臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因的克隆與分析1)

候亞會 嚴善春 吳文靜 劉小琳 李志強

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040) (廣東省動物保護與資源利用重點實驗室(廣東省生物資源應(yīng)用研究所))

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臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因的克隆與分析1)

候亞會 嚴善春 吳文靜 劉小琳 李志強

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040) (廣東省動物保護與資源利用重點實驗室(廣東省生物資源應(yīng)用研究所))

為了進一步挖掘與利用臺灣乳白蟻(CoptotermesformosanusShiraki)的纖維素酶基因，利用RT-PCR技術(shù)，構(gòu)建了臺灣乳白蟻cDNA文庫，針對β-葡萄糖苷酶(BG)保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，得到一個1 966 bp的潛在的編碼β-葡萄糖苷酶的新基因(CfBG-Ib)，其開放閱讀框1 692 bp，編碼563個氨基酸的產(chǎn)物，并進行了原核表達。預(yù)測成熟的蛋白分子質(zhì)量為64.02 ku，在Bt蛋白的脅迫下，檢測發(fā)現(xiàn)CfBG-Ib與同類基因CfGlu1B和CfBG-Ia的表達響應(yīng)模式相似，3個基因均在Cry1Ac脅迫下顯著上調(diào)，可能是Cry1Ac的潛在靶標之一。

臺灣乳白蟻；β-葡萄糖苷酶；纖維素酶；基因克隆；Bt蛋白

CoptotermesformosanusShiraki；β-glucosidase； Cellulase gene； Gene cloning； Bt protein

木食性昆蟲能通過纖維素酶高效降解纖維素類物質(zhì)，滿足自身生長發(fā)育的需要[1-2]，如食木白蟻、天牛幼蟲、木蜂幼蟲及鱗翅目幼蟲等。其中，白蟻是消化纖維素最有效的昆蟲類群，被認為是地球上最小的高效生物反應(yīng)器[3]，其降解效率可達74%～99%[4-5]，而且每年消化的纖維素類物質(zhì)總量巨大。白蟻高效利用纖維素的腸道生境條件和豐富的纖維素酶及其基因，為生物質(zhì)能的開發(fā)提供了可借鑒的生物模型，對于纖維素的生物能源轉(zhuǎn)化利用與環(huán)保型白蟻藥劑作用靶標的研究均具有重要意義[6]。

纖維素分解為葡萄糖主要需要三類纖維素酶，包括外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG)[7]。目前普遍認為纖維素酶通過這3種酶的協(xié)同作用完成降解，首先是內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素的非結(jié)晶區(qū)作用，產(chǎn)生無定形纖維素和可溶性的纖維寡糖，形成新的末端，然后再由外切葡聚糖酶作用于非還原端，每次水解一個纖維二糖分子，最后再由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖分子徹底水解為葡萄糖[8]。β-葡萄糖苷酶是白蟻重要的內(nèi)源性纖維素酶，主要由白蟻的唾液腺和中腸分泌產(chǎn)生。

臺灣乳白蟻(CoptotermesformosanusShiraki)屬鼻白蟻科，在我國廣泛分布，是我國重要的林業(yè)有害生物。白蟻纖維素酶基因?qū)τ诎紫伒南x至關(guān)重要，臺灣乳白蟻纖維素酶基因資源豐富[9]，已公布的僅8個EG酶全長基因、5個BG酶全長基因，查找白蟻體內(nèi)全部纖維素酶基因，有助于了解白蟻的纖維素消化體系，為進一步防控和利用白蟻奠定基礎(chǔ)。Bt蛋白是被廣泛應(yīng)用的微生物殺蟲劑，對白蟻也具有毒殺作用[10]，但是尚不清楚是否會影響纖維素酶的表達，從而影響纖維素的代謝過程，促進白蟻的死亡。

本研究擬通過構(gòu)建臺灣乳白蟻cDNA文庫，利用β-葡萄糖苷酶基因的保守區(qū)域，篩選新的β-葡萄糖苷酶基因，并對新基因進行序列分析和遺傳進化分析，同時檢測Bt蛋白處理下新基因和已知基因的表達情況，有利于探究白蟻消化系統(tǒng)對藥劑的響應(yīng)，尋找新的藥物潛在干擾靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

臺灣乳白蟻野外群體采自廣東省廣州市生物島，實驗室內(nèi)置于人工氣候箱飼養(yǎng)，溫度為27 ℃，相對濕度為75%，喂食松木板，直至試驗取用。

1.2 臺灣乳白蟻cDNA文庫的構(gòu)建

選取健康的臺灣乳白蟻工蟻10頭，按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa公司)試劑盒使用說明進行白蟻總RNA的提取，使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)合成cDNA文庫。

1.3 新β-葡萄糖苷酶基因的篩選

1.3.1 簡并引物設(shè)計

選取已被報道的臺灣乳白蟻、格斯特乳白蟻(Coptotermesgestroi)、美洲散白蟻(Reticulitermesflavipes)、高山象白蟻(Nasutitermestakasagoensis)、黃翅大白蟻(Macrotermesbarneyi)、Macrotermescarbonarius、恒春新白蟻(Neotermeskoshunensis)和黑翅土白蟻(Odontotermesformosanus)等編碼β-葡糖苷酶的10條同源基因的序列(GQ911585，KC891004，HM152540，AB508959，JQ292845，AB508957，KC533771，AB073638，JN565079，GU591172)，采用CODEHOP(Consensus Degenerate Hybrid Oligonuleotide Primers，http://blocks.fhcrc.org/codehop.html)在線軟件設(shè)計簡并引物(表1)，篩選臺灣乳白蟻新的β-葡糖苷酶基因。

表1 研究所用的引物

1.3.2 中間片段的篩選

(1)以構(gòu)建的工蟻cDNA文庫為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為，cDNA 2 μL，PremixTaq25 μL，上下游簡并引物各2 μL，加dH2O至50 μL；反應(yīng)程序為，94 ℃預(yù)熱1 min，然后94 ℃ 30 s，50/55/60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。(2)取5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)使用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit(Omega公司)回收目的DNA片段。(4)使用pMDTM18-T Vector Cloning Kit(Takara公司)將DNA片段與載體進行連接。(5)將連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，挑選陽性菌落，搖菌，進行PCR鑒定，反應(yīng)程序同上。(6)使用Plasmid Mini Kit I(Omega公司)對鑒定呈陽性的菌液提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送華大基因進行測序。(7)將測序得到的結(jié)果提交至NCBI進行比對分析，篩選與已知序列存在顯著性差異的序列進行后續(xù)試驗。

1.3.3 基因全長序列的克隆

為了獲取白蟻纖維素酶cDNA的全長序列，應(yīng)用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)構(gòu)建cDNA全長文庫。根據(jù)簡并引物擴增獲得的中間片段序列，設(shè)計5′-RACE和3′-RACE的基因特異引物(表1)。用上述合成的cDNA作為RACE(Rapid amplification of cDNA ends)PCR的模板，按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit(Clontech公司)使用說明進行PCR擴增。按1.3.2中的方法對PCR產(chǎn)物進行回收、連接、轉(zhuǎn)化、產(chǎn)物驗證以及測序。

1.3.4 生物信息學分析

應(yīng)用DNAstar軟件將測序結(jié)果拼接得到臺灣乳白蟻BG基因cDNA全長序列，并分析DNA序列的開放閱讀框和預(yù)測氨基酸序列。利用ANTHEPROT軟件分析編碼蛋白的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點等參數(shù)。利用SingalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件預(yù)測信號肽序列，用NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析N-連接糖基化位點，用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/phyre2)預(yù)測蛋白質(zhì)立體模型。從BLAST核酸數(shù)據(jù)庫中選取22條來自其他白蟻的β-葡糖苷酶。利用MEGA6分析上述22條β-葡糖苷酶核酸序列和本研究新發(fā)現(xiàn)的β-葡糖苷酶核酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4β-葡糖苷酶基因的原核表達

根據(jù)克隆得到的β-葡糖苷酶基因的cDNA，選取基因的開放閱讀框作為原核表達的片段，設(shè)計特異性引物(表1)。按1.3.2中的方法對原核表達目的片段進行PCR擴增、切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化以及測序分析，將測序正確的目的片段和pET-32a(+)空載體進行雙酶切反應(yīng)，篩選陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達型菌株Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細胞中，并篩選陽性單克隆，對重組蛋白進行IPTG誘導表達，采用細菌蛋白抽提試劑盒提取細菌總蛋白，進行10% SDS-PAGE電泳。

1.5 Bt蛋白處理下臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因的表達差異

取直徑為150 mm的玻璃培養(yǎng)皿，放入臺灣乳白蟻工蟻120頭，并加入10頭兵蟻維持品級的穩(wěn)定，置于溫度27 ℃，相對濕度75%的人工氣候箱中饑餓培養(yǎng)24 h。取直徑為90 mm的濾紙，分別用1 mL的丙酮和0.1 mg·L-1的吡蟲啉溶液、Bt蛋白Cry1Ab溶液和Bt蛋白Cry1Ac溶液浸濕，室溫下放置一天，使丙酮充分揮發(fā)。取直徑為90 mm的玻璃培養(yǎng)皿，每組放入丙酮充分揮發(fā)后的濾紙、饑餓處理后的工蟻50頭、兵蟻5頭處理1天，重復(fù)3次。收集試驗組和對照組的工蟻，提取總RNA進行熒光定量PCR檢測，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進行，采用2-ΔΔCt的方法進行目的基因的相對表達量分析[11]。用于熒光定量PCR檢測的特異性引物和內(nèi)參引物如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 臺灣乳白蟻BG基因的克隆與序列分析

簡并引物獲得的擴增片段與已克隆得到的臺灣乳白蟻β-葡糖苷酶基因(CfGluA，CfGluB，CfGluC，CfGluD，CfBG-Ia)進行核酸序列比對，有2個克隆分別與GluA和CfBG-Ia序列相同，有一個長為817 bp的克隆片段與所有已知序列均存在顯著性差異，但有共同的保守區(qū)域。根據(jù)中間片段，3′-RACE和5′-RACE PCR擴增拼接后得到該片段的完整cDNA，全長1 966 bp，5′非編碼區(qū)為114 bp，開放閱讀框長度為1 692 bp，編碼563個氨基酸，在N端前26個氨基酸為信號肽序列，3′非編碼區(qū)為160 bp，含有poly(A)尾(圖1)。

斜體表示5′和3′末端非編碼區(qū)；下劃線表示信號肽序列；*號表示翻譯終止密碼子；黑色實心三角形表示N-糖基化位點；方框表示底物結(jié)合位點和催化位點。

圖1 基因CfBG-Ib的cDNA全長序列和編碼的氨基酸序列

預(yù)測成熟蛋白的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為64.02 ku，等電點為6.41，含有5個N-糖基化位點。在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對蛋白質(zhì)序列，結(jié)果顯示，該編碼蛋白質(zhì)含有糖基水解酶家族1(GHF1)結(jié)構(gòu)域，序列與Nasutitermestakasagoensis的β-葡糖苷酶(BAI50024)一致性最高，為58%，與Reticulitermesflavipes(ADK12988)、Periplanetaamericana(AIA09348)、Zootermopsisnevadensis(KDR17469)、Coptotermesformosanus(ADB23476)、Coptotermesgestroi(AGS32242)等等翅目或蜚蠊目昆蟲的β-葡糖苷酶一致性比例均在55%以上。故確認克隆的cDNA序列為臺灣乳白蟻β-葡糖苷酶基因，命名編碼的蛋白為CfBG-Ib(GenBank登錄號KY228991)。

根據(jù)蛋白序列，結(jié)合其他已知物種的β-葡糖苷酶三維結(jié)構(gòu)，推測CfBG-Ib三維結(jié)構(gòu)(模板覆蓋84%的氨基酸，可信度大于90%)。三維結(jié)構(gòu)圖(圖2)顯示，CfBG-Ib具有糖基水解酶家族1的典型結(jié)構(gòu)，8個(β/α)結(jié)構(gòu)圍成的桶狀結(jié)構(gòu)，2個催化活性中心：親核中心Glu244和酸堿催化中心Glu453，2個順式肽鍵：Ala259-Pro260和Trp495-Ser496。

從GenBank數(shù)據(jù)庫中收集了來自等翅目10個物種22條β-葡糖苷酶核酸序列，結(jié)合本研究的β-葡糖苷酶序列，采用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。進化

樹結(jié)果與Shimada和Maekawa研究結(jié)果[12]一致，β-葡糖苷酶分成3個進化枝，CfBG-Ib與CfBG-Ia、CfGlu1B同屬于具有纖維素消化功能的進化枝1，但相互距離較遠，CfBG-Ib可能更早分出(圖3)。此外，進化枝2的β-葡糖苷酶可能參與信息素交流過程[12]，進化枝3的β-葡糖苷酶可能與性別相關(guān)[13-15]。

圖2 CfBG-Ib的三維結(jié)構(gòu)

數(shù)字表示bootstrap驗證1 000次該樹枝可信度的比例；黑色方形表示臺灣乳白蟻已知的β-葡萄糖苷酶全長序列。

2.2 重組蛋白的表達

PCR擴增后，回收目的片段CfBGIb，將CfBGIb和pET-32a空載體分別進行雙酶切反應(yīng)，然后將帶黏性末端目的基因片段CfBGIb和帶黏性末端的pET-32a載體進行連接轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建出重組原核表達載體CfBGIb-pET32a。

將CfBGIb-pET32a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達型菌株Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細胞中，搖菌培養(yǎng)后加入1 mmol IPTG誘導，成功實現(xiàn)CfBG-Ib基因的表達。SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)(圖4)，轉(zhuǎn)化誘導的CfBGIb-pET32a細菌細胞總蛋白顯示出一條明顯的條帶，相對分子質(zhì)量約80 ku，而未誘導的細菌細胞總蛋白無該條帶。該條帶可能為含有CfBGIb蛋白的融合蛋白，因為預(yù)測的CfBGIb編碼蛋白的分子質(zhì)量為64.02 ku，pET-32a質(zhì)粒上帶有分子質(zhì)量約為18 ku的Trx-tag、S-tag和His-tag三個融合表達標簽，所以重組表達后的融合蛋白大小可能為82 ku。

1.誘導的pET-32a-CfBG-Ib的原核表達；2.未誘導的pET-32a-CfBG-Ib的原核表達；箭頭指向的是CfBG-Ib重組蛋白。

圖4 CfBG-Ib重組蛋白的原核表達

2.3 Bt蛋白處理下臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因表達

選擇了Bt蛋白中常見的晶體蛋白Cry1Ab和Cry1Ac進行脅迫處理，以不加藥物的處理組為陰性對照，因為吡蟲啉是目前白蟻防治藥物中的重要成分之一，故以吡蟲啉的處理組為陽性對照。檢測處理1天的正常工蟻進行基因表達的檢測。結(jié)果顯示，藥劑脅迫處理下，屬于同一進化枝的具有纖維素消化功能的CfGlu1B、CfBG-Ia和CfBG-Ib的相對表達量變化相似，但對不同藥物的響應(yīng)不同(表2)。3個基因在Bt蛋白Cry1Ab處理下，表達量與陰性和陽性對照組相比差異不顯著，而在Bt蛋白Cry1Ac處理下，均顯著上調(diào)。推測Cry1Ac可能會直接影響臺灣乳白蟻的消化代謝過程，纖維素酶可能是其潛在靶標之一，故表達受到顯著影響。此外，三個基因表達模式相似，均有纖維素消化功能，在白蟻體內(nèi)可能共同參與了纖維素的消化過程，提高消化纖維素的效率，為白蟻提供更多的能量。

表2 藥劑處理24 h后臺灣乳白蟻β-葡萄糖苷酶基因的表達量

處理β-葡萄糖苷酶基因CfBG-IbCfBG-IaCfGlu1B對照組(0.93±0.08)b(1.05±0.13)b(1.02±0.26)c吡蟲啉(1.21±0.15)b(0.83±0.05)b(1.12±0.25)cCry1Ab(1.20±0.26)b(1.39±0.04)b(2.37±0.77)bCry1Ac(3.23±0.58)a(4.03±0.57)a(7.01±0.90)a

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。數(shù)據(jù)后同列不同字母表示各基因不同處理間的基因表達量差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

利用RT-PCR方法、序列分析方法、熒光定量表達分析方法等，成功從臺灣乳白蟻中篩選出一個新的β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib，并對新基因的序列、進化地位、脅迫下的表達情況進行了分析，豐富了對白蟻纖維素消化酶體系的認識。本研究的結(jié)果主要有：(1)CfBG-Ib基因全長1 966 bp，編碼563個氨基酸，具有糖基水解酶家族1的保守結(jié)構(gòu)域，GenBank登錄號KY228991；(2)CfBG-Ib在系統(tǒng)進化樹上與已知的CfGlu1B和CfBG-Ia同屬于進化枝1，推測CfBG-Ib也具有纖維素消化功能，但CfBG-Ib可能更為原始；(3)CfBG-Ib、CfGlu1B和CfBG-Ia在Bt蛋白處理下的基因表達模式相似，其中，在Bt蛋白Cry1Ac處理下顯著上調(diào)，可能是Cry1Ac的潛在靶標之一。

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1)國家自然科學基金項目(31172163)；廣東省自然科學基金項目(2015A030310429)；廣州市科技計劃項目(201510010036)。

候亞會，男，1990年9月生，東北林業(yè)大學林學院，碩士研究生。E-mail：873523206@qq.com。

嚴善春，東北林業(yè)大學林學院，教授。E-mail：yanshanchun@126.com。李志強，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室(廣東省生物資源應(yīng)用研究所)，研究員。E-mail：lizq@giabr.gd.cn。

2016年11月23日。

S763.33;Q969.29

責任編輯：程 紅。

Gene Cloning and Characterization of aβ-glucosidase Gene fromCoptotermesformosanusShiraki//Hou Yahui, Yan Shanchun(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Wu Wenjing, Liu Xiaolin, Li Zhiqiang(Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：96-101.

In order to exploit and utilize cellulose genes ofCoptotermesformosanusShiraki, the cDNA library ofC.formosanuswas constructed by RT-PCR. Based on conserved domains ofβ-1,4-D-glucosidase (BG), degenerate primers were designed to screen for new genes. A novelβ-1,4-D-glucosidase gene was obtained with the full-length of 1 966 bp and an open reading frame of 1 692 bp. The 563-residue mature BG was with a calculated molecular masses of 64.02 kDa, and contained a glycosyl hydrolase family 1 domain. By phylogenetic analysis, the novel BG belongs toβ-glucosidase cluster 1, encoding digestive enzymes, and designated CfBG-Ib. The recombinantβ-glucosidaseCfBG-Ibwas expressed heterologously. Under the stress of Bt protein, the expression pattern ofCfBG-Ibwas similar to those ofCfGlu1BandCfBG-Ia. Three genes were significantly up-regulated in response to Cry1Ac stress, which may be one of the potential targets of Cry1Ac.