陜西藍(lán)田核桃內(nèi)生真菌多樣性與時空分布1)

劉澤星 阿依佳瑪麗·依瑪爾 毛光瑞 張婷婷 翟梅枝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

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陜西藍(lán)田核桃內(nèi)生真菌多樣性與時空分布1)

劉澤星 阿依佳瑪麗·依瑪爾 毛光瑞 張婷婷 翟梅枝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

為了解陜西藍(lán)田核桃(JuglansregiaL.)內(nèi)生真菌生態(tài)多樣性與分布特性，采用組織分離法對不同季節(jié)的核桃樹的不同組織部位進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，以形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。共分離獲得核桃內(nèi)生真菌676株，隸屬于47個屬，其中交鏈孢霉屬(Alternaria)為優(yōu)勢類群，占菌株總數(shù)的19.23%；莖葉核菌屬(Ectostroma)和葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)相對較豐富，分別占菌株總數(shù)的8.73%和6.21%。核桃不同部位內(nèi)生真菌的多樣性以莖部最高，1年生莖和2年生莖分別占菌株總數(shù)的24.56%和24.41%。不同季節(jié)的核桃內(nèi)生真菌中，秋季(2013年10月)的多樣性最高，分布于19個屬，占菌株總數(shù)的34.91%。不同組織部位的核桃內(nèi)生真菌多樣性因季節(jié)變化而異。

核桃；內(nèi)生真菌；多樣性

JuglansregiaL.; Endophytic fungi; Diversity

廣義的內(nèi)生菌的定義是指生活在植物組織內(nèi)或生活史中的某一段生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌，包括那些生活史中某一階段營表面生的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌[1-3]。目前已研究過的數(shù)百種植物中(包括苔蘚、蕨類)，還未發(fā)現(xiàn)沒有內(nèi)生真菌的植物，可以推斷內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)是普遍存在的[3]，保守估計每種植物上將會發(fā)現(xiàn)6個新的微生物物種，現(xiàn)有植物種類27萬種，則內(nèi)生真菌的數(shù)目將會是162萬種[4]，且不同生境下的同一種植物的內(nèi)生真菌亦有差異[5]，可見內(nèi)生真菌將是微生物物種的主要角色。按照協(xié)同演化的理論，宿主植物與其內(nèi)生真菌長期共生，相互影響。宿主植物為內(nèi)生真菌提供能量、礦質(zhì)元素等，而內(nèi)生真菌具有固氮、促進(jìn)植物生長(分泌IAA等植物生長激素物質(zhì))、增強植物環(huán)境修復(fù)能力、抗逆境(干旱等)、抗動物(昆蟲、線蟲、食草哺乳動物等)攝食、抗病原真菌等作用[6-9]。研究還表明，海南粗榧(Cephalotaxushainanensis)內(nèi)生真菌A29的次級代謝產(chǎn)物對香蕉枯萎等4種病原菌具有較強抑菌活性[10]，柴胡(Bupleurumsp.)內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物對枯草芽孢桿菌等3種細(xì)菌病原菌具有較強抑菌活性[11]，核桃內(nèi)生真菌對棉花立枯病菌等多種病原菌的生長都有抑制作用[12]，核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵液對蘋果輪紋等4種病原菌的抑制率為100%[13]。植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物中存在著天然抑菌活性物質(zhì)，可為尋找新型抗菌物質(zhì)提供資源。潛在的植物內(nèi)生真菌是一個巨大的資源寶庫，對研究生物多樣性、發(fā)現(xiàn)新化合物和開發(fā)新藥具有重大的意義。本研究以陜西藍(lán)田核桃為研究對象，對其內(nèi)生真菌的多樣性及時空分布的差異性進(jìn)行研究，為核桃內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用和生態(tài)多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

分別于秋季(2013年10月)、冬季(2013年12月)、春季(2014年3月)、夏季(2014年6月)選擇陜西省關(guān)中地區(qū)藍(lán)田縣(E109.357481°；N34.197120°；海拔678 m；年降水量720.4 mm)的核桃園采集樣品。在每個采樣地點，選取固定的生長健壯的核桃樹進(jìn)行采樣，采集部位包括根、1年生莖、2年生莖、干莖、葉和果(葉、果只采夏秋兩季)。采樣方法，用75%的酒精對刀片消毒，分別剪(切)取30～50 cm土層內(nèi)粗度約1 cm的細(xì)根10 cm；1年生幼嫩枝條和2年生枝條各10 cm左右；干莖5 cm×5 cm；健康葉子、果實若干分別裝入自封袋，編號，帶回實驗室后4 ℃保存，12 h內(nèi)對樣品進(jìn)行處理。

1.2 外植體表面消毒

首先將核桃不同部位各組織用流水沖洗干凈，用75%的酒精對刀片消毒，然后將核桃的根、1年生莖、2年生莖分別切成15 mm小段，干莖、葉、果(青皮)切成15 mm×15 mm小塊。將以上各組織在無菌條件下進(jìn)行表面消毒，消毒流程如下：①無菌水沖洗3次→75%酒精消毒3 min→無菌水沖洗3次；②無菌水沖洗3次→3% H2O2消毒3 min→無菌水沖洗3次。

無菌條件下，將處理好的核桃材料在培養(yǎng)基上作組織印跡對照處理，檢驗消毒效果[12]。

1.3 內(nèi)生真菌的分離、純化及保藏

在超凈工作臺中，用無菌刀片將以上消毒的根、1年生莖、2年生莖分別切成5 mm小段，將干莖、葉、果切成5 mm×5 mm小塊，分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿接種3塊，每種組織塊重復(fù)3個培養(yǎng)皿，28 ℃暗培養(yǎng)1～2周，待材料邊緣長出菌絲后，采用菌絲末端分離法，將邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，多次純化后得到單一菌落，并轉(zhuǎn)接到試管斜面上置于冰柜中4 ℃保藏[14]。

1.4 菌株的鑒定

菌株的形態(tài)學(xué)特征鑒定：通過經(jīng)典方法對分離純化的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，于無菌條件下挑取待鑒定菌株的菌絲，在PDA固體培養(yǎng)基平板中央定植一點，置于28 ℃下培養(yǎng)，觀察菌落的顏色、質(zhì)地、生長速度等特性；在顯微鏡下觀察菌絲體、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)與顏色以及孢子與營養(yǎng)體之間的著生關(guān)系等特征[15]。

菌株的分子生物學(xué)鑒定：對于形態(tài)學(xué)鑒定方法難以確定的菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，從平板上刮取約0.1 g菌絲體，置于1.5 mL離心管中，用改良的CTAB法提取基因組DNA，并以此為模板，用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對菌株rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系15 μL，PCR mix 7.5 μL，ITS1和ITS4各0.6 μL，模板DNA 0.8 μL，雙蒸水補足至15 μL。擴(kuò)增程序為，94 ℃，4 min；94 ℃，40 s；37 ℃，1 min；72 ℃，1 min，40個循環(huán)；72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠(DuRed核酸染料)電泳檢測，將符合要求的擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。用Blast程序?qū)y得序列與GeneBank中的序列進(jìn)行同源性比對，選擇同源性99%以上序列作為參考序列，并采用ClustalX 2.0做同源性比較和匹配排序[15-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃內(nèi)生真菌的群落構(gòu)成及分布

從供試材料的根、莖(1年生莖、2年生莖、干莖)、葉、果4類組織中共分離出676株內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)方法結(jié)合分子生物學(xué)方法(圖1)歸類為47個屬(表1)。

圖1 基于ITS序列作系統(tǒng)發(fā)育分析的7株內(nèi)生真菌

交鏈孢霉屬(Alternaria)為優(yōu)勢類群(圖2)，占菌株總數(shù)的19.23%，莖葉核菌屬(Ectostroma)和葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)相對豐富，分別占菌株總數(shù)的8.73%和6.21%。此外，交鏈孢霉屬、莖葉核菌屬和黑孢霉屬(Nigrospora)廣泛分布于4類組織6個部位中，同時交鏈孢霉屬是在屬的分類水平上唯一四季生長不衰的菌群。

圖2 交鏈孢霉屬內(nèi)生真菌形態(tài)特征

內(nèi)生真菌根/株莖/株1年生莖2年生莖干莖葉/株果/株合計/株分離頻率/%交鏈孢霉屬(Alternaria)5433217161713019.23莖葉核菌屬(Ectostroma)22012799598.73葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)4817310426.21黑孢霉屬(Nigrospora)1068256375.47黑盤孢屬(Melanconium)1124355.18鐮刀菌屬(Fusarium)2517334.88莖點霉屬(Phoma)91064294.29殼小圓孢屬(Coniothyrium)28284.14色串孢屬(Torula)9414273.99發(fā)菌屬(Capillaria)1411253.70酵母屬(Saccharomyces)133162.37擬莖點霉屬(Phomopsis)511162.37結(jié)實串孢霉屬(Hormiscium)13131.92刺葡萄孢霉屬(Echinobotryum)12121.78裂褶菌屬(Schizophyllum)264121.78木霉屬(Trichoderma)12121.78束絲菌屬(Ozonium)111121.78須殼孢屬(Pyrenochaeta)111121.78暗梗穗孢霉屬(Stachylidium)74111.63節(jié)串孢霉屬(Gonatorrhodum)92111.63小卵孢霉屬(Ovularia)64101.48殼滿孢屬(Plenodomus)34291.33聚生小穴殼菌(Dothiorellagre-garia)6281.18單孢枝霉屬(Hormodendrum)5271.04花核菌屬(Anthina)1671.04新叢赤殼屬Neonectria)771.04黑蔥花霉屬(Periconia)3360.89炭疽菌屬(Colletotrichum)3250.74峽筒串孢霉屬(Prophytroma)3250.74糞殼菌屬(Sordaria)440.59腐皮殼屬(Diaporthe)2240.59假黑粉霉屬(Coniosporium)440.59瓶梗青霉屬(Paceilomyces)440.59青霉屬(Penicillium)440.59

續(xù)(表1)

注：表中數(shù)字代表相應(yīng)菌株數(shù)量；分離頻率=(某屬或某部位菌株數(shù)/菌株總數(shù))×100%。

2.2 不同部位核桃內(nèi)生真菌的多樣性

由表1可看出，核桃的根、莖、葉、果4大類組織的內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布以及優(yōu)勢種群等方面都存在較大差異。首先莖部內(nèi)生真菌的分離頻率普遍較高，占到總數(shù)的62.14%，由莖分離獲得的內(nèi)生真菌分布于33個屬，其中1年生莖和2年生莖分別為24.56%和24.41%；干莖則相對較少，僅13.17%，且低于根部和葉部的分離頻率。根、葉、果的內(nèi)生真菌分離頻率分別是14.05%、14.35%和9.47%，各自分布于16、14、12個屬中。其次優(yōu)勢種群在各個組織部位的分布存在明顯差異。莖中交鏈孢霉屬的種群優(yōu)勢極為明顯，占莖部菌株總數(shù)的21.90%，相對豐富的莖葉核菌屬、黑盤孢屬(Melanconium)，分別占莖部菌株總數(shù)的9.29%和8.33%；根部優(yōu)勢種群主要是鐮刀菌屬(Fusarium)、酵母屬(Saccharomyces)和木霉屬(Trichoderma)等；而葉中殼小圓孢屬(Coniothyrium)、色串孢屬(Torula)以及交鏈孢霉屬是主要的優(yōu)勢種群；果實青皮中內(nèi)生真菌的種群優(yōu)勢不顯著，以交鏈孢霉屬、葡萄座腔菌屬、莖葉核菌屬居多。此外，不同部位都有各自獨有的屬，如木霉屬(圖3)只在根部分離得到，殼小圓孢屬僅存在于葉中，說明這些內(nèi)生真菌對宿主組織有一定的偏好性或?qū)Ｒ恍訹19-21]。此外，47個屬的內(nèi)生真菌中只有3個屬的內(nèi)生真菌在4類組織、6個部位中廣泛分布，占比6.4%，它們是交鏈孢霉屬、莖葉核菌屬和黑孢霉屬，表明這3個屬的內(nèi)生真菌具有較廣泛的組織侵染性。

圖3 木霉屬內(nèi)生真菌形態(tài)特征

2.3 不同季節(jié)核桃內(nèi)生真菌的多樣性

由春夏秋冬四季樣本分離獲得的核桃內(nèi)生真菌的群落呈現(xiàn)動態(tài)變化(表2)。表2顯示，四季中以秋季分離獲得的內(nèi)生真菌菌株最多，236株，約為春季分離菌株的3倍。秋季內(nèi)生真菌分布于19個屬，占總菌屬比例40.43%，分離頻率達(dá)到34.91%，這與汪友明等[22]的研究結(jié)果一致；相比之下，春季樣品中內(nèi)生真菌相對較少，僅獲得85個菌株，分布在13個屬，分離頻率為12.57%；夏冬兩季的內(nèi)生真菌豐度介于春秋之間，由此可以推測，陜西關(guān)中地區(qū)核桃內(nèi)生真菌在一年四季中呈現(xiàn)‘秋盛春衰’的周期性動態(tài)變化。在不同季節(jié)中，內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群也有鮮明的區(qū)別。在春季，主要寄生在宿主幼枝和樹皮的交鏈孢霉屬、束絲菌屬(Ozonium)和刺葡萄孢霉屬(Echinobotryum)是內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群；而夏季，在4類組織中都有分布的莖葉核菌屬和主要寄生在宿主葉片的殼小圓孢屬以及交鏈孢霉屬成為優(yōu)勢種群；秋季的內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群則是黑孢霉屬、葡萄座腔菌屬和交鏈孢霉屬，黑孢霉屬和交鏈孢霉屬的內(nèi)生真菌廣泛分布在宿主的4類組織中，而葡萄座腔菌屬僅僅在根部未分離到；冬季核桃樹既沒有葉子也沒有果實，此時的內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群主要分布在莖和根中，它們是交鏈孢霉屬、黑盤孢屬和發(fā)菌屬(Capillaria)，其中黑盤孢屬和發(fā)菌屬只分布于宿主的莖中。在47個屬的內(nèi)生真菌中，有33個屬僅出現(xiàn)于某一個季節(jié)，占總屬的70.21%，說明不同季節(jié)具有特定的內(nèi)生真菌種群；但交鏈孢霉屬和鐮刀菌屬在4個季節(jié)的樣本中都有分布，交鏈孢霉屬在所有組織中都有分布，鐮刀菌屬則主要分布在根中。

表2 不同季節(jié)核桃內(nèi)生真菌的多樣性及優(yōu)勢菌群的分布

3 結(jié)論與討論

本研究從陜西關(guān)中地區(qū)核桃中分離出隸屬于47個屬的676株內(nèi)生真菌，反映了核桃內(nèi)生真菌的多樣性，其中交鏈孢霉屬的種群優(yōu)勢極為明顯，這與前人[16，23]的研究結(jié)果一致。大量研究表明，交鏈孢霉屬真菌是常見的植物內(nèi)生真菌[24]，它們可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似活性的化合物，如長春花(Catharanthusroseus)中分離到的交鏈孢霉屬真菌能夠產(chǎn)生長春新堿[25]，喜樹(Camptothecaacuminata)中分離到的交鏈孢霉屬真菌能夠產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)[26]，黃精(Polygonatumsibiricum)中分離的交鏈孢霉屬真菌可產(chǎn)生三萜皂苷[27]，這表明交鏈孢霉屬核桃內(nèi)生真菌具有產(chǎn)生活性物質(zhì)的可能。

本研究顯示，28個屬的內(nèi)生真菌僅分布于單一組織部位中，體現(xiàn)了核桃內(nèi)生真菌在組織部位上的專一性，表明內(nèi)生真菌在植物中的分布受組織結(jié)構(gòu)等因素的影響。核桃莖部內(nèi)生真菌的多樣性較高，但干莖中內(nèi)生真菌多樣性相比幼莖較低，這可能與干莖中營養(yǎng)物質(zhì)減少相關(guān)[28]。根和葉部的分離頻率相近，但葉只有夏、秋兩季的樣本。果實青皮中內(nèi)生真菌多樣性較低，這與核桃青皮中富含醌類和黃酮類化合物有密切關(guān)系，研究表明胡桃醌具有廣泛抑菌作用[29]。

筆者系統(tǒng)地研究了同一樹木中內(nèi)生真菌一年四季的分布。不同季節(jié)的核桃內(nèi)生真菌在一年中呈現(xiàn)‘秋盛春衰’的周期性動態(tài)變化。33個屬的內(nèi)生真菌僅出現(xiàn)于某個單一季節(jié)，說明核桃內(nèi)生真菌呈現(xiàn)出顯著的季節(jié)多樣性。推測可能是隨著季節(jié)的更替，核桃樹組織的生長使內(nèi)生真菌的營養(yǎng)來源發(fā)生了變化。優(yōu)勢種群的寄生部位由莖(春天)變?yōu)榍o和葉(夏天)再到根、莖、葉、果(秋天)最后又回到莖(冬天)。Hoffman et al.[30]研究指出，內(nèi)生真菌類群會受到環(huán)境因子的影響，如采集地的濕度、季節(jié)變化、海拔和周圍植被類群等，說明絕大多數(shù)的內(nèi)生真菌在分布上都會受到不同外在條件的限制如宿主差異、地域差異、氣候差異等，甚至在同一植物的不同組織中內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)也完全不同。

與同實驗室的研究人員毛光瑞[16]和阿依佳瑪麗·依瑪爾[23]的研究相比，二者的研究側(cè)重于核桃內(nèi)生真菌在空間上(不同生境)的多樣性，本文側(cè)重于研究核桃內(nèi)生真菌在時間維度(四季)的多樣性，首次對同一樹木中內(nèi)生真菌類群的四季變化做了跟蹤研究，為全面研究內(nèi)生菌多樣性提供了科學(xué)依據(jù)。三者主要研究結(jié)果具有一致性：第一，核桃內(nèi)生真菌優(yōu)勢類群為交鏈孢霉屬，其分離頻率均是次優(yōu)勢類群2倍以上。第二，核桃不同部位內(nèi)生真菌以2年生莖的分離頻率最高，只是本研究1年生莖分離頻率(24.56%)略高于2年生莖(24.41%)?；ハ嘀g印證了研究結(jié)果的可靠性。

目前，內(nèi)生真菌多樣性的研究往往受到內(nèi)生真菌分離方法的制約。植物內(nèi)生真菌的分離多采用組織分離法，即將表面消毒后的植物組織置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，繼而分離、純化內(nèi)生真菌；進(jìn)而根據(jù)宏、微觀形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法鑒定菌種，進(jìn)行多樣性分析。然而任何一種培養(yǎng)基均具有選擇性，不能將植物組織中所有內(nèi)生真菌分離出來，這也是植物內(nèi)生真菌多樣性研究的困境[31]。采用宏基因組測序分析法能更好體現(xiàn)植物組織中內(nèi)生真菌的種類，但不能將內(nèi)生真菌分離出來，因此組織分離法尚為當(dāng)前獲得植物內(nèi)生真菌的主要方法[24，32]。在隨后的內(nèi)生真菌研究中應(yīng)綜合考慮這些因素，以期為高效利用豐富的內(nèi)生真菌資源奠定基礎(chǔ)。

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1)國家自然科學(xué)基金項目(31370552)。

劉澤星，男，1991年6月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：360473788@qq.com。

翟梅枝，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：plum-zhai@163.com。

2016年9月7日。

S718.81; S664.1

責(zé)任編輯：程 紅。

Diversity and Temporal-spatial Distribution of Endophytic Fungi fromJuglansregiaL. in Lantian, Shaanxi//Liu Zexing, Yimaer·Ayijiamali, Mao Guangrui, Zhang Tingting, Zhai Meizhi(Northwest A & F University, Yangling 712100, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：90-95.

The experiment was conducted to study the endophytic fungal ecology diversity and distribution characteristics of theJuglansregiawoody tree in Lantian of Shaanxi Province. The fungal endophytes from different tissues of walnut tree in the four seasons were isolated, which were classified by morphology and similarity of internal transcribed spacer (ITS) sequence. A total of 676 endophytic fungal strains in 47 genera were isolated, in whichAlternariawere the dominant genera accounting for 19.23% of the total strains. The proportion ofEctostromaandBotryosphaeriawere second abundant stains, accounting for 8.73% and 6.21%, respectively. In different tissues of walnut, endophytic fungal from stem showed the highest diversity. The strains isolated from the annual and biennial stem were accounted for 24.56% and 24.41% of the total strains, respectively. Among different seasons, endophytic fungi obtained from autumn (October 2013) samples displayed the highest diversity and was distributed in 19 genera, accounting for 34.91% of the total strains. Therefore, the diversity of the endophytic fungi from different tissues of walnut was varied with the four seasons.