強(qiáng)制性運(yùn)動療法對老年腦卒中大鼠神經(jīng)功能和堿性成纖維生長因子表達(dá)的影響

王淑玲 劉 佳 鄧景貴 宋 濤 方翠霓 劉楚娟 陶 希 唐雪琴

(湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，湖南 長沙 410016)

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強(qiáng)制性運(yùn)動療法對老年腦卒中大鼠神經(jīng)功能和堿性成纖維生長因子表達(dá)的影響

王淑玲 劉 佳1鄧景貴1宋 濤1方翠霓1劉楚娟1陶 希1唐雪琴1

(湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，湖南 長沙 410016)

目的 探討強(qiáng)制性運(yùn)動療法(CIMT)對老年腦卒中大鼠神經(jīng)功能和堿性成纖維生長因子(bFGF)表達(dá)的影響。方法 將90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為CMIT組、常規(guī)康復(fù)組及對照組，每組30只，采用Zea Longa線栓法制備腦卒中模型，給予CMIT組以固定健側(cè)上肢，強(qiáng)迫患側(cè)肢體進(jìn)行滾筒、平衡木、網(wǎng)屏訓(xùn)練；常規(guī)康復(fù)組以不限制健側(cè)上肢進(jìn)行滾筒、平衡木、網(wǎng)屏訓(xùn)練，訓(xùn)練時間與CIMT相同，每天訓(xùn)練時間上下午各15 min；對照組無任何訓(xùn)練，21 d后訓(xùn)練停止，各組大鼠飼養(yǎng)條件相同，實驗干預(yù)7、14、21 d對大鼠進(jìn)行行為功能(滾筒訓(xùn)練評分、平衡木測試評分、網(wǎng)屏抓握測試評分)及神經(jīng)功能評定；采用real-time PCR方法檢測bFGF、表皮生長因子(EGF)的mRNA表達(dá)，Western印跡法檢測bFGF、EGF的蛋白水平。結(jié)果 CMIT組、常規(guī)康復(fù)組康復(fù)訓(xùn)練后行為功能及神經(jīng)功能評分均明顯降低(P<0.05)，且CMIT組21 d后行為功能評分，14、21 d神經(jīng)功能評分均低于常規(guī)康復(fù)組(P<0.05)；CMIT組和常規(guī)康復(fù)組在康復(fù)訓(xùn)練7、14、21 d，bFGF和EGF蛋白及mRNA表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，CMIT組在康復(fù)訓(xùn)練14、21 d，bFGF和EGF蛋白水平及mRNA表達(dá)均高于常規(guī)康復(fù)組(P<0.05)。結(jié)論 強(qiáng)制性運(yùn)動療法與康復(fù)訓(xùn)練相比，可以更好地促進(jìn)出血性腦卒中大鼠肢體功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與促進(jìn)bFGF和EGF表達(dá)有關(guān)。

強(qiáng)制性運(yùn)動療法；腦卒中；神經(jīng)功能；堿性成纖維生長因子

偏癱是腦卒中最為嚴(yán)重的后遺癥，主要表現(xiàn)為患者運(yùn)動障礙〔1〕。對于腦卒中治療不僅需要挽救患者生命，而且更加需要改善患者生活自理能力和生活質(zhì)量〔2〕。強(qiáng)制性運(yùn)動療法(CIMT)是主要用于腦卒中恢復(fù)期上肢功能訓(xùn)練康復(fù)的治療技術(shù)，效果顯著〔3〕。臨床研究顯示經(jīng)過早期CIMT可能通過促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子參與腦卒中患者功能恢復(fù)〔4〕。堿性成纖維生長因子(bFGF)的作用是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖，不能使平滑肌細(xì)胞游走，能夠促進(jìn)新血管形成，修復(fù)損害的內(nèi)皮細(xì)胞〔5〕。本文旨在探討CIMT對腦卒中大鼠神經(jīng)功能和bFGF表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 動物：購買湖南斯萊克景達(dá)動物有限公司健康清潔級SD大鼠90只，體重220～300 g，月齡12個月，大鼠購回后按照養(yǎng)殖環(huán)境為24℃～25℃，自由供水，給予顆粒普通大鼠飼料。進(jìn)行14 d養(yǎng)殖，狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行實驗。將90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為CMIT組、常規(guī)康復(fù)組及對照組，每組30只。

1.2 研究方法

1.2.1 建立老年SD大鼠腦卒中模型 根據(jù)Zea Longa線栓法，腹腔麻醉，切開頸部皮膚，分離頸部動脈，包括頸內(nèi)動脈(ICA)、勁外動脈(ECA)、左側(cè)頸總動脈(CCA)，結(jié)扎ECA及頸總動脈近心端。在頸總動脈近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動脈分叉處，平均進(jìn)線(18.5±0.5)mm(ECA與ICA分叉處為起點)，栓線尾端留于皮膚外，栓塞90 min后抽線實現(xiàn)再灌注。以動物清醒后爬行時右轉(zhuǎn)圈，提尾時右前肢內(nèi)收屈曲為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 康復(fù)訓(xùn)練 CMIT組大鼠固定健側(cè)上肢，強(qiáng)迫患側(cè)肢體進(jìn)行滾筒、平衡木、網(wǎng)屏訓(xùn)練，每天訓(xùn)練時間上下午各15 min；常規(guī)康復(fù)組以不限制健側(cè)上肢進(jìn)行滾筒、平衡木、網(wǎng)屏訓(xùn)練，訓(xùn)練時間與CIMT相同；對照組無任何訓(xùn)練。CIMT組和常規(guī)康復(fù)組從術(shù)后第3天生命體征平穩(wěn)開始訓(xùn)練，21 d后訓(xùn)練停止，各組大鼠飼養(yǎng)條件相同。(1)滾筒訓(xùn)練：采用德國制造的滾筒式網(wǎng)狀訓(xùn)練器進(jìn)行訓(xùn)練，包括一個可旋轉(zhuǎn)的網(wǎng)狀籠，一個固定架底座。按5 r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)籠訓(xùn)練，每天強(qiáng)化訓(xùn)練和一般強(qiáng)度訓(xùn)練時間相同，上下午各15 min。(2)平衡木訓(xùn)練：取170 cm長、2 cm寬的方木，距地面7 cm處平放，大鼠可在上面爬行，每天強(qiáng)化訓(xùn)練和一般強(qiáng)度訓(xùn)練時間相同，上下午各15 min。(3)網(wǎng)屏訓(xùn)練：網(wǎng)屏為50 cm×40 cm紗網(wǎng)，網(wǎng)眼均為1 cm×1 cm 大小，下邊放一個12 cm厚的軟海綿墊。將受試大鼠置于平放的網(wǎng)屏上，再緩慢抬高網(wǎng)屏的一端到80 cm的地方，觀察大鼠是否抓住網(wǎng)屏或掉下。每天強(qiáng)化訓(xùn)練和一般強(qiáng)度訓(xùn)練時間相同，上下午各15 min。

1.2.3 大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、表皮生長因子(EGF)的mRNA表達(dá) 提取腦卒中側(cè)組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用real-time PCR方法檢測bFGF、EGF的mRNA水平變化。實驗試劑：RNA提取試劑盒(Code No.9767，TAKARA公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code No.RR047A，TAKARA公司)、real-time PCR試劑盒(Code No.RR820A，TAKARA公司)，選擇參比基因為β-actin，引物設(shè)計：β-actin編號AY618569，正義5'-CTGACGGCCAGGTCATCACTA-3',反義:5'-CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3';bFGF編碼XM_006535399，正義:5'-CTTTAGGAGCTGCGTCACCG-3',反義:5'-AGCCCCTTGAGTGTACAACG-3';EGF編碼NM_001329594.1，正義：5'-TCAGACGGAGAGACTGCTGA-3',反義:5'-GGTGCGGTAGAGTCGAAACA-3'。

1.2.4 大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、EGF蛋白質(zhì)水平 實驗7、14、21 d各處死10只大鼠，提取腦卒中側(cè)組織總蛋白質(zhì)，采用Western印跡方法，利用bFGF抗體和EGF抗體，檢測各組大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、EGF的蛋白水平。

1.3 研究指標(biāo) 實驗7、14、21 d對大鼠進(jìn)行行為功能及神經(jīng)功能評定，行為功能〔6〕：(1)滾筒訓(xùn)練評價。0分：鼠可在上面行走；1分：鼠不會掉下來，超過1 min；2分：鼠從棒上掉下來；3分：開始前鼠就掉下來。(2)平衡木測試。該項目評分標(biāo)準(zhǔn)共分6個等級。0分：大鼠在平衡木上移動且不會掉下；1分：在平衡木上移動，掉下機(jī)會≤50%；2分：在平衡木上移動，掉下機(jī)會>50%；3分：在平衡木上健側(cè)代償，患側(cè)不負(fù)重；4分：在平衡木上不移動不掉下；5分：在平衡木上不能保持即掉下。(3)網(wǎng)屏抓握測試。該項目共分4個評分標(biāo)準(zhǔn)。0分：大鼠前爪抓網(wǎng)屏約5 s不掉下；1分：大鼠可抓住網(wǎng)屏但滑落一段距離，沒有掉下；2分：在5 s內(nèi)從網(wǎng)屏上掉下；3分：網(wǎng)屏豎立時大鼠即可掉下。神經(jīng)功能評定〔9〕：15分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行2分：評分，0分：無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：不能屈曲對側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 3組各時間點行為功能評分比較 對照組經(jīng)過滾筒訓(xùn)練、平衡木測試、網(wǎng)屏抓握測試均為0分。經(jīng)過康復(fù)訓(xùn)練后，CMIT組、常規(guī)康復(fù)組行為功能評分均有所下降(P<0.05);且CMIT組21 d行為功能評分均低于常規(guī)康復(fù)組(P<0.05)。見表1。

2.2 3組不同時間點神經(jīng)功能評分比較 CMIT組、常規(guī)康復(fù)組康復(fù)訓(xùn)練后神經(jīng)功能評分有下降的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.378，6.231；均P=0.000)，對照組差異不顯著(F=0.879,P=0.189)；康復(fù)訓(xùn)練7 d神經(jīng)功能評分3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，康復(fù)訓(xùn)練14、21 d 3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且CMIT組和常規(guī)康復(fù)組評分低于對照組，CMIT組低于常規(guī)康復(fù)組(P<0.05)。見表2。

表1 3組各時間點行為功能評分比較分)

與本組7 d比較：1)P<0.05

2.3 大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、EGF蛋白水平比較 bFGF和EGF蛋白經(jīng)過康復(fù)訓(xùn)練同一時間點3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中CMIT組和常規(guī)康復(fù)組在康復(fù)訓(xùn)練7、14、21 d bFGF和EGF蛋白水平均高于對照組(P<0.05)，CMIT組在康復(fù)訓(xùn)練14、21 d bFGF和EGF蛋白水平均高于常規(guī)康復(fù)組(均P<0.05)。見表3。

2.4 大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、EGF mRNA相對表達(dá) bFGF和EGF mRNA表達(dá)經(jīng)過康復(fù)訓(xùn)練同一時間點3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中CMIT組和常規(guī)康復(fù)組bFGF和EGF mRNA表達(dá)在康復(fù)訓(xùn)練7、14、21 d均顯著高于對照組(P<0.05)，CMIT組在康復(fù)訓(xùn)練14、21 d均顯著高于常規(guī)康復(fù)組(P<0.05)。見表4。

表2 3組不同時間點神經(jīng)功能評分比較分)

與對照級比較：1)P<0.05;與常規(guī)康復(fù)組比較：2)P<0.05；下表同

表3 大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、EGF蛋白水平比較

表4 大鼠腦卒中側(cè)組織中bFGF、EGF mRNA相對表達(dá)水平比較

3 討 論

根據(jù)流行病學(xué)現(xiàn)況研究顯示我國腦卒中的發(fā)病率和死亡率明顯高于心血管病，腦卒中除了發(fā)病率高，死亡率高外，其更重要的特點是致殘率高〔8〕。據(jù)WHO統(tǒng)計，約有80%的腦卒中患者留有不同程度的殘疾，包括智力殘疾、肢體殘疾等〔9〕。腦卒中并發(fā)偏癱，臨床上認(rèn)為腦卒中后偏癱上肢恢復(fù)的最佳時間是3個月內(nèi)。腦損傷恢復(fù)分為自發(fā)和治療兩種，其中治療功能恢復(fù)是在患者不能自發(fā)恢復(fù)情況給予臨床干預(yù)，其中腦功能是否可塑是治療關(guān)鍵，這也是腦卒中后功能康復(fù)的主要機(jī)制〔10〕。

CMIT是從動物實驗中發(fā)現(xiàn)，主要以強(qiáng)化訓(xùn)練患側(cè)、控制健康為主，達(dá)到強(qiáng)制使用和強(qiáng)化訓(xùn)練患肢的目的，能明顯提高腦卒中后患側(cè)上肢的靈活性，但目前的研究多數(shù)為個案報道或小樣本研究〔11〕。神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是神經(jīng)可塑性研究方向最重要的熱點。研究結(jié)果說明網(wǎng)屏抓握訓(xùn)練效果較滾筒訓(xùn)練、平衡木測試稍微靈敏，三者康復(fù)訓(xùn)練均優(yōu)于常規(guī)訓(xùn)練模式，且康復(fù)訓(xùn)練有利于患者功能恢復(fù)，并且早期CMIT促進(jìn)患者疾病恢復(fù)效果更加明顯。

bFGF是一種生物活性很強(qiáng)的促分裂因子和極具臨床應(yīng)用價值的神經(jīng)營養(yǎng)因子。研究表明〔12〕，在腦卒中等病理狀態(tài)下，內(nèi)源性NSC會發(fā)生增殖現(xiàn)象，參與神經(jīng)修復(fù)，并且以bFGF、EGF為代表的細(xì)胞因子是最重要的一種，bFGF促使干細(xì)胞向著生成神經(jīng)元的方向分化，其刺激作用出現(xiàn)早，可維持時間較長；而EGF在NSC增殖晚期促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和分化，bFGF在NSC增殖早期發(fā)揮促有絲分裂作用，使NSC獲得對另一種作用更強(qiáng)的促有絲分裂因子EGF的反應(yīng)性，在增殖后期EGF對NSC的增殖刺激作用明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果說明CMIT可能通過上調(diào)bFGF和EGF水平林而促進(jìn)出血性腦卒中大鼠肢體功能的恢復(fù)。

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〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

湖南省2013年第二批省級科技計劃項目(No.2013FJ3117)；2012年湖南省自然科學(xué)常德聯(lián)合基金計劃項目(No.12JJ9029)

劉 佳(1963-)，女，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

王淑玲(1984-)，女，碩士，助理研究員，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)14-3403-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.010

1 湖南省人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科