雙膦酸鹽類藥物對胃癌細胞生長增殖的作用機制

徐曉寧 馬曉貞 汪學(xué)昌 李生梅 冶國棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001)

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雙膦酸鹽類藥物對胃癌細胞生長增殖的作用機制

徐曉寧 馬曉貞 汪學(xué)昌 李生梅 冶國棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001)

目的 檢測雙膦酸鹽類藥物唑來膦酸對胃癌細胞生長增殖的研究機制。方法 培養(yǎng)人胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901和BGC-823，將細胞分為對照組和藥物處理組，MTT法檢測10、20、40、80 μmol/L唑來膦酸對細胞株的影響。人胃癌細胞株加入10～80 μmol/L的唑來膦酸，對照組不加藥物，孵育1、3、6、12、24 h后計算不同濃度和時間對細胞的影響；人胃癌細胞株SGC-7901加入40 μmol/L的唑來膦酸培養(yǎng)24 h后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，Western印跡檢測半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果 10、20、40、80 μmol/L的唑來膦酸作用于胃癌細胞株(BGC-823、SGC-7901、MKN-28)，唑來膦酸的半抑制濃度(IC50)為40 μmol/L，用10～80 μmol/L的唑來膦酸作用于BGC-823、SGC-7901、MKN-28胃癌細胞株1、3、6、12、24 h后，可見唑來膦酸抑制人胃癌細胞的生長且有時間和濃度的依賴性，唑來膦酸對胃癌正常黏膜細胞GES-1無抑制作用；人胃癌細胞SGC-7901經(jīng)40 μmol/L的唑來膦酸作用24 h后，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)唑來膦酸處理組細胞凋亡情況顯著高于對照組；經(jīng)40 μmol/L唑來膦酸作用后的人胃癌細胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達量明顯升高，而Bcl-2蛋白表達量與對照組相比明顯減少。結(jié)論 唑來膦酸能抑制胃癌細胞的生長且有時間和劑量依賴性，唑來膦酸可以促進細胞凋亡。

雙膦酸鹽類藥物；唑來膦酸；胃癌

近年來，雖然胃癌的發(fā)病率有所下降，但胃癌患者預(yù)后恢復(fù)情況仍無明顯改變，病后5年的生存率還是很低。對于進展期和晚期的胃癌患者，化療是主要的手段，但化療藥物副作用、局限性大〔1～3〕。雙膦酸鹽類藥物(Bps)是一種代謝性骨病藥物，多用于治療由多種原因引起的骨溶解性疾病〔4〕。近年來，研究者又發(fā)現(xiàn)了Bps對抗腫瘤有直接或間接的作用〔5〕。唑來膦酸是第3代Bps，隨著對Bps研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)唑來膦酸也能很好地對前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤進行治療，但對胃癌的研究還比較少〔6,7〕。本研究旨在探討B(tài)ps對胃癌細胞生長增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 細胞株:人胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和GES-1由青海大學(xué)實驗室提供。主要試劑:兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗體、兔抗Caspase-9多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、Caspase-3 活性測定試劑盒和Caspase-9活性測定試劑盒購自美國Bioworld，Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自美國Invitrogen，ELISA細胞凋亡試劑盒購自瑞士Roche公司，RPMI1640購自美國Gibco公司。主要儀器:酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Thermo，流式細胞儀購自美國B-D公司。

1.2 細胞的培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出人胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823，37℃融化后，將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度條件下培養(yǎng)，用NaHCO3調(diào)整pH至7.2～7.4，細胞達到85%融合后，加入0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化分離細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.3 不同時間不同濃度的唑來膦酸對細胞的影響 將細胞分為對照組、藥物作用組。將人胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰酶消化并計數(shù)后，用培養(yǎng)液稀釋為終濃度3×104個/ml，按照每個孔100 μl的量接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜。在細胞中加入10、20、40、80 μmol/L的唑來膦酸，對照組不加藥物，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育1、3、6、12、24 h后，離心收集細胞，重懸于不同濃度藥物中。向每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 500 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，搖床室溫下緩慢震蕩8 min，待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm的波長處測定并記錄各組的吸光度OD，計算唑來膦酸的半數(shù)抑制濃度(IC50)及抑制率。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的人胃癌細胞株SGC-7901加入40 μmol/L的唑來膦酸，對照組不加藥物，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育24 h，用胰酶消化并收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整待測細胞濃度為3×106個/ml。取1 ml細胞懸液至離心管中，4℃1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml冰預(yù)冷的PBS重懸細胞，再次離心棄上清，PBS重復(fù)洗滌一次，加入Binding Buffer 200 μl重懸細胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI,充分混勻后避光環(huán)境中室溫靜置20 min，加緩沖液300 μl，用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.5 Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達 將40 μmol/L唑來膦酸作用于人胃癌細胞24 h后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的Ep管中，根據(jù)細胞的數(shù)量，加入適宜量的裂解緩沖液，裂解30 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清。按照細胞總蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒提取蛋白和測定蛋白濃度，在蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸變性5 min，每孔中加50 μl樣品，通過Odyssey掃描系統(tǒng)分析蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度唑來膦酸不同時間對人胃癌細胞抑制作用 用10～80 μmol/L的唑來膦酸作用于BGC-823、SGC-7901、MKN-28胃癌細胞株1、3、6、12、24 h小后，可見唑來膦酸抑制人胃癌細胞的生長且有時間和濃度的依賴性，唑來膦酸對胃癌正常黏膜細胞GES-1無抑制作用。見圖1。

圖1 不同濃度唑來膦酸不同時間對人胃癌細胞的影響

2.2 不同濃度唑來膦酸對細胞的影響 BGC-823、SGC-7901、MKN-28的IC50分別為(35.12±2.88) μmol/L、(38.52±3.21) μmol/L、(33.22±1.67) μmol/L。唑來膦酸對SGC-7901細胞株的IC50為40 μmol/L，24 h的抑制效果最明顯，因此后期選用濃度為40 μmol/L，培養(yǎng)24 h的人胃癌細胞SGC-7901為研究對象。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 人胃癌細胞SGC-7901經(jīng)40 μmol/L的唑來膦酸作用24 h后，經(jīng)PI/ Annexin-V雙染色用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。唑來膦酸處理組細胞凋亡(15.53%±1.11%)顯著高于對照組(2.12%±0.66%)(P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達 經(jīng)40 μmol/L的唑來膦酸作用后的人胃癌細胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達量(0.346±0.021，0.321±0.025)與對照組(0.208±0.015，0.198±0.018)相比明顯升高，而Bcl-2蛋白表達量(0.195±0.029)與對照組(0.324±0.031)相比明顯減少(P<0.01)。見圖2。

圖2 唑來膦酸作用于人胃癌細胞后相關(guān)蛋白表達量

3 討 論

目前，對胃癌的治療主要采取化療的方式，然而一部分胃癌細胞對化療藥物會產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致化療的失敗，這一直是困擾臨床治療的一個棘手問題〔1,8〕。因此，找到一個治療胃癌效果好的藥物，盡量減少化療是解決問題的關(guān)鍵。

Bps是近40年發(fā)展起來的一類對抗代謝性骨病有重要作用的藥物，如由多種因素引起的骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、骨痛等〔9〕。目前，Bps已經(jīng)更新到第3代〔10〕，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Bps不僅對破骨細胞有作用，而且還有直接的抗腫瘤效果，對多發(fā)性的胰腺癌、乳腺癌等腫瘤疾病都有直接的抗腫瘤效果〔11,12〕。研究者進一步的研究發(fā)現(xiàn)Bps的直接抗腫瘤作用主要是通過抑制腫瘤生長同時誘導(dǎo)凋亡來完成的〔13〕。

Bcl-2家族是細胞凋亡過程中重要的調(diào)控因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Bcl-2家族20種蛋白質(zhì)：一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL等10多個成員，另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、BAD等10多個成員〔14,15〕。Bcl-2家族中主要的抗凋亡分子是Bcl-2和Bcl-xL。Bcl-2和Bcl-xL能通過自身的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成二聚體，促使促凋亡成員在細胞內(nèi)定位分布，從而保護細胞不進入凋亡程序〔16,17〕。本研究結(jié)果顯示，人胃癌細胞株經(jīng)40 μmol/L的唑來膦酸處理后，Bcl-2蛋白表達量明顯減少。

Caspase 家族是細胞凋亡過程中重要的效應(yīng)子。目前已發(fā)現(xiàn)了14種Caspase家族成員。Caspase-3是凋亡的效應(yīng)子，位于級聯(lián)反應(yīng)的下游。目前，在Caspase家族中Caspase-3是研究比較透徹的一個。一般情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，當(dāng)出現(xiàn)細胞凋亡信號時可引起Caspase-3在一些水解酶的作用下發(fā)生裂解而活化〔18,19〕。Caspase-9是Caspase家族中的啟動分子，在人類的正常組織廣泛表達。研究表明，在白血病、胃癌中都發(fā)現(xiàn)Caspase-9基因轉(zhuǎn)錄和翻譯下調(diào)〔20〕。本研究結(jié)果推測唑來膦酸誘導(dǎo)的細胞凋亡是通過Caspase家族的依賴途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，唑來膦酸在胃癌細胞的生長增殖發(fā)揮重要作用且有時間和劑量的依賴性。唑來膦酸可以促進細胞凋亡，作用機制與Bcl-2蛋白家族和Caspase級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

1 Van Cutsem E,Bang YJ,Feng-yi F,etal.HER2 screening data from ToGA:targeting HER2 in gastric and gastroesophageal junction cancer〔J〕.Gastric Cancer,2015;18(3):476-84.

2 張元清,舒 鵬.運用健脾法治療胃癌研究進展〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014;16(2):69-71.

3 Li Z,Lei H,Luo M,etal.DNA methylation downregulated mir-10b acts as a tumor suppressor in gastric cancer〔J〕.Gastric Cancer,2015;18(1):43-54.

4 曲新華,郝永強.雙膦酸鹽在骨科相關(guān)疾病治療中的地位及再認(rèn)識〔J〕.中華骨科雜志,2014;34(1):78-80.

5 Li YT,Cai HF,Zhang ZL.Timing of the initiation of bisphosphonates after surgery for fracture healing:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.Osteop Inter,2015;26(2):431-41.

6 袁 宏,陸琳松,鐘惠琴,等.唑來膦酸對骨質(zhì)疏松患者全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍骨密度的影響〔J〕.中華關(guān)節(jié)外科雜志， 2014；8(3):3-8.

7 Moe SM,Chen NX,Newman CL,etal.A comparison of calcium to zoledronic acid for improvement of cortical bone in an animal model of CKD〔J〕.J Bone Mineral Res,2014;29(4):902-10.

8 Wang K,Yuen ST,Xu J,etal.Whole-genome sequencing and comprehensive molecular profiling identify new driver mutations in gastric cancer〔J〕.Nature Genet,2014;46(6):573-82.

9 Brown JP,Morin S,Leslie W,etal.Bisphosphonates for treatment of osteoporosis Expected benefits,potential harms,and drug holidays〔J〕.Canadian Family Physician,2014;60(4):324-33.

10 李立平,李 元.經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)聯(lián)合唑來膦酸治療老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的療效〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(15):4226-7.

11 Hald JD,Evangelou E,Langdahl BL,etal.Bisphosphonates for the prevention of fractures in osteogenesis imperfecta:meta-analysis of placebo-controlled trials〔J〕.J Bone Mineral Res,2015;30(5):929-33.

12 Oster G,Lamerato L,Glass AG,etal.Use of intravenous bisphosphonates in patients with breast,lung,or prostate cancer and metastases to bone:a 15-year study in two large US health systems〔J〕.Supportive Care Cancer,2014;22(5):1363-73.

13 Pabst AM,Ziebart T,Ackermann M,etal.Bisphosphonates'antiangiogenic potency in the development of bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaws:influence on microvessel sprouting in an in vivo 3D Matrigel assay〔J〕.Clin Oral Invest,2014;18(3):1015-22.

14 曾林涓,鐘淑萍,李學(xué)剛,等.載小干擾 RNA 納米微粒沉默 U937 細胞 B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因增加砷劑細胞毒效應(yīng)的研究〔J〕.中華實驗外科雜志,2014;31(5):1101-4.

15 Moldoveanu T,Follis AV,Kriwacki RW,etal.Many players in BCL-2 family affairs〔J〕.Trends Biochem Sci,2014;39(3):101-11.

16 Choudhary GS,Al-Harbi S,Mazumder S,etal.MCL-1 and BCL-xL-dependent resistance to the BCL-2 inhibitor ABT-199 can be overcome by preventing PI3K/AKT/mTOR activation in lymphoid malignancies〔J〕.Cell Death Dis,2015;6(1):e1593.

17 孫春玲,國曉瞳,趙 園,等.黃芩苷對熱應(yīng)激條件下豬近端腎小管 (LLC-PK1) 細胞凋亡率及 B 細胞淋巴瘤-2 基因 (Bcl-2) 和 Bcl-2 相關(guān) X 蛋白基因 (Bax) 表達的影響〔J〕.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2014;22(12):1553-60.

18 Alluri H,Stagg HW,Wilson RL,etal.Reactive oxygen species-caspase-3 relationship in mediating blood-brain barrier endothelial cell hyperpermeability following oxygen-glucose deprivation and reoxygenation〔J〕.Microcirculation,2014;21(2):187-95.

19 Liu X,He Y,Li F,etal.Caspase-3 promotes genetic instability and carcinogenesis〔J〕.Mol Cell,2015;58(2):284-96.

20 Tamaki H,Harashima N,Hiraki M,etal.Bcl-2 family inhibition sensitizes human prostate cancer cells to docetaxel and promotes unexpected apoptosis under caspase-9 inhibition〔J〕.Oncotarget,2014;5(22):11399-412.

〔2016-08-02修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

徐曉寧(1978-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科化療研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3429-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.021