收率為92.93%～102.98%。兩種方法測(cè)得的數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)為0.979(P＜0.05)，兩組數(shù)據(jù)間存在相關(guān)性(n=20)。當(dāng)西羅莫司濃度在1.9～11.1 μg/L時(shí)，兩種方法測(cè)定的平均偏差為1.4 μg/L。結(jié)論本文建立的HPLC-MS測(cè)定方法快速、準(zhǔn)確、靈敏、選擇性高，適用于臨床對(duì)西羅莫司的血藥濃度監(jiān)測(cè);HPLC-MS法和MEIA法測(cè)定西羅莫司全血濃度存在相關(guān)性，同一份樣本用MEIA測(cè)定的濃度均值比HPLC-MS法測(cè)定的值高。

西羅莫司;達(dá)那唑;高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用;血藥濃度監(jiān)測(cè);微粒子酶免疫法

西羅莫司(雷帕霉素)是由鏈霉菌屬產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種療效好、低毒、尚未發(fā)現(xiàn)有明顯腎毒性的免疫抑制劑［1］，因西羅莫司引起的可逆性副作用，如高脂血癥、白細(xì)胞及血小板減少癥、肺炎增加傾向等，在血藥濃度由30 μg/L降至15 μg/L后均有好轉(zhuǎn)［2］，因此當(dāng)器官移植后出現(xiàn)肝腎功能不全或他克莫司(FK506)、環(huán)孢霉素(CsA)不能達(dá)到理想的藥物濃度時(shí)，西羅莫司是作為替換治療或輔助治療的最佳選擇之一。

西羅莫司有效血藥濃度范圍窄，其口服生物利用度僅為14%～15%［3］，且由于患者疾病狀態(tài)、器官移植類型、年齡、劑量等因素在藥物吸收和代謝上都可能存在個(gè)體差異，因此不易估計(jì)給藥后的血藥濃度。此外，治療過(guò)程中的合并用藥、影響細(xì)胞色素P4503 A酶系的藥物都能引起血藥濃度的改變。對(duì)大部分患者而言，藥物的療效、毒副作用與血藥濃度成正相關(guān)，因此測(cè)定個(gè)體血藥濃度以調(diào)整用藥的劑量和次數(shù)、制定個(gè)體化治療方案在臨床上有著至關(guān)重要的意義。HPLC法測(cè)定西羅莫司濃度的方法已有文獻(xiàn)報(bào)道［4～6］。但這些方法中有的采用較為昂貴的LC-MS/MS，有些尚需難以獲得的特殊內(nèi)標(biāo)。本文建立用LC-MS法測(cè)定SRL的全血藥物濃度，以滿足醫(yī)院對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)的日常需求。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 腎移植術(shù)后患者血藥采集 2011年5月～7月選取服用FK506/CsA+西羅莫司+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫治療的腎移植術(shù)后患者20例，年齡20～65周歲，處于腎移植穩(wěn)定狀態(tài)?；颊呖诜髁_莫司劑量為1～2 mg/天，1次/天，西羅莫司血藥濃度首次測(cè)定可在術(shù)后第7～10天后的谷值血藥濃度，第1個(gè)月內(nèi)每周測(cè)定1～2次，第2個(gè)月每周測(cè)定1次，之后每個(gè)月測(cè)定1次，采血時(shí)間為即將服西羅莫司前抽血。

1.1.2 試劑與儀器 西羅莫司測(cè)定試劑盒與西羅莫司質(zhì)控及校準(zhǔn)品系列，均為美國(guó)Abbott公司提供。Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó) Waters公司)，含系統(tǒng)控制器，四元低壓梯度輸液泵，全自動(dòng)進(jìn)樣器，柱恒溫箱，MassLynx4.0色譜數(shù)據(jù)工作站;色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(100×2.1 mm，3.5 μm);BP211D電子分析天平(德國(guó)沙多利斯公司);IMx分析儀(美國(guó)Abbott公司)。甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司);水為超純水;對(duì)照品:西羅莫司對(duì)照品(批號(hào):0709022P，純度:99.5%，浙江省藥品檢驗(yàn)所);內(nèi)標(biāo)達(dá)那唑(I．S．)對(duì)照品(批號(hào):100126-200402，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 流動(dòng)相:H2O-乙腈-甲醇 (27:45:28，v/v);流速:0.2 ml/min，柱溫:60 ℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI+)，采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式同時(shí)測(cè)定西羅莫司(［M+Na］+，m/z 936.76)，內(nèi)標(biāo)達(dá)那唑(［M+H］+，m/z 338.26);毛細(xì)管電壓3.4 kV;椎孔電壓(西羅莫司72 V，達(dá)那唑28 V);二級(jí)椎孔電壓2 V;六級(jí)桿透鏡電壓0.2 V;源溫度120℃;脫溶劑氣溫度350℃;脫溶劑氣流量700 L/h;錐孔氣流量50 L/h。

1.2.3 溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制 ① 對(duì)照品溶液:精密稱取西羅莫司對(duì)照品5.03 mg(相當(dāng)于西羅莫司 5.005 mg)，以甲醇溶解，并定容于25 ml容量瓶中，混勻即成西羅莫司儲(chǔ)備液(200.19 mg/L)。取西羅莫司儲(chǔ)備液2.5 ml，以50%甲醇定容于50 ml容量瓶中，即得西羅莫司工作液(10.01 mg/L)，置-30℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＂趦?nèi)標(biāo)溶液:精密稱取達(dá)那唑標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，以50%甲醇水溶液溶解，并定容于25 ml容量瓶中，即得內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(200 mg/L)。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1 ml，以50%甲醇水溶液定容于50 ml容量瓶中，即得內(nèi)標(biāo)工作液(4 mg/L)，置4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。③?biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取西羅莫司工作液(10.01 mg/L)0.1 ml，置于10 ml容量瓶中，以空白人全血定容，混勻即得西羅莫司全血濃度100.1 μg/L，再以空白人全血按對(duì)倍稀釋，配成各含50.05、20.02、10.01、5.005、2.002、1.001、0.5005、0.2002 μg/L西羅莫司的全血樣品，置-30℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。④質(zhì)控樣品的配制。精密稱取西羅莫司對(duì)照品4.97 mg(相當(dāng)于西羅莫司4.945 mg)，以甲醇溶解，并定容于25 ml容量瓶中，混勻即成西羅莫司儲(chǔ)備液(197.81 mg/L)。取西羅莫司儲(chǔ)備液2.5 ml，以50%甲醇定容于50 ml容量瓶中，即得西羅莫司溶液(9.89 mg/L)，取9.89 mg/L的西羅莫司溶液0.08 ml，置于10 ml容量瓶中，以空白人全血定容，混勻即得西羅莫司全血高質(zhì)控樣品，濃度79.12 μg/L，再按此法配制得西羅莫司中質(zhì)控樣品(19.78 μg/L)，低質(zhì)控樣品(0.495 μg/L)，置-30 ℃ 冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 樣品預(yù)處理 取全血樣品0.1 ml，加入25 μl內(nèi)標(biāo)工作液，漩渦混勻，加入5%ZnSO4、丙酮各150 μl，漩渦混勻 6 分鐘后，12000 rpm，6 ℃離心 6 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一潔凈圓底玻璃試管，加入4 ml叔丁基甲醚，漩渦萃取8 min，3000 rpm，6℃離心8 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一尖底試管;于(45±5)℃水浴通氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)尤?0%甲醇120 μl旋渦混合1 min，加入環(huán)己烷2 ml旋渦萃取4 min，2200 rpm，6℃離心4 min，吸棄上層有機(jī)相，取下層水相10 μl進(jìn)樣。記錄西羅莫司和內(nèi)標(biāo)離子流色譜圖的色譜峰面積，計(jì)算西羅莫司和內(nèi)標(biāo)的峰面積比，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求算樣品中西羅莫司濃度。

1.2.5 方法學(xué)考察 ①標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍:取標(biāo)準(zhǔn)曲線全血樣品0.1 ml，加入25 μl內(nèi)標(biāo)工作液，按照“1.2.4樣品預(yù)處理”進(jìn)行操作，記錄西羅莫司和內(nèi)標(biāo)離子流色譜圖的色譜峰面積，以西羅莫司和內(nèi)標(biāo)峰面積比對(duì)應(yīng)其濃度進(jìn)行線性回歸，考察線性。②精密度與回收率試驗(yàn):取高、中、低質(zhì)控樣品各0.1 ml，于同批內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，將記錄峰面積比代入當(dāng)日線性回歸方程，計(jì)算西羅莫司濃度，以測(cè)得值與理論加入值之比計(jì)算方法學(xué)回收率，得到批內(nèi)精密度與回收率;在不同天連續(xù)分3批每濃度各測(cè)定5次，計(jì)算批間精密度與回收率。③萃取回收率試驗(yàn):按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法配制并測(cè)定 100.1、10.01、0.495 μg/L三個(gè)濃度血樣，每個(gè)濃度平行測(cè)定3份，所得峰面積與對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算萃取回收率。④基質(zhì)效應(yīng):將高、中、低(79.12、19.78、0.495 μg/L)質(zhì)控樣品，按“1.2.4樣品處理”操作，進(jìn)樣得峰面積A1，用相同體積的純水代替空白全血，按“1.2.4樣品處理”操作，記錄色譜圖峰面積A2，將A1與A2相除，即得絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。⑤穩(wěn)定性考察:根據(jù)樣品測(cè)定過(guò)程中可能遇到的不穩(wěn)定因素，實(shí)驗(yàn)先后考察了工作液-20℃保存的穩(wěn)定性;全血樣品在4℃放置7天的穩(wěn)定性，和在－30℃保存0、8、14及30天的穩(wěn)定性;全血樣品反復(fù)凍融0、1、2次的穩(wěn)定性;測(cè)定樣品處理完后立即進(jìn)樣與室溫放置4 h后進(jìn)樣的結(jié)果差異。

1.2.6 LC-MS法與MEIA法測(cè)定比較 目前，測(cè)定西羅莫司血藥濃度的方法主要為免疫法和LC-MS法，因此將所建立的LC-MS法與微粒子酶免疫分析法(MEIA法)對(duì)同一樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，考察兩種測(cè)量方法的一致性。對(duì)于之前選擇的20例腎移植術(shù)后患者，在采集谷濃度血樣時(shí)，取其靜脈血樣2～3 ml，立即移入經(jīng)EDTA處理的試管中，充分混勻，平均分為兩份，分別采用LC-MS法和MEIA法進(jìn)行測(cè)定。

MEIA法測(cè)定的主要步驟為:精確吸取樣本全血150 μl加入離心管中，精確加入150 μl沉淀劑，振搖10秒，離心5分鐘，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分，取上清液150 μl置雅培IMx分析儀內(nèi)，IMX分析儀將自動(dòng)檢測(cè)并打印結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以MEIA法所測(cè)的值為X變量，LC-MS法所測(cè)的值為Y變量，進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，考察測(cè)定結(jié)果相關(guān)性。采用 MedCalc 17.4.4統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行 Bland-Altman分析，考察兩個(gè)測(cè)量方法的一致性。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性在選定測(cè)定條件下，根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，進(jìn)行SIR監(jiān)測(cè)，西羅莫司和內(nèi)標(biāo)的m/z分別為936.76和338.26?？瞻籽獫{、西羅莫司和內(nèi)標(biāo)加空白血漿及血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖1～3?？瞻籽獫{中內(nèi)源性雜質(zhì)和代謝物不干擾西羅莫司及內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定，保留時(shí)間分別為3.07 min和7.52 min。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果西羅莫司全血標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=7.63×10-3X+1.55×10-4(r=0.9992，weighting=1/X2)。表明西羅莫司在0.2002～100.1 μg/L范圍內(nèi)線性良好，最低定量限為0.2002 μg/L，其RSD為6.58%。萃取回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，SRL萃取回收率為53.6%～58.9%。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定計(jì)算高、中、低質(zhì)控樣品中基質(zhì)效應(yīng)分別為(97.01±6.52)%、(103.01±5.64)%及(93.0±8.25)%，RSD分別為9.3%、7.7%、11.1%。高、中、低質(zhì)控樣品精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，工作液－20℃冷凍保存29 d均能保持穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。西羅莫司全血樣品在－30℃保存30 d，西羅莫司濃度結(jié)果穩(wěn)定。對(duì)比測(cè)定凍融0、1、2次的全血樣品以及4℃放置7 d的全血樣品，測(cè)定結(jié)果表明，在凍融和4℃放置條件下西羅莫司濃度結(jié)果穩(wěn)定。對(duì)比測(cè)定樣品處理完后立即進(jìn)樣與室溫放置4 h后進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果表明，預(yù)處理后殘留物復(fù)溶后放置4 h西羅莫司測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

圖1 LC-MS色譜圖-空白全血 a:總離子色譜圖;b:m/z 338.26色譜圖;c:m/z 936.76色譜圖;1:內(nèi)標(biāo)，2:西羅莫司

圖2 LC-MS色譜圖-空白全血加標(biāo)液 a:總離子色譜圖;b:m/z 338.26色譜圖;c:m/z 936.76色譜圖;1:內(nèi)標(biāo)，2:西羅莫司

圖3 LC-MS色譜圖-腎移植術(shù)后患者口服西羅莫司后全血樣品 a:總離子色譜圖;b:m/z 338.26色譜圖;c:m/z 936.76色譜圖;1:內(nèi)標(biāo)，2:西羅莫司

表1 SRL在人全血中的方法學(xué)回收率與批內(nèi)、批間精密度 (n=5)

2.3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果雙變量相關(guān)分析得出，r=0.979(P＜0.05)，提示兩組數(shù)據(jù)間存在相關(guān)性，回歸方程為Y=0.729X+0.1021。收集的20份樣本濃度在 1.9～11.1 μg/L，相對(duì)于 LC-MS，MEIA 的平均百分偏差為32.3%，平均偏差為1.43 μg/L。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行Bland-Altman偏差分析，見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，同一份樣本用 MEIA測(cè)定的濃度均值比HPLC-MS法測(cè)定的值高。

圖4 兩種方法測(cè)定數(shù)據(jù)的絕對(duì)平均偏差

3 討論

因SRL的有效治療濃度范圍較低4～10 μg/L，因此SRL的測(cè)定方法必須考慮到檢測(cè)靈敏度與分離效果的問(wèn)題。目前微粒免疫測(cè)定法(MEIA)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)常用來(lái)測(cè)定西羅莫司血藥濃度，盡管HPLC-MS/MS分離能力好、高靈敏度且快速的儀器優(yōu)勢(shì)，但儀器昂貴的價(jià)格亦限制了其應(yīng)用的普遍性，而在進(jìn)行有效的樣品預(yù)處理后，選擇HPLC-MS進(jìn)行檢測(cè)，同樣可以達(dá)到HPLC-MS/MS的檢測(cè)靈敏度。故本文選擇HPLC-MS法對(duì)西羅莫司的血藥濃度進(jìn)行了測(cè)定。

西羅莫司吸收入血后，95%分布于紅細(xì)胞內(nèi)，少部分與血漿脂蛋白結(jié)合［7］，因此測(cè)定西羅莫司 的血藥濃度需用全血。血樣的預(yù)處理先必須充分破壞紅細(xì)胞，并沉淀蛋白，使西羅莫司從中分離出來(lái)，便于提取，隨后還須將全血中的各種內(nèi)源性雜質(zhì)進(jìn)行去除，以避免干擾西羅莫司的測(cè)定。固相萃取辦法雖高效、可靠，但成本過(guò)高;而直接沉淀蛋白法雖然簡(jiǎn)便，但提取物中內(nèi)源性物質(zhì)較多，基質(zhì)效應(yīng)較高，因此在樣品預(yù)處理方法的建立階段，作者參考國(guó)內(nèi)外同行的已報(bào)道方法［6，8］，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，決定采用液液萃取方式處理樣品，同時(shí)選擇較易獲取的達(dá)那唑作為內(nèi)標(biāo)，以提高本方法的通用性。作者對(duì)流動(dòng)性的配比、色譜條件、質(zhì)譜條件也進(jìn)行了不斷優(yōu)化，最終確定的流動(dòng)相、樣品處理方法與質(zhì)譜條件，進(jìn)一步提高了本方法的靈敏度。

本研究還比較分析了MEIA與HPLC-MS兩種方法測(cè)定結(jié)果的差異，并給出兩種方法之間轉(zhuǎn)換的定量關(guān)系，方便臨床醫(yī)生對(duì)TDM的結(jié)果解讀;同時(shí)建立測(cè)定全血西羅莫司濃度的LC-MS法，可用于臨床西羅莫司的濃度監(jiān)測(cè)。體內(nèi)西羅莫司主要經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450酶系代謝為具有結(jié)構(gòu)相似的去甲基化、羥基化成無(wú)免疫抑制活性的產(chǎn)物，而臨床藥理學(xué)活性主要由西羅莫司母藥產(chǎn)生［9］。MEIA法是非特異性的，可與代謝產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)，與專門(mén)針對(duì)母體分子的LC-MS檢測(cè)法相比，交叉干擾能夠?qū)е聹y(cè)定結(jié)果產(chǎn)生固定的正偏差［10］。本研究結(jié)果顯示，MEIA法測(cè)定相對(duì)于LC-MS測(cè)定值明顯偏高，與西羅莫司體內(nèi)代謝特征及兩種測(cè)定方法的原理相符合。

因此本文建立的LC-MS法測(cè)定腎移植術(shù)后患者西羅莫司血藥濃度快速、準(zhǔn)確、靈敏、選擇性高，與Abbott IMx測(cè)定西羅莫司的免疫分析法比較均有較好的相關(guān)性，但LC-MS法能避免免疫分析方法中交叉免疫所造成的測(cè)定值偏高，更適用于臨床對(duì)西羅莫司的血藥濃度監(jiān)測(cè)，尤其適用于腎移植術(shù)后以西羅莫司作為輔助用藥時(shí)，西羅莫司血藥濃度較低者的含量測(cè)定。

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Determination of blood concentrations of sirolimus in patients after renal transplantation

ZOU Jing，XIAO Hong-tao，LI Jin-qi，SHI Jian-you，WANG Ting (Department of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Science ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To develop a HPLC-MS method for determination of blood sirolimus(SRL)concentrations in patients after renal transplantation．MethodsWe selected 20 patients who

a triple immunotherapy of FK506/CsA+Sirolimus+glucocorticoids after rental transplantation．The whole blood samples were collected．To determine the concentrations of SRL，danazol was used as the internal standard(IS)，and SRL and IS were separated on a Zorbax SB-C18 Narrow Bore RR(100 × 2.1 mm，3.5 μm)with a mobile phase containing H2O-acetonitrile-methanol(27:45:28，v/v)at a flow rate of 0.2 ml/min and temperature of the column is 60 ℃following protein precipitation and a simple two-step liquid-liquid extraction procedure．The mass spectrometer was operated in the positive ion mode，and selective ion monitors(SIM)were at m/z 936.76(［M+Na］+)for SRL and 338.26(［M+H］+)for internal stand-ard，respectively．At the same time，a microparticle enzyme immunoassay(MEIA)was also used to determine blood SRL concentrations．The consistency of results by the HPLC-MS method MEIA was analyzed．ResultsCalibration curves were linear(r=0.9992)between 0.2 and 100 μg/L of SRL and the sensitivity was 0.2 μg/L．Intraday and inter-day precision was less than 6%．Analytical recovery ranged from 92.93%to 102.98%．The correlation coefficient of the two methods was 0.979(P＜0.05)suggesting a close correlation between the two methods(n=20) ．An average deviation of the two methods was 1.4 μg/L when blood SRL concentrations ranging from 1.9 to 11.1 μg/L．ConclusionThe HPLC-MS method described herein had been successfully applied for TDM in adult renal transplant recipients due to its low limits of quantification and stability．There is a correlation between the HPLC-MS and MEIA in determination of blood RSL concentrations．However，the average concentration values of the same sample are higher using MEIA when compared to HPLC-MS method．

Sirolimus;Danazol;HPLC-MS;TDM;MEIA

R965

A

1672-6170(2017)04-0036-05

2017-02-03;

2017-04-03)

2015年四川省人民醫(yī)院青年基金立項(xiàng)資助項(xiàng)目(編號(hào):2015QN05)