以菊粉為底物全細胞催化生產(chǎn)甘露醇

羅 希， 曹 海 龍， 張 卉 妍， 李 悝 悝， 張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034；2.中國科學院大連化學物理研究所， 遼寧 大連 116023 )

以菊粉為底物全細胞催化生產(chǎn)甘露醇

羅 希1， 曹 海 龍2， 張 卉 妍2， 李 悝 悝2， 張 春 枝1

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034；2.中國科學院大連化學物理研究所， 遼寧 大連 116023 )

將Leuconostocmesenteroides來源的甘露醇脫氫酶(mdh)及Mycobacteriumvaccae來源的甲酸脫氫酶(fdh)的共表達載體pRSFDuet-mdh-fdh，與葡萄糖輔助蛋白(glf)的表達載體pZY507glf共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，成功構(gòu)建了一個可將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇的全細胞催化劑E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf。該全細胞催化劑在pH 6.5、溫度30 ℃時，具有最高的轉(zhuǎn)化效率，甘露醇的產(chǎn)率可達到0.91 g/g。通過與高活力的菊粉酶協(xié)同作用，甘露醇的產(chǎn)率可達到0.93 g/g。

甘露醇；生物轉(zhuǎn)化法；菊粉；全細胞催化

0 引 言

甘露醇是一種六元糖醇，在醫(yī)藥、食品、化工和輕工等領域具有十分廣泛的應用[1-3]。目前，甘露醇的生產(chǎn)方法有海帶提取法和化學催化法。其中，海帶提取法生產(chǎn)甘露醇的能耗較高，對環(huán)境污染較大，正逐漸被淘汰；化學催化法是目前工業(yè)上普遍采用的甘露醇生產(chǎn)方法，但由于其生產(chǎn)過程副產(chǎn)大量山梨醇，導致甘露醇的分離成本高昂。因此，開發(fā)一種高效、綠色及低成本的甘露醇生產(chǎn)方法具有非常重要的意義。

近年來，利用微生物轉(zhuǎn)化法進行甘露醇生成的研究備受重視[4]。全細胞催化是介于發(fā)酵法和提取酶催化法之間的一種生物催化技術(shù)[5]。Kaup等[6-7]帶領的團隊是最早開展全細胞催化合成甘露醇研究的團隊之一。他們運用基因工程的方法，將異源的NADH依賴型的甘露醇脫氫酶和NAD+依賴型甲酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，建立了一個可利用果糖和甲酸作為底物生產(chǎn)甘露醇的全細胞催化劑。該方法不僅利用細胞自身產(chǎn)生的輔酶，且輔酶可再生，因而兼具反應高效特異及過程經(jīng)濟的特點[8]。此后，Carsten等[9]成功在谷氨酸棒狀桿菌中建立了生產(chǎn)甘露醇的全細胞催化系統(tǒng)。由于大腸桿菌內(nèi)全細胞催化轉(zhuǎn)化出現(xiàn)輔因子丟失現(xiàn)象，F(xiàn)lorian等[10]優(yōu)化了甘露醇脫氫酶基因，生產(chǎn)甘露醇的能力提高20%。此外，利用磷酸鹽和亞磷酸鹽為大腸桿菌內(nèi)的全細胞催化提供輔酶，轉(zhuǎn)化糖類生產(chǎn)甘露醇的研究也取得了一定的進展[11-13]。

菊粉在菊粉酶的作用下，可水解生成大量的果糖和少量的葡萄糖，是生產(chǎn)制備甘露醇的理想原料[14-15]。利用菊芋中的菊粉進行化學品及燃料的生產(chǎn)已有廣泛的研究報道[16-17]。目前尚未有利用菊芋中的菊粉為原料，利用全細胞催化劑生產(chǎn)甘露醇的研究報道。本實驗建立了一個利用菊粉為原料，通過全細胞催化進行甘露醇的生產(chǎn)的研究方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株質(zhì)粒、培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

大腸桿菌BL21(DE3)，實驗室保存；共表達載體pRSFDuet、載體pMcFDH(含MycobacteriumvaccaeN10來源的甲酸脫氫酶基因fdh)、質(zhì)粒pZY507glf(含運動發(fā)酵單胞菌來源的葡萄糖輔助蛋白)均由中國科學院大連化學物理研究所提供。實驗所用菌株及質(zhì)粒見表1。

表1 大腸桿菌菌株及質(zhì)粒

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，固體培養(yǎng)時加2%瓊脂。轉(zhuǎn)化時加入50 μg/mL卡那霉素(用于篩選pRSFDuet-fdh-mdh質(zhì)粒)，25 μg/mL氯霉素(用于篩選pZY507glf質(zhì)粒)。挑取構(gòu)建的菌株平板單菌落至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入卡那霉素，37 ℃、200 r/min振蕩過夜。吸取1 mL轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基中，加入卡那霉素(含質(zhì)粒pZY507glf時加入氯霉素)培養(yǎng)至OD600為0.5左右，加入0.02 mmol/L IPTG 25 ℃誘導12 h。

1.1.2 試劑與儀器

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，普通質(zhì)粒小提試劑盒，DNA相對分子質(zhì)量標準Marker，6×溴酚藍，限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，瓊脂糖，卡那霉素，氯霉素，菊粉酶，胰化蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，輔酶Ⅰ，還原型輔酶Ⅰ，巰基乙醇，葡萄糖，果糖，甘露醇，甲酸鈉，菊粉等。

TC412 PCR，英國Techne公司；DYCP-31核酸電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；ICS 3000高效液相色譜系統(tǒng)，美國ESA公司；354酶標儀，美國賽默飛世爾公司；1645050蛋白電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；BIOF 6005A GBN微生物發(fā)酵罐，上海高機生物工程有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 甘露醇脫氫酶表達載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中公布的Leuconostocmesenteroide甘露醇脫氫酶基因(mdh)序列，委托蘇州金維智公司對mdh進行了密碼子優(yōu)化及全基因合成，并插入到pRSFDuet載體上的NcoⅠ和BamHⅠ位點上，構(gòu)建了甘露醇脫氫酶表達載體pRSFDuet-mdh。

1.2.2 甲酸脫氫酶和甘露醇脫氫酶共表達載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pMcFDH為模板，利用上游引物5′-CTACATATGGCAAAGGTCCTGTG-3′ 及下游引物5′-ATAGGTACCTCAGACCGCCTTCT-TGAACTTG-3′對甲酸脫氫酶基因fdh進行克隆。利用NdeⅠ和KpnⅠ酶切位點，將克隆出的fdh基因插入到pRSFDuet-mdh質(zhì)粒載體上，構(gòu)建出pRSFDuet-mdh-fdh表達載體。

1.2.3 全細胞催化劑菌株的構(gòu)建

將質(zhì)粒pRSFDuet-mdh-fdh和質(zhì)粒pZY507glf(葡萄糖輔助蛋白基因)共轉(zhuǎn)入BL21(DE3) 感受態(tài)細胞中，利用具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB固體平板進行培養(yǎng)，并將構(gòu)建出的含有兩個質(zhì)粒的菌株命名為菌株Ⅰ。

1.2.4 相關酶活力的測定

1.2.4.1 甘露醇脫氫酶酶活力測定

0.2 mol/L還原型輔酶Ⅰ，0.2 mol/L D-果糖，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，于1 mL體系。在25 ℃條件下，在340 nm波長下每10 s測量NADH的吸光度，記錄90 s。以此吸光度的變化率與酶的相關性確定酶活力。一個酶活力單位(U)定義:在pH 6.0條件下，1 min氧化1 μmol NADH的酶量。

1.2.4.2 甲酸脫氫酶酶活力測定

0.2 mol/L甲酸鈉，0.2 mol/L輔酶Ⅰ，0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液pH 7.0，于1 mL體系。在340 nm波長下每10 s測量NADH的吸光度，記錄90 s。以此吸光度的變化率與酶的相關性來確定酶活力。一個酶活力單位(U)定義為：在pH 7.0條件下，1 min氧化1 μmol NAD+的酶量。

1.2.4.3 菊粉酶的酶活力測定

在pH 6.5、30 ℃條件下，每1 min水解菊粉產(chǎn)生1 μmol果糖所需的酶量為一個酶活單位[18-19]。測定540 nm波長處的吸光度。

1.2.5 全細胞催化實驗

轉(zhuǎn)化緩沖液pH：誘導條件為25 ℃，時間為12 h，分別優(yōu)化轉(zhuǎn)化pH 5.5、6.0、6.5、7.0，轉(zhuǎn)化底物為0.1 mol/L果糖和甲酸鈉。用甲酸控制pH，4 h取一次樣液，反應48 h。通過HPLC檢測分析轉(zhuǎn)化的底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物濃度。

轉(zhuǎn)化溫度：在pH 6.5條件下，分別優(yōu)化轉(zhuǎn)化溫度25、30、35、40 ℃。反應過程同上。

在pH為6.5、溫度為30 ℃條件下，分別添加15和30 U/mL外源菊粉酶，考察其對甘露醇產(chǎn)率的影響。反應過程同上。

1.2.6 液相分析產(chǎn)物

轉(zhuǎn)化反應中轉(zhuǎn)化底物的量及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物甘露醇的量用HPLC的方法測定。轉(zhuǎn)化反應液稀釋后，用0.22 μm濾膜過濾后即可上樣，上樣量為20 μL。色譜柱為“DIONEX”CarboPacTMPA10(4 mm×250 mm)型陰離子交換柱，流動相為18 mmol/L NaOH，柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min。檢測器為脈沖安培電化學檢測器。采用外標法繪制標準曲線對轉(zhuǎn)化體系中的底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物進行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘露醇脫氫酶基因與甲酸脫氫酶基因共表達載體的構(gòu)建

根據(jù)Leuconostocmesenteroides來源的甘露醇脫氫酶序列(WP_011679419.1)，基于密碼子偏好性對其進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的序列見圖1。圖1中，粗體部分為mdh基因ORF序列，下劃線部分為酶切位點。將優(yōu)化后的序列交由蘇州金唯智公司進行了全基因合成，并將合成后的序列插入到pRSFDuet載體的NcoⅠ和BamHⅠ位點上，獲得了載體pRSFDuet-mdh。

圖1 密碼子優(yōu)化后的甘露醇脫氫酶序列

根據(jù)pMcFDH載體上的甲酸脫氫酶序列，對甲酸脫氫酶基因進行克隆，電泳檢測結(jié)果見圖2。將該序列和質(zhì)粒pRSFDuet-mdh用NdeⅠ和KpnⅠ進行雙酶切并經(jīng)膠回收純化后，利用T4 DNA連接酶連接，得到pRSFDuet-mdh-fdh載體，如圖3所示。

M，BM 15 000 DNA marker； 1，fdh PCR產(chǎn)物

2.2 全細胞催化劑的構(gòu)建

將測序正確的重組質(zhì)粒和質(zhì)粒pZY507glf共同轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中異源表達，通過SDS-PAGE分析目標蛋白的表達情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，菌株E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf經(jīng)過0.02 mmol/L IPTG誘導后，在36和40 ku處有特異性條帶，與目的蛋白甘露醇脫氫酶和甲酸脫氫酶大小相符。由此可見，該蛋白為誘導表達的重組蛋白。

圖3 mdh和fdh共表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

M，PageRuler prestained protein ladder；1，誘導破壁后上清液；2，未誘導全菌；3，誘導破壁后沉淀

圖4 菌株E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf的表達

Fig.4 Expression ofE.coliBL21(DE3)/ pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf

對表達的菌株進行酶活力測定，得到甘露醇脫氫酶酶活為5.13 U/mg，甲酸脫氫酶酶活力為5.97 U/mg。

2.3 全細胞催化反應條件優(yōu)化

以果糖為底物，按“1.2.5”的方法，分別考察不同pH和溫度對甘露醇合成效率的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，pH 6.5、30 ℃分別為該催化反應的最適pH和反應溫度。

表2 不同pH和溫度條件下果糖全細胞催化轉(zhuǎn)化甘露醇的產(chǎn)率

Tab.2 Conversion yields of D-fructose to D-mannitol by whole cell biotransformations at different pH and temperature

pH產(chǎn)率/(g·g-1)θ/℃產(chǎn)率/(g·g-1)5．50．56250．71±0．016．00．80±0．09300．916．50．91350．57±0．047．00．80±0．02400．25±0．01

2.4 外源添加菊粉酶對甘露醇產(chǎn)率的影響

以菊粉為底物，外源添加菊粉酶，添加量分別為15和30 U/mL，制備甘露醇。在pH 6.5、30 ℃ 條件下反應48 h，每4 h取樣，結(jié)果如圖5所示。

(a) 添加15 U/mL菊粉酶

(b) 添加30 U/mL菊粉酶

圖5 外源添加菊粉酶對甘露醇產(chǎn)率的影響

Fig.5 Biotransformations of inulin to D-mannitol with extracellular inulinase supplementation

由圖5可知，在反應體系中加入兩種用量菊粉酶后，果糖和葡萄糖的濃度在4 h后大幅提高，表明菊粉被快速水解；但反應進行到8 h，圖5(b) 中果糖濃度進一步提高，而圖5(a)中果糖濃度則有所降低，表明15 U/mL菊粉酶添加量不能滿足體系中菊粉的完全水解。當反應進行到48 h，兩種不同菊粉酶添加量反應均有一定量的果糖剩余，此時甘露醇的產(chǎn)率分別為0.78和0.93 g/g。

3 結(jié) 論

本實驗構(gòu)建了質(zhì)粒pRSFDuet-mdh-fdh，與pZY507glf共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)成功表達。利用構(gòu)建的全細胞催化劑E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf，以果糖為底物，在不同溫度及pH條件下進行全細胞催化實驗，得到了最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。通過與高活力的菊粉酶協(xié)同，實現(xiàn)了以菊粉為底物利用全細胞催化進行甘露醇的合成，在菊粉酶添加量為30 U/mL時甘露醇的產(chǎn)率可達到0.93 g/g。本實驗的研究結(jié)果拓寬了全細胞催化合成甘露醇路線的底物范圍，為建立以能源植物菊芋中的菊粉為底物實現(xiàn)甘露醇的高效合成提供了參考。

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The whole cell catalytic production of mannitol using inulin as substrate

LUO Xi1, CAO Hailong2, ZHANG Huiyan2, LI Kuikui2, ZHANG Chunzhi1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China )

A whole-cell biotransformation systemE.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glffor mannitol production were established through the mannitol dehydrogenase (mdh) derived fromLeuconostocmesenteroidesand the formate dehydrogenase gene (fdh) derived fromMycobacteriumvaccaepRSFDuet-mdh-fdhwith the glucose facilitator protein (glf) pZY507glfco-expressed inE.coliBL21(DE3). The yield of mannitol could reach to 0.91 g/g under the optimum conditions of pH 6.5 at 30 ℃. The yield of mannitol could reach to 0.93 g/g by whole catalyst with high activity inulinase.

mannitol; biotransformation; inulin; whole cell catalysis

2016-03-11.

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2014AA093511).

羅 希(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：張春枝(1963-)，女，教授.

TS202.1；Q819

A

1674-1404(2017)04-0235-05

羅希,曹海龍,張卉妍,李悝悝,張春枝.以菊粉為底物全細胞催化生產(chǎn)甘露醇[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(4):235-239.

LUO Xi, CAO Hailong, ZHANG Huiyan, LI Kuikui, ZHANG Chunzhi. The whole cell catalytic production of mannitol using inulin as substrate[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 235-239.