包蟲病血清學檢測方法及其診斷意義

黃燕+尚婧曄+陳凡+何偉+張光葭+喻文杰+王奇+廖沙+李汭芮+王謙

近來，衛(wèi)生部門和畜牧部門針對包蟲病開展了一系列的聯(lián)合防控工作，極大地促進了包蟲病的防控進程，提高了包蟲病的防控效率，達到了包蟲病防控的工作預期。本文對包蟲病的血清學診斷常用的一些抗原和血清學診斷方法進行簡要介紹，闡述了血清學結果在人群包蟲病診斷中的意義。

1包蟲病的診斷標準

我國主要存在囊型包蟲?。–E）和泡型包蟲病（AE）。包蟲病的診斷需要從以下幾個方面進：①患者要有流行病學接觸史；②患者有無相關臨床癥狀；③患者有影像學占位性病變或包蟲病特征性影像；④實驗室檢查患者包蟲病血清學抗體陽性或病原學檢查發(fā)現(xiàn)特征性的結構或特異性核酸檢測為陽性。只有通過這幾方面的特征進行綜合判斷，才能作出正確的診斷結果。

2包蟲病血清學診斷的常用抗原

包蟲病的血清學診斷是人包蟲病診斷的依據(jù)之一，包蟲病的血清學診斷常用到一些抗原，有天然抗原和重組抗原。

2.1細粒棘球蚴天然抗原（Eg抗原）

2.1.1粗抗原棘球蚴的包囊液、原頭節(jié)和囊壁組織都曾用作診斷試驗的抗原，但包囊液被認為是診斷抗原的最好來源。

2.1.2抗原5/弧5（Ag5）抗原典型的弧5抗原是在囊型包蟲病里發(fā)現(xiàn)的。Carpron等用囊液抗原和棘球蚴患者血清進行免疫電泳（IEP）試驗，將IEP中出現(xiàn)的一條沉淀線稱為弧5。用親和層析的方法，從濃縮的包囊液中得到純化的“弧5”抗原。這種抗原在電泳中只產(chǎn)生單一的沉淀線，為一種脂蛋白，分子量為60 kDa，不耐熱，加熱70℃抗原即失活。棘球蚴患者血清經(jīng)常出現(xiàn)弧5沉淀線，在其他病人中未發(fā)現(xiàn)弧5抗原。

2.1.3抗原B（AgB）AgB也是常用的囊型包蟲病診斷抗原。Oriol等將濃縮的包囊液經(jīng)處理得到純化抗原，與免疫血清做IEP可出現(xiàn)兩條沉淀線，命名為抗原A和抗原B。2種抗原都是脂蛋白，將抗原煮沸15 min后，A成分喪失。根據(jù)抗原A的IEP沉淀線特征，可以認為與Carpron等的抗原5是同一種抗原組分。而抗原B加熱后無變化，為一種耐熱抗原，分子量約為16 kDa。

大量研究和臨床檢測證明：抗原5和抗原B的亞基對囊型包蟲病（Eg）都不是特異性的，在泡型包蟲病（AE）、伏氏棘球蚴或CE患者血清中均可測出特異性抗體。在豬帶絳蟲和豬囊尾蚴感染患者血清中也能測出高水平的抗Ag5抗體，這兩種抗原和豬囊蟲病交叉感染很高，有的甚至可以達到20%～30%，這是包蟲病血清學檢測中出現(xiàn)交叉反應的主要原因之一。

2.1.4P-29抗原Gonzalez等用Eg原頭節(jié)抗原單克隆抗體鑒定出一個抗原組分P-29。在免疫印跡實驗中，單抗僅識別原頭節(jié)粗抗原約29 kDa的一條帶。免疫組化研究顯示，P-29定位于包囊生發(fā)層和原頭節(jié)的表皮層、頂突和吸盤，在包囊液和成蟲提取物中都沒有P-29。

2.1.5P1血型抗原包蟲囊液抗原和囊壁提取物中有一種成份，其抗原的活性與人紅細胞的P1抗原相似，叫做紅細胞P1抗原。紅細胞P1的成分是糖脂，包囊液P1的活性物質(zhì)則為糖蛋白。科研人員在研究肥頭絳蟲（Taenia crassiecps）、牛帶絳蟲（T. saginata）、豬帶絳蟲（T. solium）的化學和免疫學染色圖譜時發(fā)現(xiàn)幾種絳蟲的糖脂相同，在結構上與P1相似并具有P1活性，所以，包蟲病和這些絳蟲感染也會出現(xiàn)交叉反應。檢測時注意分離血清的過程中一定不要讓紅細胞破裂。如果紅細胞破裂，紅細胞表面的P1抗原可能會進入到血清里，血清學檢測會出現(xiàn)假陽性。因為那只是紅細胞膜上的抗原，而不是真正的來自蟲體的抗原，所以會出現(xiàn)一個很典型的假陽性反應。

2.2多房棘球蚴天然抗原（Em抗原）

2.2.1粗抗原對多房棘球蚴的免疫學診斷研究最初也是從粗抗原開始的。多房棘球蚴的組織結構與囊型棘球蚴不同，不能像囊型包蟲病那樣方便地獲取可溶性包囊液抗原材料。Em粗抗原多來自蟲體的全組織勻漿抽提物或原頭節(jié)組織抗原。ELISA試驗顯示粗抗原與CE血清呈現(xiàn)廣泛的交叉反應。

2.2.2Em2抗原Gottstein等獲得了一個組分分子量約為54kDa，等電點為4.8，稱為Em2抗原。Em2抗原對AE血清敏感性達94%，與其他異源性蠕蟲感染血清無交叉反應，但與CE血清有反應，只是抗體滴度較低。用FITC（異硫酸酯熒光素）標記可特異性識別Em抗原的單抗MabG11，直接熒光法檢測顯示，MabG11定位于角質(zhì)層和體外培養(yǎng)13天的六鉤蚴。生發(fā)層組織、原頭節(jié)、成蟲及新鮮孵出的六鉤蚴均無Em2抗原。因而認為Em2具有階段特異性。Em2抗原主要定位于角質(zhì)層組織，這較好地解釋了在Em感染甚至在自愈患者血清中抗體長期存在，而在手術完全切除病灶的患者血清中抗體迅速下降的原因。

2.2.3Em18和Em16抗原Ito用免疫印跡法從Em原頭節(jié)組織抗原中鑒定出兩種抗原組分，分子量約為18 kDa和16 kDa，分別命名為Em18和Em16。Em16抗原識別AE血清敏感性低、特異性差。報告稱Em18抗原具有較好的特異性和敏感性，Em18還能區(qū)別活動性和非活動性病灶。由于Em18在Eg原頭節(jié)抗原組分中也存在，所以Em18并非種特異性抗原，但仍可作為鑒別診斷用抗原（AE病人血清抗體滴度高于CE病人）。人體感染泡型包蟲病后，病灶中基本沒有原頭蚴（圖1）或者原頭蚴非常少，因此用原頭蚴的指標來判定人的包蟲病的活躍程度，還有待于商榷。

2.2.4糖脂抗原Persat和Dennis等相繼從Em和Eg續(xù)絳期組織中分離出寄生蟲特異的中性和酸性糖脂。用AE患者血清檢測從Em提取的糖脂，發(fā)現(xiàn)與血清中抗體結合的是特異性的中性糖脂，酸性糖脂無反應。CE血清對酸性糖脂反應能獲得高OD值，這一結果表明糖脂組分抗原有可能對AE、CE及其它蠕蟲病作鑒別診斷。endprint

3包蟲病血清學診斷的常用重組抗原及合成多肽

3.1細粒棘球蚴重組抗原

3.1.1Ag5表位特異性相關基因的克隆Facon等從Eg原頭節(jié)cDNA文庫中篩選出一個陽性克隆Eg6，含有456bp核苷酸，編碼了152個氨基酸。其融合蛋白可被Ag5的一株單抗特異性識別，又用該單抗從Eg原頭節(jié)cDNA文庫中篩選出一個陽性克隆Eg14，其編碼的氨基酸序列與Eg6部分相同。

3.1.2抗原B表位特異性相關基因的克隆Shepherd用羊包囊液抗原的兔免疫血清從Eg原頭節(jié)cDNA文庫篩選到一個克隆，為AgB 12kDa亞單位C末端的一個片段。Helbig等用混合患者血清從Eg幼蟲cDNA表達庫中獲得一個陽性克隆Eg55。對克隆 Eg55測序顯示與上述的C-末端片段核苷酸序列有94.3%的同源性。

3.2多房棘球蚴重組抗原

3.2.1Ⅱ/3和Ⅱ/3-10抗原Vogel等用患者血清從Em cDNA文庫篩選出克隆Ⅱ/3。表達的融合蛋白在細胞內(nèi)被迅速降解為31和33kDa兩個多肽，這兩個多肽與患者血清中特異性抗體有很好的結合能力。Muller等將Ⅱ/3抗原切割成片段進行亞克隆，克隆Ⅱ/3-10表達的β-半乳糖甘酶融合蛋白，對AE血清敏感性為90%，特異性為99%。

3.2.2EM2、EM4和EM10抗原Hemmings等用兩型棘球蚴感染血清從Em原頭節(jié)cDNA文庫中篩選出克隆EM4。用ELISA檢測AE患者血清特異性為100%。Frosch等構建了一個Em原頭節(jié)cDNA表達文庫，并用AE混合血清篩選獲得5個陽性克隆，部分序列比較證實均為同一基因稱EM10。免疫熒光顯示這種基因表達的抗原位于Em原頭節(jié)皮層和育囊的生發(fā)層。對Ⅱ/3、EM4和EM10的DNA序列比較結果，證實它們是相同的或非常相似的抗原。

3.2.3RecEm18Sako等研究了Em18與Em 65kDa抗原的關系，65 kDa被確定為EM10或Ⅱ/3的編碼蛋白。對天然Em18抗原的N-末端進行測序，發(fā)現(xiàn)Em18也是EM10抗原的一個片段。Sako等成功地用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了重組Em18抗原，命名為RecEm18。用ELISA檢測血清結果顯示，RecEm18可識別90.3%的經(jīng)臨床或病理證實的AE血清樣本。

3.3包蟲病常見的血清學診斷方法

包蟲病的常見血清學診斷方法包括：補體結合試驗（CF）、間接凝集試驗（IHA和LA）、間接抗體標記試驗（ELISA、IFA和RIA）、沉淀試驗（IEP、DD5、CIEP和IED）、免疫印跡試驗（Immunoblot）、金標免疫滲濾法（DIGFA）、膠體金免疫層析試條（GICTS）等。3.3.1抗體IgG檢測在棘球蚴病患者血清中含量最多的特異性抗體是IgG，目前多用檢測血清中的IgG，作為包蟲病免疫學診斷的主要指標。常用方法有間接ELISA、IHA、Immunoblot、DIGFA和GICTS等。

間接ELISA：是目前運用最廣泛的檢測手段。檢測的特異性和敏感性隨不同廠商生產(chǎn)的試劑質(zhì)量不同而存在差異。檢測中需要用到酶標儀、洗板機和孵化箱等設備，因此必須在實驗室操作，采樣現(xiàn)場不能直接出結果。

間接血凝：將囊液抗原致敏醛化的綿羊紅細胞，在倍比稀釋的待檢血清反應孔中加入致敏的紅細胞懸液，孵化2～3h后觀察紅細胞凝集反應，以血清一定比例稀釋出現(xiàn)凝集反應者判為包蟲血清抗體陽性。肉眼判斷的結果存在一定人為因素的干擾。

免疫印跡：先將抗原進行電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，做成抗原膜條，在待檢血清中加入抗原膜條，反應后出現(xiàn)特異條帶，如12KD、17KD、18KD、24KD等。

金標免疫滲濾法和膠體金免疫層析試條：主要用不同重組抗原檢測血清中特異抗體。操作簡單，不需要特殊儀器設備，適合現(xiàn)場使用。

3.3.2循環(huán)抗原（cAg）和免疫復合物（CIC）檢測從患者血清和尿液中檢測cAg有助于診斷活動性或現(xiàn)癥感染。血清抗原檢測也更少受包囊定位的影響，從理論上講對治療后的監(jiān)測比監(jiān)測抗體變化更具相關性。抗原檢測通常使用夾心ELISA法，由于cAg濃度在血清中通常很低，因而診斷方法應盡可能敏感。將患者血清酸處理（甘氨酸/HCl或尿素）使循環(huán)免疫復合物解離，有利于提高cAg的檢出。

3.5包蟲病的免疫學檢測結果在診斷中的意義

3.5.1包蟲病免疫學診斷中的抗體人體感染包蟲病后抗體有很多種，但是血清中主要是IgG抗體，其中IgG1和IgG4占優(yōu)勢。有學者提出可能IgG4對包蟲病病人監(jiān)測血清學變化有更大的特異性。但是筆者發(fā)現(xiàn)，IgG4確實特異性高一點，但是敏感性較低，容易造成病人漏診，所以建議還是檢測IgG的總量。通常IgG抗體陽性表示被檢者曾經(jīng)接觸過蟲卵（機體對抗原會產(chǎn)生抗體，但蟲卵不一定能發(fā)育為病灶）或正被感染（包括沒有癥狀和病灶的早期及現(xiàn)癥病人），而多數(shù)患者被治愈后（手術或藥物治療）的數(shù)年包蟲病抗體檢測依然陽性；此外，包蟲病IgG抗體陽性常常和其他帶科絳蟲感染存在交叉感染（假陽性反應）。檢查結果的準確性和試劑的質(zhì)量、操作人員的技術也有關系，所以，單純抗體陽性結果沒有診斷意義，必須結合流行病學史和其它檢查。

3.5.2包蟲病免疫學診斷中的抗體檢測的意義輔助診斷：當被檢者有流行病學接觸史；或有相關癥狀或影像學有占位性病變但不典型，這時候可以用血清學檢測結果來輔助診斷。

鑒別診斷：當有流行病學接觸史；臟器上有實質(zhì)性占位性病變，但影像上同單純性囊腫、肝癌、膽囊積液、右腎積水、肝膿腫、較大血管瘤、普通鈣化灶等病灶無法鑒別時，可以用血清學檢測結果來鑒別診斷。

在CE血清學診斷中，由于Ag5和AgB與其他寄生蟲的相同分子具有共同表位，存在交叉反應，且較高比例的CE患者血清學反應為陰性（大多數(shù)直徑<3cm的CE1和部分CE4、CE5患者），所以這種情況進行患者隨訪和觀察非常必要。在AE血清學診斷中出現(xiàn)IgG抗體陽性，除了通過特征性影像進行診斷外，建議補充其他檢查（如腫瘤標志物）。

4小結

不管是囊型包蟲?。▓D2）還是泡型包蟲?。▓D3），在免疫學檢測中的方法和意義還留有很大空間，特別在早期診斷（病灶尚未形成前）和患者治療的預后、療效判斷上有著重要的研究意義。筆者也希望畜牧/獸醫(yī)部門和衛(wèi)生部門能夠通力合作，把包蟲病防控工作繼續(xù)向前推進。endprint