白藜蘆醇調(diào)節(jié)微小RNA-29b表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞凋亡

曾凱宏，王 元，鄧 波，余雪梅，宋 怡，周 雪，黃璐嬌

(1．四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院．四川省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，四川 成都610072;2．電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610054)

白藜蘆醇調(diào)節(jié)微小RNA-29b表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞凋亡

曾凱宏1，2，王 元2，鄧 波1，余雪梅1，宋 怡1，周 雪1，黃璐嬌1

(1．四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院．四川省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，四川 成都610072;2．電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610054)

目的 研究白藜蘆醇(RSV)防護(hù)糖尿病早期視損傷的分子機(jī)制。方法通過建立視網(wǎng)膜muller細(xì)胞(RMCs)體外高糖模型，采用免疫熒光雙標(biāo)、qRT-PCR、western blot、Annexin V/PI流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)高糖和RSV對(duì)微小RNA-29b(miR-29b)、特異蛋白1(SP1)表達(dá)及RMCs凋亡的影響。結(jié)果高糖培養(yǎng)后，miR-29b和SP1表達(dá)明顯改變，RMCs凋亡率明顯增加，RSV干預(yù)可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的miR-29b和SP1異常表達(dá)和RMCs凋亡;通過預(yù)先在RMCs中轉(zhuǎn)染miR-29b類似物和miR-29b抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，RSV抑制凋亡作用受明顯影響(P＜0.05)。結(jié)論RSV通過調(diào)節(jié)miR-29b表達(dá)發(fā)揮抗糖尿病早期視損傷作用。

白藜蘆醇;微小RNA-29b;特異蛋白1;糖尿病視網(wǎng)膜病變;凋亡，

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最為常見的并發(fā)癥之一，是世界范圍內(nèi)致盲的主要眼病，國內(nèi)外目前尚無有效治療措施［1，2］。大量研究表明，在DR早期視網(wǎng)膜微血管病變之前即可檢測(cè)到視網(wǎng)膜muller細(xì)胞(retinal muller cells，RMCs)凋亡［3～5］。Silva 等［6］研究 DR 早期神經(jīng)細(xì)胞微小RNA(MicroRNA，miRNA)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-29b在DR早期RMCs凋亡中起重要作用。miR-29b通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白1(Specificity protein 1，SP1)表達(dá)參與 DR早期 RMCs凋亡。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是葡萄、花生、決明子和虎杖等天然植物中的一種有效成分，具有廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)作用［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，RSV不僅能降低 DR大鼠血糖水平，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，還能增加DR大鼠肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力，增加肝細(xì)胞的糖原合成能力等［8，9］。RSV對(duì)DR早期RMCs凋亡有無作用，尚不清楚。

本研究通過建立體外培養(yǎng)的 RMCs高糖模型，觀察高糖和RSV對(duì)miR-29b、SP1表達(dá)和RMCs凋亡的影響。本研究旨在揭示RSV防護(hù)DR早期病變的分子機(jī)制，為指導(dǎo)人們通過膳食途徑防治DR提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料2013年1月至2015年12月，出生后3～5 d的Sprague Dawley(SD)大鼠10只，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供;白藜蘆醇、各種抗體、熒光定量PCR試劑、Western blot試劑及各種試劑盒購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 出生后3～5 d的新生SD大鼠，用750 ml/L酒精浸泡消毒同時(shí)麻醉，無菌條件下取眼球，雙抗PBS漂洗數(shù)遍，小心剝離視網(wǎng)膜，加入5 g/L胰蛋白酶，37℃消化20～30 min，充分吹打，加入含200 ml/L血清的培養(yǎng)基終止消化，不銹鋼網(wǎng)過濾，1000 r/min離心3～5 min，培養(yǎng)基重懸，離心，反復(fù)2次。去上清后加入含200 ml/L血清的培養(yǎng)基制細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度為3×108個(gè)/L，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。3d換培養(yǎng)基，9 d后，將培養(yǎng)瓶密封，放入恒溫?fù)u床，200 r/min搖24 h進(jìn)行RMCs純化。細(xì)胞形態(tài)一致后，1:2傳代分瓶，第2/3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞傳代后接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，24 h完全伸展后進(jìn)行鑒定。用RMCs標(biāo)志物谷氨酰胺合成酶GS、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLAST和波形蛋白 vimentin聯(lián)合，免疫細(xì)胞熒光雙標(biāo)鑒定RMCs。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 細(xì)胞爬片以40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗5 min×3次，用含10 g/L BSA、5 ml/L TritonX-100的PBS緩沖液孵育30 min，同前漂洗后，用含50～100 ml/L正常羊血清的PBS緩沖液孵育10 min，加1:2000稀釋的 Anti-GS和Anti-GLAST，4℃過夜(同時(shí)設(shè)PBS替代一抗的空白對(duì)照和正常羊血清替代一抗的替代對(duì)照)，PBS漂洗后與羅丹明標(biāo)記的熒光二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗后加1 ∶200稀釋的 Anti-vimentin，37℃，2 h，PBS漂洗后與FITC標(biāo)記的熒光二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗后加Hoechst于37℃孵育5 min，PBS緩沖液漂洗后，900 ml/L甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察照相。第3代的RMCs用于試驗(yàn)。

1.2.3 高糖模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 高糖模型建立參照我們以往方法［3-5］，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，棄掉含血清的培養(yǎng)液，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，再換成含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液，分別為:5、10、15、20、25、30、35、40 mM，通過 12、24、36、48、72 h 觀察后，確立RMCs高糖模型的最適葡萄糖濃度為25 mM。實(shí)驗(yàn)分10組，分別是:正常對(duì)照組(CON)(普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，不含葡萄糖和RSV);10、20、30 mM RSV干預(yù)正常對(duì)照組(CON+10 mM RSV，CON+20 mM RSV，CON+30 mM RSV);高糖組(HG)(25 mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞);10、20、30 mM RSV 干預(yù)高糖組(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)以及甘露醇高滲對(duì)照組(CON+mannitol，HG+mannitol)。

1.2.4 MiR-29b類似物和miR-29b抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞 根據(jù)miR-29b序列合成miR-29b抑制劑和miR-29b類似物，然后轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將0.4 μg質(zhì)粒DNA加入50 μl無血清培養(yǎng)基中(動(dòng)作輕柔)。再把2 μl lipofectamine TM 2000 脂質(zhì)體稀釋至 50 μl，室溫放置5 min，二者輕輕混合，室溫放置20 min。吸出培養(yǎng)板中原液，輕柔加入配制好的含質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體復(fù)合物的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，總體積500 μl。放置于飽和濕度，37℃，5%CO2孵箱孵育4～6 h，再換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.5 QRT-PCR檢測(cè)miR-29b和SP1 mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)微小RNA-29b(miR-29b)和特異蛋白1(SP1)基因表達(dá)，分別設(shè)計(jì)微小RNA-29b(miR-29b)和特異蛋白1(SP1)基因引物以及TaqMan熒光探針(由大連寶生物公司合成)。引物序列為:微小RNA-29b(miR-29b):5'-CGTAGCACCATTTGAAATCAGTGTT-3'，5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';特異蛋白 1(SP1):5'-AGG TGC ACC AGC TTC CAG GCC TG-3'，5'-CCA GGT CCA TGA AGG CCA AGT TG-3';核糖體蛋白L13 A(RPL13 A):5'-AAGCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC-3'，5'-TGTTTCCGTAGCCTCATGAGC-3'。 用常規(guī)酚/氯仿法提取大鼠 RMCs的 mRNA，進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系 25 μl:2×TaqMan University PCR 混合液 12.5 μl，10 μmol/L 正反向引物各 0.5 μl，10 μmol/L TaqMan 探 針 0.3 μl，100 ng/ μl DNA0.2 μl，同時(shí)設(shè)立內(nèi)對(duì)照核糖體蛋白 L13 A(RPL13 A)基因，反應(yīng)在ABI Prism 7000熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為:93°C 2 min，93°C 1 min，55°C 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用低循環(huán)數(shù)(Ct)比較法計(jì)算目的基因的相對(duì)拷貝數(shù)與表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)特異蛋白1(SP1)蛋白表達(dá) 常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，Lowry法利用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定蛋白濃度，各取蛋白樣品30 μg上樣，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1%BSA的TBST封閉，加相應(yīng)各抗體4℃孵育過夜;加1∶20稀釋SP-9002試劑盒中的二抗及三抗孵育，37℃振搖1 h;DAB避光顯色3～5 min，至理想條帶出現(xiàn)，對(duì)PVDF膜掃描存盤。

1.2.7 Annexin V/PI雙標(biāo)記法凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡以Annexin V/PI凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞處理后，用4℃預(yù)冷的 PBS洗細(xì)胞2次，再用250 μl稀釋的binding緩沖液重新懸浮細(xì)胞，并使其濃度為1×106/ml，取 100 μl的細(xì)胞懸液于 5 ml流式管中，加 5 μl Annexin V/FITC 溶液和 10 μl 20 μg/ml的 PI溶液，混勻后于室溫避光放置15 min，在反應(yīng)管中加400 μl PBS，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，相關(guān)性用雙變量分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠RMCs體外原代培養(yǎng)及鑒定取出生3～5天的新生SD大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行原代視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)9天后后，細(xì)胞達(dá)80%以上融合，胞體呈長纖維形，胞漿豐富，胞膜清晰，單核或多核，核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，整個(gè)視野可見典型的神經(jīng)細(xì)胞、RMCs和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，此時(shí)可進(jìn)行RMCs純化培養(yǎng)。純化24 h后，細(xì)胞分布均勻，形態(tài)基本一致，生長情況良好，可見清晰的長梭形RMCs。以RMCs特征性標(biāo)志物GS、Vimentin和GLAST對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，Hoechst 33342復(fù)染核，觀察發(fā)現(xiàn)98%以上的細(xì)胞三種抗體染色呈陽性(圖1)。

圖1 谷氨酰胺合成酶、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及波形蛋白聯(lián)合鑒定大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞 a:谷氨酰胺合成酶鑒定大鼠視網(wǎng)膜 muller細(xì)胞;b:波形蛋白鑒定大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞;c:Hoechst 33342復(fù)染核;d:谷氨酰胺合成酶、波形蛋白及Hoechst 33342聯(lián)合鑒定大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞;e:谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鑒定大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞;f:Hoechst 33342復(fù)染核;g:谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白聯(lián)合Hoechst 33342鑒定大鼠視網(wǎng)膜 muller細(xì)胞

2.2 RSV對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠RMCs miR-29b表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(CON)相比，25 mM高糖培養(yǎng)組(HG)RMCs中miR-29b mRNA表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，10、20和30 mM RSV(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)干預(yù)明顯增加高糖組(HG)miR-29b mRNA表達(dá)量，呈劑量依賴關(guān)系，10、20和30 mM RSV(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)干預(yù)高糖組miR-29b mRNA表達(dá)量分別比未干預(yù)組增加了2.4倍、3.3倍和3.4倍(P＜0.05)。10、20和30 mM RSV干預(yù)對(duì)正常組(CON+10 mM RSV，CON+20 mM RSV，CON+30 mM RSV)對(duì)miR-29b mRNA表達(dá)量無明顯影響(P＞0.05)。甘露醇高滲對(duì)照對(duì)miR-29b mRNA表達(dá)量無明顯影響(P＞ 0.05)，見圖2。

2.3 RSV對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠RMCs SP1表達(dá)的影響高糖培養(yǎng)RMCs 72小時(shí)后，SP1 mRNA表達(dá)量明顯增加，10、20和30 mM RSV干預(yù)明顯降低高糖組SP1 mRNA表達(dá)量(P＜0.05)。同樣，高糖培養(yǎng)組(HG)SP1蛋白表達(dá)量也明顯高于正常對(duì)照組(CON)(P ＜ 0.05)。10、20和 30 mM RSV(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)干預(yù)明顯降低高糖組(HG)SP1蛋白表達(dá)量(P＜0.05)。正常對(duì)照組(CON)SP1 mRNA和蛋白表達(dá)量與10、20和30 mM RSV干預(yù)正常對(duì)照組(CON+10 mM RSV，CON+20 mM RSV，CON+30 mM RSV)無明顯差異(P＞0.05)。甘露醇高滲對(duì)照對(duì)SP1 mRNA和蛋白表達(dá)量無明顯影響(P＞0.05)，見圖3。

圖2 白藜蘆醇對(duì)大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞(RMCs)miR-29b mRNA表達(dá)的影響 與CON比較，＊＊＊P＜0.001;與HG比較，##P＜0.01，###P ＜0.001

2.4 RSV經(jīng)調(diào)節(jié)miR-29b表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的RMCs凋亡通過Annexin V/PI染色流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，HG培養(yǎng)后，大鼠視網(wǎng)膜RMCs凋亡率明顯高于正常對(duì)照組(CON)，20 mM RSV(HG+20 mMRSV)干預(yù)可明顯降低HG組RMCs凋亡率。為了研究miR-29b在RSV抗凋亡中的作用，我們預(yù)先在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-29b類似物和miR-29b抑制劑，如圖4所示，當(dāng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-29b抑制劑時(shí)，RSV抗高糖誘導(dǎo)的RMCs凋亡作用被逆轉(zhuǎn);當(dāng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-29b類似物后，RSV抗凋亡作用增加，表明RSV可能通過miR-29b發(fā)揮抗高糖誘導(dǎo)的RMCs凋亡。

圖3 白藜蘆醇對(duì)大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞(RMCs)SP1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 a:QRT-PCR檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜 muller細(xì)胞(RMCs)SP1 mRNA表達(dá)量;b:Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞(RMCs)SP1蛋白表達(dá)量(代表圖像);c:SP1與GAPDH蛋白表達(dá)量相對(duì)密度比值，與CON比較，＊＊＊P＜0.001;與HG比較，##P ＜0.01，###P ＜0.001

圖4 白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)miR-29b表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜muller細(xì)胞凋亡 a:Annexin V/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡(代表圖像);b:大鼠視網(wǎng)膜 muller細(xì)胞凋亡比率 與CON比較，＊＊＊P＜0.001，###P＜0.001＆P＜0.05，與HG+20mM RSV比較，＆＆＆P＜0.001 versus

3 討論

糖尿病發(fā)展成DR是一個(gè)緩慢的過程，一般需要5～6年的時(shí)間。糖尿病明確診斷、眼底出現(xiàn)改變之前的階段被稱作DR的臨床前期。研究發(fā)現(xiàn)，DR的臨床前期是先有視網(wǎng)膜神經(jīng)的損害，然后才是組織學(xué)或是檢眼鏡下可見的血管異常［1，3-5］。我們前期研究也證實(shí)，DR早期RMCs結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生異常改變，主要表現(xiàn)為膠質(zhì)反應(yīng)性增生、谷氨酸代謝異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)上調(diào)表達(dá)及RMCs凋亡。通過抑制DR早期RMCs損傷，將能阻止 DR 微血管病變，從而避免致盲［3～5］。

目前，國內(nèi)外關(guān)于DR防護(hù)的研究不勝枚舉，多數(shù)研究證明，高級(jí)糖基化終產(chǎn)物抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑及一些抗氧化劑等對(duì)DR有防護(hù)效應(yīng)，但對(duì)DR早期視損傷防護(hù)效果不明顯［7～9］。我們采用抗氧劑?；撬釋?duì)DR早期RMCs損傷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，低濃度的牛磺酸干預(yù)對(duì)RMCs損傷基本沒有防護(hù)效應(yīng)，高濃度?；撬岣深A(yù)對(duì)RMCs損傷雖有一定防護(hù)效應(yīng)，但?；撬岣深A(yù)后DR早期患者視功能改善情況并不理想［4］?？赡艽嬖谝韵聝蓚€(gè)原因:①作用效力不夠;②作用時(shí)間滯后。因而尋找更有效、更早期的抗RMCs損傷的DR早期防治措施十分必要。

本研究我們通過體外建立RMCs高糖模型，通過不同劑量RSV干預(yù)發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)后，miR-29b和SP1表達(dá)明顯改變，RMCs凋亡率明顯增加，RSV干預(yù)可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的miR-29b和SP1異常表達(dá)和RMCs凋亡。通過預(yù)先在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-29b類似物和miR-29b抑制劑發(fā)現(xiàn)，RSV抑制凋亡作用受明顯影響，初步提示RSV通過miR-29b發(fā)揮抗糖尿病早期視損傷作用。

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Resveratrol inhibits the apoptosis of rats retinal muller cells induced by high glucose via regulating miRNA-29b expression

ZENG Kai-hong1，2，WANG Yuan2，DENG Bo1，YU Xue-mei1，SONG Yi1，ZHOU Xue1，HUANG Lu-jiao1(1．Department of Clinical Nutrition，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China．2．School of Medicine，Chengdu University of E-lectronic Science and Technology，Chengdu 610054，China)

Objective To investigate the molecular mechanisms of protecting early diabetic retinopathy by resvertrol(RSV)．MethodsThe effects of RSV on expressions of miRNA-29b(miR-29b)and specificity protein 1(SP1)as well as apoptosis of retinal muller cells(RMCs)were investigated through development of rat RMCs hyperglucose model in vito，and mothods of immunofluorescence，qRT-PCR，western blot and Annexin V/PI flow-cytometry．ResultsHigh glucose induced down-regulation of miR-29b and upregulation of SP1 and increased the apoptosis of RMCs．The effects could be reversed by RSV in vitro．Moreover，the anti-apoptosis effect of RSV could be reversed by transfection of miR-29b analogues to RMCs and miR-29b inhibitor(P ＜ 0.05)．ConclusionResveratrol can inhibit diabetic retinopathy in early stage by regulation of miR-29b expression．

Resveratrol;miRNA-29b;Specificity protein 1;Diabetic retinopathy;Apoptosis

Q5

A

1672-6170(2017)04-0022-05

2017-03-12;

2017-05-31)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào):81202206);四川省衛(wèi)生計(jì)生委項(xiàng)目資助(編號(hào):150216)