溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響

高春蕾,孫 萍,賈智慧,姜美潔,2,3,趙翠瓊,張學(xué)雷,2,3，吳振興，梁成珠

1 國(guó)家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061 2 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266061 3 國(guó)家海洋局海洋環(huán)境與科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266061 4 中國(guó)海洋大學(xué), 青島 266003 5 國(guó)家海洋局東海預(yù)報(bào)中心, 上海 200081 6 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，青島 266002

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溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響

高春蕾1,2,3,*,孫 萍1,2,3,4,賈智慧1,姜美潔1,2,3,趙翠瓊5,張學(xué)雷1,2,3，吳振興6，梁成珠6

1 國(guó)家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061 2 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266061 3 國(guó)家海洋局海洋環(huán)境與科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266061 4 中國(guó)海洋大學(xué), 青島 266003 5 國(guó)家海洋局東海預(yù)報(bào)中心, 上海 200081 6 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，青島 266002

網(wǎng)狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)是能夠形成有毒赤潮的海洋甲藻之一,所產(chǎn)毒素為蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs),該藻在全球很多海域中普遍存在,其生長(zhǎng)與產(chǎn)毒特征表現(xiàn)出較強(qiáng)的海域差異性。以分離自我國(guó)北黃海海域的網(wǎng)狀原角藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽(N、P)限制對(duì)該藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響。研究發(fā)現(xiàn)：溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒均有影響,但營(yíng)養(yǎng)鹽限制影響更為顯著。較低的溫度更適宜P.reticulatum的生長(zhǎng),15℃時(shí)無(wú)營(yíng)養(yǎng)鹽限制的L1-Si培養(yǎng)基中藻細(xì)胞生長(zhǎng)最好。營(yíng)養(yǎng)鹽限制尤其是P限制能夠顯著降低藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率和細(xì)胞密度(P<0.01),縮短藻細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的持續(xù)時(shí)間。所有溫度下N、P限制均有利于藻細(xì)胞內(nèi)毒素累積,15℃P限制培養(yǎng)基中單個(gè)藻細(xì)胞中YTX毒素最高,達(dá)到92.6 pg/細(xì)胞,分別是相同培養(yǎng)溫度下N限制和L1-Si中藻細(xì)胞毒素含量的3.8倍和7.1倍。溫度變化對(duì)N和P限制下藻細(xì)胞毒素含量影響不同：在5—15℃范圍內(nèi),隨溫度升高,N限制培養(yǎng)基中藻細(xì)胞YTX含量增幅逐漸下降,而P限制條件下反之。在所有培養(yǎng)條件下,濾液中毒素含量在穩(wěn)定期后開始增多,與L1-Si相比,N、P限制不利于毒素的釋放。高溫能促進(jìn)L1-Si培養(yǎng)基和N限制培養(yǎng)基中毒素的釋放,但對(duì)P限制影響不顯著。

網(wǎng)狀原角藻；營(yíng)養(yǎng)鹽限制；溫度；蝦夷扇貝毒素；北黃海

近年來(lái),有毒有害赤潮在全球很多海域中頻繁發(fā)生,對(duì)當(dāng)?shù)氐乃a(chǎn)養(yǎng)殖、旅游、人類健康和生命安全等造成了極大的危害。有毒赤潮的危害不僅取決于赤潮藻的生物量,還受到藻細(xì)胞毒素含量的影響。對(duì)于能夠形成有毒赤潮的甲藻,其生長(zhǎng)和產(chǎn)毒會(huì)受到許多因素的影響,其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、鹽度、光照等都是非常重要的影響因子。但環(huán)境因素對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響因藻種而異,相同環(huán)境條件下,不同的藻結(jié)果可能完全不同。

網(wǎng)狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)是廣泛分布于全球近岸海水中并能夠形成赤潮的有毒甲藻之一,是第一個(gè)被確認(rèn)產(chǎn)生蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs)的單細(xì)胞藻類[1],已在新西蘭[2- 4]、日本[5- 6]、挪威[7- 8]、意大利[9]、英國(guó)和加拿大[10]、西班牙和美國(guó)[11- 12]、德國(guó)[13]等國(guó)的近岸海水中分離到。該藻所產(chǎn)的蝦夷扇貝毒素是一類毒性較強(qiáng)的細(xì)胞毒素[14- 15],心臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞溶酶體、胸腺等都有可能是YTXs作用的靶器官[16]。貝類通過(guò)濾食藻細(xì)胞將YTXs在體內(nèi)累積轉(zhuǎn)化并沿食物鏈傳遞,對(duì)貝類消費(fèi)者及人類健康及生命安全造成了潛在的威脅。

目前對(duì)該藻的研究大多集中于其所產(chǎn)毒素的種類、結(jié)構(gòu)及毒素的檢測(cè)方法等,對(duì)于環(huán)境因子對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響的研究并不是太多。2001年,Seamer[17]最早開展了溫度、光照、鹽度、營(yíng)養(yǎng)鹽單因素變化對(duì)新西蘭海域的網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響研究；2004年,Mitrovic[18]等報(bào)道了微量元素Fe、Se和Co對(duì)相同海域中網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響；之后,Paz等[19]和Rodríguez等[20]分別報(bào)道了溫度、光照和鹽度及成倍提高L1-Si中大量營(yíng)養(yǎng)鹽(N、P)的濃度對(duì)西班牙海域的網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響；Guerrini[21]等以分離自意大利亞得里亞海的網(wǎng)狀原角藻為研究對(duì)象,研究了鹽度、溫度及營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)該藻產(chǎn)毒的影響； R?der等[13]報(bào)道了鹽度、溫度及營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)北海德國(guó)灣的網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響。通過(guò)分析已有的研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境因子會(huì)強(qiáng)烈影響藻細(xì)胞密度和藻毒素的種類與組成,但是由于采用了不同地理株系開展研究,很多情況下即使環(huán)境因子相同得到的結(jié)果卻不同甚至相互矛盾。可見,藻株生長(zhǎng)、YTXs合成及毒素組分的變異性與藻株的地理分布密切相關(guān)[5,8-9]。

我國(guó)也是有毒赤潮高發(fā)的國(guó)家之一,貝類中赤潮毒素沾染情況亦較嚴(yán)重,而YTXs毒素是近年來(lái)貝類中累積含量較高的毒素之一,如陳建華等從2011年采自北黃海海域的蝦夷扇貝樣品中檢測(cè)到的YTX毒素含量竟高達(dá)6.68×103μg/kg[22],大大超出了歐盟規(guī)定的安全食用標(biāo)準(zhǔn)(3750 μg/kg),嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的食用安全。2014年國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心梁玉波研究團(tuán)隊(duì)成功從北黃海海域分離純化到1株網(wǎng)狀原角藻,這也是目前國(guó)內(nèi)首次分離到產(chǎn)YTXs的網(wǎng)狀原角藻,為進(jìn)一步研究該藻生長(zhǎng)、產(chǎn)毒、赤潮發(fā)生發(fā)展及防控、毒素危害及致毒機(jī)理等提供了最基本的研究材料。

由于是首次在我國(guó)海域中分離到網(wǎng)狀原角藻,關(guān)于該株藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的相關(guān)信息尚為空白,加之近海貝類中YTXs污染情況嚴(yán)重,進(jìn)行相應(yīng)的研究就顯得非常迫切和必要。本研究以北黃海域的網(wǎng)狀原角藻為研究對(duì)象,選擇對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)毒影響比較顯著的兩個(gè)環(huán)境因子——溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽,研究不同溫度和N、P營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件下該藻的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒情況的變化,為更深入地了解該藻存在、大量繁殖與現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境因子之間的聯(lián)系,補(bǔ)充該藻的生理生態(tài)學(xué)相關(guān)信息,預(yù)防該藻赤潮爆發(fā)及海洋食品安全提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用網(wǎng)狀原角藻采自北黃海海域,經(jīng)分離純化而得。

藻種培養(yǎng)所用海水取自青島石老人海水浴場(chǎng),鹽度為31, pH為7.9±0.1,砂濾后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,轉(zhuǎn)移至三角瓶中高溫高壓(120℃, 0.12 MPA)滅菌冷卻至室溫,按比例加入除菌的無(wú)Si L1培養(yǎng)基(L1-Si)(Guillard和Hargraves, 1993)[23],于15℃,光照強(qiáng)度為90 μmol m-2s-1的恒溫恒濕的氣候室中培養(yǎng),光暗比為12h:12h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)中共設(shè)4個(gè)溫度梯度,分別為5、10、15、20℃；在每個(gè)溫度下再設(shè)3種培養(yǎng)基,分別為L(zhǎng)1-Si培養(yǎng)基、N限制 L1-Si培養(yǎng)基(N濃度為L(zhǎng)1-Si中的1/10,以下簡(jiǎn)稱為1/10N)、P限制 L1-Si培養(yǎng)基(P濃度為L(zhǎng)1-Si中的1/10,以下簡(jiǎn)稱為1/10P),共12種組合,每種組合設(shè)3個(gè)平行樣,試驗(yàn)周期為48 d。

在實(shí)驗(yàn)正式開始前,將網(wǎng)狀原角藻在相應(yīng)的溫度條件下馴化一個(gè)培養(yǎng)周期。

實(shí)驗(yàn)采用一次性培養(yǎng)的方法。將近岸海水經(jīng)過(guò)孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾并高溫滅菌后,按照不同的N、P濃度添加L1培養(yǎng)基各種營(yíng)養(yǎng)鹽儲(chǔ)備液(經(jīng)0.2 μm一次性無(wú)菌針頭濾器(?25 mm, Pall, USA)過(guò)濾除菌),配制成實(shí)驗(yàn)需要的3種培養(yǎng)基,并將配制好的培養(yǎng)基置于實(shí)驗(yàn)需要的不同培養(yǎng)溫度下進(jìn)行同步化。取經(jīng)馴化后的平臺(tái)期藻細(xì)胞進(jìn)行接種,初始接種密度均為500 個(gè)細(xì)胞/mL,培養(yǎng)體積均為1000 mL,置于GZX- 250BS-Ⅱ型光照培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械廠)內(nèi)培養(yǎng),光強(qiáng)為90 μmol m-2s-1,光暗周期為12h:12h。接種當(dāng)天取樣,之后每3 d取1次樣,時(shí)間為18：00點(diǎn),試驗(yàn)中所測(cè)參數(shù)之所需樣品的采集均同步進(jìn)行。

1.2.2 樣品采集、處理及分析

(1)藻細(xì)胞計(jì)數(shù)、形態(tài)觀察及比生長(zhǎng)速率計(jì)算

自接種日起每3d取1次樣,取樣前輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,使藻液充分混勻。取2 mL藻液,加入1% Lugol′s碘液固定,混勻后,用浮游植物計(jì)數(shù)板在TE2000倒置顯微鏡(Nikon, Japan)下計(jì)數(shù),同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

藻的比生長(zhǎng)速率按以下公式計(jì)算：比生長(zhǎng)速率(μ)=(lnN1-lnN0)/ (t1-t0), 式中μ為比生長(zhǎng)速率(d-1),N0和N1分別為t0和t1時(shí)間的細(xì)胞密度。

(2) 毒素提取與分析

藻毒素提取 取20 mL藻液,低真空度抽濾至GF/F膜(?25 mm, WhatmanTM, UK),同時(shí)收集濾液用于胞外毒素分析。將帶有藻細(xì)胞的濾膜剪碎后,用4mL 80%的甲醇冰浴中超聲破碎,反復(fù)鏡檢,直至細(xì)胞全部破碎。4℃,6500 r/min離心10 min,收集上清；重復(fù)提取1次,合并兩次的上清液,80%甲醇定容至10 mL。用0.22 μm的尼龍膜(?13 mm,艾杰爾,北京)過(guò)濾,濾液置于-20℃保存至分析。

胞外毒素提取 根據(jù)Paz 等[12]的方法并稍作調(diào)整收集濾液中的毒素。具體洗脫步驟為：依次用10 mL 70%甲醇和10 mL 20%的甲醇平衡固相萃取(SPE)小柱后,將20 mL濾液上樣到SPE小柱；用10 mL 20%的甲醇洗脫SPE小柱,棄掉洗脫液；之后,用10 mL 70%的甲醇洗脫SPE小柱,收集洗脫液,用0.22 μm的尼龍膜過(guò)濾,濾液置于-20℃保存至分析。

毒素的分析檢測(cè) 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法進(jìn)行藻毒素和胞外毒素的檢測(cè)。液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)為Agilent1200液相系統(tǒng)(包括G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A柱溫箱)；API4000三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(Applied Biosystems GmbH, Germany),離子源為ESI電噴霧離子源；液相色譜柱為Phenomenex RP C18柱(150×3.0mm, 5μm)。

液相色譜條件 流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨),流動(dòng)相B為95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)；流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積10 μL,柱溫30℃,梯度洗脫程序如表 1所示。質(zhì)譜檢測(cè)條件 采用ESI+/-切換多參數(shù)掃描方式(MRM),各項(xiàng)參數(shù)見表 2和表3 。

表1 液相梯度洗脫程序

A: 水(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨);B: 95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)(正離子模式)

Q1 Mass: 四級(jí)桿質(zhì)譜1 Quadrupole mass 1; Q3 Mass: 四級(jí)桿質(zhì)譜3 Quadrupole mass 3; DP: 去簇電壓Declustering potential；EP:射入電壓Entrance potential; CE: 碰撞電壓Collision energy；CXP：碰撞室出口電壓Cell exit potential

表3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)(負(fù)離子模式)

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 13統(tǒng)計(jì)軟件分別進(jìn)行方差的單變量分析和多重比較分析,分析不同溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)及產(chǎn)毒是否具有顯著影響。設(shè)定α=0.05,數(shù)據(jù)以M±S.D.表示(n=3)。當(dāng)P<0.05時(shí)具有顯著性差異,P<0.01時(shí)具有極顯著差異。另外,利用Origin 9.0作圖軟件進(jìn)行作圖分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)的影響

根據(jù)圖1和圖2,溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制均對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)有影響,但影響的程度與細(xì)胞生長(zhǎng)階段不同。

圖1 不同溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽條件下網(wǎng)狀原角藻的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth curves of P. reticulatum cultured at different temperature and nutrient levels

圖2 不同溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽條件下網(wǎng)狀原角藻比生長(zhǎng)速率的變化Fig.2 Changes of specific growth rate of P. reticulatum in the exponential phase at different temperature and nutrient levels

在所有溫度條件下,網(wǎng)狀原角藻均在L1-Si培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好,最大細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率也出現(xiàn)在該培養(yǎng)基中, P限制則顯著抑制藻的生長(zhǎng)。以15℃為例,P限制培養(yǎng)基中最大細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率分別為0.47×107個(gè)細(xì)胞/L和0.132 d-1,僅為L(zhǎng)1-Si的一半,差異極顯著(P<0.01)；另外,P限制明顯縮短了藻細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期,與L1-Si培養(yǎng)基相比至少提前6d結(jié)束指數(shù)生長(zhǎng)期；N限制明顯縮短了穩(wěn)定期的持續(xù)時(shí)間,對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期藻細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。

溫度的影響主要體現(xiàn)在L1-Si和N限制培養(yǎng)基中藻細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期階段,在此階段藻細(xì)胞的生長(zhǎng)基本與溫度變化呈正相關(guān),高溫區(qū)(15℃和20℃)和低溫區(qū)(5℃和10℃)之間細(xì)胞密度差異顯著(P<0.05)。但在P限制培養(yǎng)基中,5—15℃范圍內(nèi)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)與溫度變化呈負(fù)相關(guān)。指數(shù)生長(zhǎng)期后,溫度的影響在營(yíng)養(yǎng)鹽限制的培養(yǎng)基中變得不明顯,藻細(xì)胞密度均開始下降并快速進(jìn)入衰敗期；20℃L1-Si培養(yǎng)基中藻細(xì)胞也表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)情況,但其余溫度下藻細(xì)胞在經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的穩(wěn)定期后密度又出現(xiàn)“返增”現(xiàn)象。

2.2 溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻產(chǎn)毒的影響

2.2.1 溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX含量的影響

HPLC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),網(wǎng)狀原角藻主要產(chǎn)YTX及少量YTX衍生物,其中YTX占到96%,所以本實(shí)驗(yàn)中主要以YTX含量的變化來(lái)考察溫度和N、P限制對(duì)其產(chǎn)毒的影響。

研究發(fā)現(xiàn),在所有培養(yǎng)條件下,網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX含量隨著藻細(xì)胞的生長(zhǎng)階段有著相同的變化的趨勢(shì)：指數(shù)生長(zhǎng)期藻細(xì)胞內(nèi)YTX含量較穩(wěn)定,從指數(shù)生長(zhǎng)期后期開始,胞內(nèi)YTX濃度開始急劇增加,穩(wěn)定期末期時(shí)達(dá)到最高,之后開始下降。

與無(wú)營(yíng)養(yǎng)鹽限制相比,N、P限制能顯著提高網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX的含量。1/10N培養(yǎng)基中,從指數(shù)生長(zhǎng)期后期或穩(wěn)定期前期,各溫度下胞內(nèi)YTX含量開始明顯升高,但增幅與溫度變化呈負(fù)相關(guān)：5℃時(shí)YTX含量最高,約為30 pg/細(xì)胞,15℃和20℃時(shí)毒素含量降低到20 pg/細(xì)胞左右；1/10P培養(yǎng)基中,從指數(shù)生長(zhǎng)期的中期開始,胞內(nèi)YTX含量就開始升高,略早于L1-Si和1/10N培養(yǎng)基。在5—15℃范圍內(nèi),胞內(nèi)YTX毒素含量隨溫度升高而升高,20℃時(shí),毒素含量開始下降,其中15℃時(shí)穩(wěn)定期末期單個(gè)藻細(xì)胞中YTX毒素含量最高,達(dá)到92.6 pg/細(xì)胞,顯著高于其余3個(gè)溫度(P<0.01)(圖3)。

圖3 不同溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽條件下網(wǎng)狀原角藻胞內(nèi)YTX濃度變化情況Fig.3 Changes of intracellular YTX concentration of P. reticulatum at different temperature and nutrient levels

2.2.2 溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻胞外YTX含量的影響

圖4 不同溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽條件下指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期濾液中YTX毒素的細(xì)胞配比Fig.4 Percentage of YTX in the media filtrates of P. reticulatum in the exponential and the stationary phase respectively at different temperature and nutrient levels

濾液中的YTX毒素主要來(lái)源于藻細(xì)胞正常代謝分泌和死亡細(xì)胞的釋放而來(lái)。指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期細(xì)胞死亡較少,濾液中的毒素主要來(lái)源于藻細(xì)胞的代謝分泌,而穩(wěn)定期以后細(xì)胞逐漸衰敗死亡,胞內(nèi)大量毒素釋放。為了客觀地評(píng)價(jià)溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻胞外YTX毒素含量的影響,本研究只比較指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期濾液中毒素含量的變化。為了便于胞內(nèi)和胞外毒素進(jìn)行比較,根據(jù)測(cè)定的濾液中毒素的濃度及相應(yīng)的細(xì)胞密度,將濾液中YTX毒素折算成單細(xì)胞濃度,從而比較胞內(nèi)和胞外毒素的細(xì)胞配額的變化。

從圖4可以看出,在所有培養(yǎng)條件下及各個(gè)不同的生長(zhǎng)階段,濾液中YTX毒素的濃度均很低。不論是指數(shù)生長(zhǎng)期還是穩(wěn)定期,L1-Si培養(yǎng)基濾液中YTX毒素含量顯著高于N和P限制下濾液中YTX毒素含量(P<0.01),且隨溫度升高明顯升高； N 和P限制均不利于YTX的釋放,高溫能加劇N限制下YTX毒素的釋放,但對(duì)P限制無(wú)顯著影響。

3 討論

3.1 溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)的影響

溫度是影響赤潮生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝等的重要環(huán)境因子,也是赤潮爆發(fā)的關(guān)鍵影響因子之一。每種赤潮生物都有自己生存的最適生長(zhǎng)溫度和溫度范圍。本研究中采用的網(wǎng)狀原角藻是2014年5月首次分離自我國(guó)的北黃海海域,當(dāng)時(shí)該藻以較高密度存在于5 m以淺的表層海水中,海水表層溫度在15℃左右。而本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在20℃的L1-Si培養(yǎng)基中,藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)藻細(xì)胞密度最高,分別為0.256 d-1和1.1×107/L-1,比15℃時(shí)略高(分別為0.252 d-1和1.04×107/L-1)；但在20℃時(shí),藻細(xì)胞在指數(shù)期結(jié)束后很快就進(jìn)入衰退期,藻細(xì)胞密度降為原來(lái)的70%；而15℃條件下,藻細(xì)胞在經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的穩(wěn)定期后細(xì)胞密度又開始增加。另外,在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn),20℃培養(yǎng)時(shí),藻細(xì)胞的生長(zhǎng)周期比低溫度條件下短,25℃培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞密度很低,且藻細(xì)胞嚴(yán)重變形；而30℃時(shí)在接種后的較短時(shí)間內(nèi)藻細(xì)胞即死亡(預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,未顯示),可見,該株藻適宜在較低溫度下生長(zhǎng)。Guerrini等[18]和R?der等[13]分別以分離自意大利和德國(guó)近岸海域的網(wǎng)狀原角藻進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)20℃和15℃分別是上述兩株藻的最適生長(zhǎng)溫度。Koike等[24]在對(duì)日本北部Okkirai Bay水體中網(wǎng)狀原角藻種群的季節(jié)變化進(jìn)行了1周年的調(diào)查后發(fā)現(xiàn),溫度在8.23—19.99℃范圍內(nèi),水體中能夠檢測(cè)到網(wǎng)狀原角藻細(xì)胞,形成赤潮并且細(xì)胞密度達(dá)到峰值時(shí)水溫在14.3—16.53℃之間。在我國(guó)北黃海海域分離到的網(wǎng)狀原角藻與上述研究中的藻株的適宜生長(zhǎng)溫度非常接近,推測(cè)其在北黃海海域大量增殖并引發(fā)赤潮最有可能是在春末夏初季節(jié),這與現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)果也一致。Okolodkov等[25]在通過(guò)分析1976—1999年期間歐亞北極地區(qū)的28次調(diào)查(539個(gè)站位,1810個(gè)樣品)的數(shù)據(jù)和500多篇相關(guān)文獻(xiàn)后得出:網(wǎng)狀原角藻分布范圍大致在25—0℃等溫線之間,主要分布在15℃等溫線附近海域。上述研究結(jié)果也解釋了為什么在熱帶海域較少發(fā)生該藻赤潮[24, 26- 27]。

水體中氮、磷的種類、組成和含量不僅對(duì)赤潮生物的生長(zhǎng)、生理生化過(guò)程有著重要的影響,而且對(duì)赤潮形成的規(guī)模和程度也起著決定性的作用。

本研究結(jié)果表明,網(wǎng)狀原角藻的生長(zhǎng)更多地受P限制的影響而不是N限制,藻細(xì)胞大量增殖時(shí)對(duì)P的需求較大,當(dāng)環(huán)境中P的濃度比較低時(shí),P可能成為網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)的限制因子。這與Guerrini等[18]和R?der等[13]對(duì)網(wǎng)狀原甲藻的研究結(jié)果相同,也與其他許多產(chǎn)腹瀉性貝毒[28-29]和麻痹性貝毒[30-1]的甲藻中的研究結(jié)果相同。另外,Rodríguez等[21]開展的網(wǎng)狀原角藻對(duì)大量營(yíng)養(yǎng)鹽需求的研究結(jié)果也間接證實(shí)了上述結(jié)論。他們發(fā)現(xiàn),L1培養(yǎng)基中P的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)的需要,當(dāng)P的濃度增加到217 μmol/L(6×L1)時(shí)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和生物量達(dá)到最大,超過(guò)此濃度藻細(xì)胞的生長(zhǎng)才會(huì)受到抑制；而N在882 μmol/L(1×L1)—8824 μmol/L(10×L1)濃度范圍內(nèi)對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響,本研究中將N濃度降低至88.2 μmol/L(1/10×L1)時(shí),對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)影響也不顯著,推測(cè)該藻對(duì)N濃度的改變不敏感。但是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果外推現(xiàn)場(chǎng)中藻的生長(zhǎng)狀況是很難的,即便是現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的結(jié)果,也很難得出確切的結(jié)論,如Koike等[24]在現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的N和P濃度與網(wǎng)狀原角藻的爆發(fā)性增殖之間的沒有相關(guān)性,網(wǎng)狀原角藻赤潮發(fā)生前后水體中N和P的濃度始終處于較低的濃度水平。

研究中還發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定期后期,L1-Si培養(yǎng)基中藻細(xì)胞密度卻出現(xiàn)明顯的返增現(xiàn)象,這可能是取樣后期培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液體積減少,空氣增多,細(xì)胞周圍氣體不斷更新和交換,加之L1-Si培養(yǎng)基中N、P營(yíng)養(yǎng)鹽本身就過(guò)量,培養(yǎng)后期仍有剩余,幾種因素共同促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。由于本研究并未對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)鹽的變化進(jìn)行檢測(cè),所以L1-Si培養(yǎng)基中藻細(xì)胞密度在衰敗期返增現(xiàn)象的具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

3.2 溫度和N、P限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻產(chǎn)毒的影響

溫度對(duì)有毒甲藻產(chǎn)毒能力的影響存在明顯的種間差異,即使是同一種甲藻,不同地理株系間產(chǎn)毒情況也不完全相同。本研究中,在無(wú)營(yíng)養(yǎng)鹽限制的L1-Si培養(yǎng)基中,溫度對(duì)網(wǎng)狀原角藻的產(chǎn)毒能力影響不大。這與Manuel[32]研究分離自格陵蘭島附近海域的網(wǎng)狀原角藻產(chǎn)YTX的能力隨溫度變化情況相一致；而R?der等[13]的研究表明分離自德國(guó)北海灣的網(wǎng)狀原角藻在低溫下產(chǎn)YTX的能力更強(qiáng)；另外,Guerrini等[18]研究卻發(fā)現(xiàn),在較高溫度(26℃)下,分離自意大利海域的網(wǎng)狀原角藻能夠產(chǎn)生更多的YTX。但是,溫度對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒的影響在有營(yíng)養(yǎng)鹽限制或不足時(shí)變得比較顯著,這可能是營(yíng)養(yǎng)鹽限制使毒素合成過(guò)程中某些酶的活性對(duì)溫度更加敏感,從而直接或間接影響毒素的合成。

有研究表明,在營(yíng)養(yǎng)平衡的條件下,藻類產(chǎn)毒量往往較低；而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)失衡,尤其是在低磷濃度的條件下,能夠刺激藻類產(chǎn)毒增加,高濃度溶解無(wú)機(jī)磷,往往不利于毒素的蓄積[33],本研究結(jié)果也支持上述觀點(diǎn)。在15℃ P限制培養(yǎng)基中穩(wěn)定期的藻細(xì)胞中YTX含量最高,達(dá)到92.6 pg/細(xì)胞,是同一溫度相同生長(zhǎng)階段L1-Si培養(yǎng)基中的7倍有余。由于P限制情況下,細(xì)胞密度顯著降低而細(xì)胞體積變大,如果以單位體積培養(yǎng)液來(lái)衡量毒素含量的變化,那么磷限制對(duì)毒素合成的影響就明顯削弱了,類似的結(jié)果在以往對(duì)亞歷山大藻的研究中已被多次報(bào)道[34-37]。盡管如此,P限制下單位體積培養(yǎng)液中YTX的含量仍是營(yíng)養(yǎng)鹽平衡條件下的1.5—2倍。

甲藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的能力比其它藻類差,在營(yíng)養(yǎng)限制條件下,甲藻的競(jìng)爭(zhēng)能力會(huì)比其他硅藻和無(wú)毒甲藻差[38],而毒素的產(chǎn)生可能是其對(duì)低營(yíng)養(yǎng)利用率的一種補(bǔ)償性競(jìng)爭(zhēng)策略[39],可以作為對(duì)攝食浮游藻類生物的威懾,防止被攝食；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)不平衡時(shí),毒素作為營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存化合物,也可以減輕某些過(guò)剩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)藻造成的不利影響[34, 40]。YTX為多環(huán)聚醚類化合物,其分子中不含N、P原子,營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)其合成的影響可能是通過(guò)直接或間接影響與YTX合成相關(guān)酶及相關(guān)中間產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)穩(wěn)定性同位素投喂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),YTX分子中碳骨架結(jié)構(gòu)起源于聚酮類化合物(polyketides)[41],而聚酮類化合物碳鏈的組裝在一定程度上與脂肪酸的合成相關(guān)[42]。根據(jù)以上推測(cè),當(dāng)N、P限制時(shí),YTX毒素的合成可能與網(wǎng)狀原角藻細(xì)胞的脂肪酸代謝有關(guān),但這需要實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

關(guān)于濾液中YTX的含量,Guerrini等[18]與Paz等[11]均認(rèn)為濾液中檢測(cè)到的YTX是由細(xì)胞死亡后釋放到培養(yǎng)基中導(dǎo)致的。本研究的結(jié)果也基本與上述觀點(diǎn)一致,高溫及穩(wěn)定期中后期后死亡細(xì)胞增多,濾液中的YTX濃度升高。但本研究中,無(wú)論在什么培養(yǎng)條件下,整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,只有很少一部分YTX釋放到濾液中,這與R?der等[13]對(duì)分離自德國(guó)北海的網(wǎng)狀原角藻在N限制下釋放43%的YTX毒素到濾液中的研究結(jié)果不同,這可能由于不同株系、不同培養(yǎng)條件及檢測(cè)方法等不同所導(dǎo)致。

4 結(jié)論

溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒均有影響,其中營(yíng)養(yǎng)鹽的影響更為顯著和強(qiáng)烈。

本研究中,網(wǎng)狀原角藻在15℃L1-Si培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好；N、P限制均有利于YTX毒素的合成和累積,15℃時(shí)P限制培養(yǎng)基中胞內(nèi)YTX含量最高。

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Effects of temperature and nutrient limitation on growth and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum

GAO Chunlei1, 2, 3,*, SUN Ping1, 2, 3,4, JIA Zhihui1, JIANG Meijie1, 2, 3, ZHAO Cuiqiong5, ZHANG Xuelei1, 2, 3，WU Zhenxing6，LIANG Chengzhu6

1FirstInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China2LaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalScience,Qingdao;NationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao266061,China3KeyLaboratoryofMarineEcologicalEnvironmentalScienceandEngineering,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China4OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China5EastChinaSeaForecastCenter,StateOceanicAdministration,Shanghai200081,China6InspectionandQuarantinetechnologyCenterofShandongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266002，China

Protoceratiumreticulatum,a marine dinoflagellate that produces yessotoxins (YTXs), is common in coastal waters worldwide and can form toxic algal blooms. There are marked differences in its growth and toxin-producing characteristics in different areas. This study investigated the effects of temperature and nutrient (N, P) limitation on the growth and toxin production ofP.reticulatumrecently isolated from the North Yellow Sea. The results showed that temperature and nutrient limitation affected growth and toxin production of the alga to different degrees, but nutrient limitation had a more significant influence. Lower temperatures were more suitable for the growth ofP.reticulatum. Growth of algal cells in L1-Si medium without nutrient limitation was best at 15℃. P limitation greatly reduced the specific growth rate and cell density (P< 0.01), and shortened the duration of the exponential and stationary phases. N-limited cultures, in contrast, resulted in a growth rate and maximum cell density similar to those in L1-Si medium, but with a shorter stationary phase. At all temperatures, both N and P limitation were favorable for the accumulation of YTX in algal cells, which was particularly marked in the latter. The maximum YTX content of 92.6pg/cell was observed in 1/10P medium at 15℃ at the end of the stationary phase. This was approximately 3.8 times and 7.1 times that of the YTX in the N limited and L1-Si medium at the same culture temperature, respectively. Changes in temperature had different influences on the content of intracellular YTX in N- and P-limitation cultures. In the range of 5—15℃, temperature change had a negative effect on YTX increase under N limitation, whereas in P-limited medium, the effect was positive. In all culture conditions, the YTX concentration in the filtrate began to increase during the stationary phase. Compared with L1-Si, both N- and P-limited media were not conducive to the release of toxins. Higher temperature helpful to YTX release in the L1-Si and N-limited media, but it did not significantly affect that in the P-limited medium.

Protoceratiumreticulatum; nutrient limitation; temperature; yessotoxin (YTX); North Yellow Sea

國(guó)家自然科學(xué)基金(41206161)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201305010)；國(guó)家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2012T08, GY2013G28)；國(guó)家基金委-山東省聯(lián)合基金項(xiàng)目“海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)”(U1406403)；青島市創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目計(jì)劃(13-CX-28)

2016- 05- 20;

2017- 01- 16

10.5846/stxb201605200974

*通訊作者Corresponding author.E-mail: gaochunlei@fio.org.cn

高春蕾,孫萍,賈智慧,姜美潔,趙翠瓊,張學(xué)雷，吳振興，梁成珠.溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽限制對(duì)網(wǎng)狀原角藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(12):4217- 4226.

Gao C L, Sun P, Jia Z H, Jiang M J, Zhao C Q, Zhang X L,Wu Z X，Liang C Z.Effects of temperature and nutrient limitation on growth and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4217- 4226.