固定化混合菌利用戊糖和己糖共發(fā)酵制備乙醇

江楓，房伶晏，王浩，朱均均，范一民，宋向陽

(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,南京210037)

固定化混合菌利用戊糖和己糖共發(fā)酵制備乙醇

江楓，房伶晏，王浩，朱均均，范一民，宋向陽*

(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,南京210037)

為研究固定化混合菌種對戊糖和己糖同步發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的影響，以海藻酸鈣為固定化載體，采用包埋法固定化休哈塔假絲酵母(Candidashehatae)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，并對固定化混合菌種的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：固定化混合菌種發(fā)酵可以快速利用葡萄糖，解除葡萄糖代謝對木糖代謝的抑制作用，提高發(fā)酵效率，發(fā)酵時(shí)間從固定化單菌發(fā)酵的24 h縮短至20 h，發(fā)酵時(shí)間縮短16.67%。乙醇產(chǎn)量從13.28 g/L增加至14.89 g/L，升高了12.12%。固定化混合菌種的優(yōu)化條件為：混合糖(葡萄糖和木糖)質(zhì)量濃度為45 g/L，發(fā)酵溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min，休哈塔假絲酵母和釀酒酵母菌體的比例為4∶1。在此條件下得到最佳乙醇產(chǎn)量為15.21 g/L，較優(yōu)化前(13.74 g/L)提高了10.70%。本研究結(jié)果可為固定化混合菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工業(yè)化提供理論依據(jù)。

休哈塔假絲酵母；釀酒酵母；固定化細(xì)胞；混菌發(fā)酵；優(yōu)化

近年來，石油資源短缺問題日益嚴(yán)重，從可再生資源中生產(chǎn)燃料乙醇受到較多關(guān)注[1]。農(nóng)林廢棄物和工業(yè)廢渣中獲得的木質(zhì)纖維原料，由于其資源豐富、價(jià)格低廉、環(huán)保清潔等特性，是較為理想的用以生產(chǎn)燃料乙醇的原材料[2-4]。木質(zhì)纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，由于其結(jié)構(gòu)致密，存在天然抗降解屏障，對生物酶具有阻抗作用，直接酶解效率低，因此必須對原料進(jìn)行一定程度的預(yù)處理，增加纖維表面與酶的結(jié)合程度[5]。木質(zhì)纖維原料經(jīng)過預(yù)處理、酶解后水解液中主要成分為葡萄糖和木糖[6]，其中葡萄糖可以被釀酒酵母快速利用[7]，而木糖代謝較葡萄糖代謝復(fù)雜，自然界中高效的木糖發(fā)酵菌種數(shù)量有限，主要有假絲酵母，畢赤酵母和管囊酵母3個(gè)屬[8-9]，且最好的木糖發(fā)酵菌株利用葡萄糖或木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的效率僅為釀酒酵母用葡萄糖生產(chǎn)乙醇效率的五分之一[10]，使得木糖發(fā)酵成為阻礙木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇商業(yè)化的一個(gè)重要因素[6]。燃料乙醇生產(chǎn)主要分為游離細(xì)胞發(fā)酵和固定化細(xì)胞發(fā)酵[11]。固定化細(xì)胞較游離細(xì)胞具有提高產(chǎn)量，容易分離，不易染菌，可重復(fù)循環(huán)利用等優(yōu)勢[12]，被廣泛應(yīng)用于生物科技、環(huán)境、食品等領(lǐng)域，并取得了顯著成果[13]。Chandel等[14]研究了固定化釀酒細(xì)胞對甘蔗渣發(fā)酵的影響，最大乙醇產(chǎn)率達(dá)0.45 g/g，可重復(fù)發(fā)酵8批次。Pacheco等[15]研究了固定化釀酒酵母發(fā)酵蘋果渣，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度、產(chǎn)率和乙醇轉(zhuǎn)化率均得到提高。

目前，有關(guān)固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究主要集中于單菌發(fā)酵方面，而對混合菌種固定化發(fā)酵的相關(guān)研究尚少。Lebeau等[16]將休哈塔假絲酵母和釀酒酵母固定化于瓊脂板上研究了在生物反應(yīng)器中的發(fā)酵情況，結(jié)果表明葡萄糖能完全被利用而木糖僅被利用20%。李艷華等[17]研究了嗜單寧管囊酵母和釀酒酵母固定化于海藻酸鈣中發(fā)酵玉米秸稈水解液工藝，結(jié)果表明，固定化混合菌種能同時(shí)利用木糖和己糖共同發(fā)酵，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.4 g/g。固定化混合菌種發(fā)酵主要存在代謝產(chǎn)物的抑制作用和混菌發(fā)酵條件的協(xié)調(diào)兩方面問題[18]。本研究以純糖模擬液為碳源，以海藻酸鈣為材料分別固定化休哈塔假絲酵母和休哈塔假絲酵母與釀酒酵母的混合菌進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，并對固定化混合菌種發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期解決葡萄糖發(fā)酵對木糖的阻遏作用，探索最適的混合菌種發(fā)酵條件，為固定化混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

休哈塔假絲酵母(Candidashehatae)ATTC 122984，該菌種能同步發(fā)酵戊糖和己糖；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) NL22，己糖發(fā)酵菌株。兩種菌均保藏于南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

休哈塔假絲酵母活化培養(yǎng)基(g/L)：木糖20.00，蛋白胨10.00，酵母浸膏5.00。釀酒酵母活化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.00，蛋白胨5.00，酵母浸膏3.00。增殖培養(yǎng)基[19](g/L)：葡萄糖30.00，木糖30.00，蛋白胨3.00，酵母浸膏2.50，KH2PO42.50，MgSO4·7H2O 0.25，CaCl20.25。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.00，木糖15.00，(NH4)2SO45.00，KH2PO43.00，MgSO4·7H2O 0.50。

1.2.2 菌種的活化

保藏的斜面菌株經(jīng)接種環(huán)接2環(huán)到裝有50 mL活化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中活化24～36 h。再經(jīng)過增殖培養(yǎng)基增殖到一定量，離心(3 000 r/min，10 min)所得的酵母菌泥存放于4℃冰箱中，待用。

1.2.3 固定化細(xì)胞的制備與增殖

將一定量3%的海藻酸鈉在70℃的水浴中溶解后，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃下滅菌15 min。滅菌結(jié)束后放入超凈工作臺(tái)中冷卻至室溫。按一定比例加入相應(yīng)質(zhì)量濃度制備好的休哈塔假絲酵母和釀酒酵母的菌泥，玻璃棒攪拌均勻后使用5 mL的醫(yī)用注射器滴入到2%的CaCl2水溶液中，制備成2～3 mm的凝膠顆粒，然后放入4℃的冰箱中固化12 h，過濾掉溶液，用無菌水將固定化顆粒洗滌3次，待用。

將制備好的凝膠小球用無菌水洗滌后接入到新鮮的增殖培養(yǎng)基中，在30℃、170 r/min的搖床中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，24 h后更換新的增殖培養(yǎng)基，共增殖48 h。

1.2.4 固定化細(xì)胞的乙醇發(fā)酵

將增殖過的凝膠小球用無菌水洗滌2～3次，接入到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中。其中，發(fā)酵液的體積為50 mL，固液比為3∶2。將固定化小球置于30℃、170 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.5 糖和乙醇質(zhì)量濃度的測定

糖和乙醇質(zhì)量濃度采用高效液相色譜(HPLC) 法測定[19]。測定試樣在 10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經(jīng) 0.22 μm 的濾膜過濾，然后在Agilent1260 型高效液相色譜儀上，用 Bio-Rad HPX-87H柱(7.8 mm×300 mm)，0.005 mol/L 的H2SO4作為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，色譜柱溫為55℃，檢測器采用示差折光檢測器(RID)。采用外標(biāo)法測定試樣中組分。糖利用率和乙醇得率采用以下公式計(jì)算。

(1)

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 休哈塔假絲酵母和釀酒酵母發(fā)酵過程

在酵母細(xì)胞的混合糖發(fā)酵過程中，木糖的代謝途徑比葡萄糖的代謝途徑更為復(fù)雜，一般酵母細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵[7]。圖1、圖2和圖3分別為固定化休哈塔假絲酵母、固定化釀酒酵母和固定化混合菌種在純糖模擬液中的發(fā)酵過程圖。

由圖1可以看出，質(zhì)量濃度為30.95 g/L葡萄糖和14.45 g/L木糖的發(fā)酵液中，發(fā)酵前12 h，葡萄糖代謝速率較木糖代謝速率快。這主要是由于木糖代謝比葡萄糖復(fù)雜，在酵母菌代謝過程中，木糖在木糖還原酶作用下轉(zhuǎn)化為木糖醇，然后在木糖醇脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為木酮糖，木酮糖經(jīng)過磷酸化作用進(jìn)入磷酸戊糖循環(huán)，經(jīng)過一系列生化反應(yīng)生成乙醇[20]。在12 h時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度為3.89 g/L，木糖代謝逐漸加快，說明葡萄糖對木糖的抑制作用減弱，發(fā)酵到24 h時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為13.28 g/L，此時(shí)糖利用率為93.50%。在24 h后進(jìn)一步發(fā)酵，乙醇濃度逐漸下降，這可能是由于發(fā)酵液中的糖濃度較低，酵母細(xì)胞開始利用乙醇作為營養(yǎng)物質(zhì)。

圖1 固定化休哈塔假絲酵母戊糖和己糖發(fā)酵代謝過程Fig. 1 Metabolism course of pentose and hexose fermentated by immobilized Candida shehatae

圖2為固定化釀酒酵母在混合糖中的發(fā)酵過程。從圖2可以看出，釀酒酵母能夠快速有效利用葡萄糖，質(zhì)量濃度為31.13 g/L 葡萄糖在4 h內(nèi)利用完全，木糖未呈現(xiàn)明顯變化，這是由于釀酒酵母只能代謝葡萄糖而不能代謝木糖。從圖1可知，葡萄糖的存在會(huì)對木糖利用產(chǎn)生抑制作用，而釀酒酵母能夠快速利用葡萄糖，解除葡萄糖對木糖的抑制作用，可通過固定化休哈塔假絲酵母和釀酒酵母混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，加快葡萄糖代謝速率，從而縮短其對木糖代謝的抑制作用，進(jìn)而提高休哈塔假絲酵母對木糖利用效率。

圖2 固定化釀酒酵母戊糖和己糖發(fā)酵代謝過程Fig. 2 Metabolism course of pentose and hexose fermentated by immobilized Saccharomyces cerevisiae

為進(jìn)一步分析固定化混合菌相互作用，對固定化混合菌戊糖和己糖的發(fā)酵過程進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖3。由圖3可知，質(zhì)量濃度為31.36 g/L葡萄糖和13.77 g/L木糖的發(fā)酵液中，葡萄糖在4 h內(nèi)基本被利用，僅余2.06 g/L。對比圖1結(jié)果可知，固定化混合菌發(fā)酵較固定化單菌發(fā)酵木糖消耗快，這是因?yàn)楣潭ɑ旌暇N發(fā)酵時(shí)釀酒酵母可快速利用葡萄糖，有效解除葡萄糖對木糖代謝的抑制作用。固定化混合菌種發(fā)酵到20 h時(shí)，木糖剩余2.55 g/L，而固定化單菌發(fā)酵到24 h時(shí)木糖剩余2.95 g/L。碳源質(zhì)量濃度為45 g/L時(shí)，固定化混合菌發(fā)酵時(shí)間從固定化休哈塔假絲酵母單菌發(fā)酵的24 h縮短至20 h，發(fā)酵時(shí)間縮短16.67%。這可能是由于固定化混合菌種發(fā)酵時(shí)，4 h利用完葡萄糖，增加了木糖發(fā)酵時(shí)間，從而提高了木糖利用效率。在24 h時(shí)，糖利用率為96.59%，此時(shí)乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大值14.89 g/L，比固定化休哈塔假絲酵母單菌發(fā)酵提高12.12%。在24 h后進(jìn)一步發(fā)酵，乙醇質(zhì)量濃度開始下降，這是由于發(fā)酵液中碳源基本被利用完，酵母細(xì)胞開始利用乙醇為底物進(jìn)行生長。

圖3 固定化休哈塔假絲酵母和釀酒酵母混合菌戊糖和己糖發(fā)酵代謝過程Fig. 3 Metabolism courses of pentose and hexose fermentated by immobilized C. shehatae and S. cerevisiae

2.2 固定化混合菌種發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 初始碳源質(zhì)量濃度對固定化混合菌種發(fā)酵的影響

碳源質(zhì)量濃度能夠直接影響酵母菌的發(fā)酵性能。為確定固定化混合菌種發(fā)酵最適初始碳源質(zhì)量濃度，本試驗(yàn)采用的初始碳源質(zhì)量濃度分別為30，45，60，75和90 g/L，葡萄糖和木糖比例為2∶1，在30℃、170 r/min條件下發(fā)酵24 h，結(jié)果如圖4所示。隨碳源質(zhì)量濃度增加，糖利用率從96.42%下降為84.67%，這可能是由于隨碳源質(zhì)量濃度增加，葡萄糖對木糖的抑制作用加強(qiáng)，導(dǎo)致酵母菌對糖的利用效率下降。乙醇得率隨碳源質(zhì)量濃度增加先增加后逐漸減少，當(dāng)碳源質(zhì)量濃度為45 g/L時(shí)，糖利用率為92.05%，此時(shí)乙醇得率最大，為68.98%。綜合考慮糖利用率和乙醇得率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知最適初始碳源質(zhì)量濃度為45 g/L。

圖4 初始碳源質(zhì)量濃度對固定化混合菌發(fā)酵性能影響Fig. 4 Effect of initial carbon source concentration on fermentation by immobilized mixed yeast

2.2.2 休哈塔假絲酵母和釀酒酵母比例對固定化混合菌發(fā)酵的影響

發(fā)酵液中含有葡萄糖和木糖，休哈塔假絲酵母能同步利用葡萄糖和木糖，釀酒酵母則只能利用葡萄糖，有效確定休哈塔假絲酵母和釀酒酵母比例對固定化混合菌發(fā)酵具有重要作用。本試驗(yàn)中休哈塔假絲酵母和釀酒酵母的比例(體積比)分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1，初始碳源質(zhì)量濃度為45 g/L，在30℃、170 r/min條件下發(fā)酵24 h，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，休哈塔假絲酵母和釀酒酵母比例對糖利用率影響較小，均保持在93%左右，其中，當(dāng)休哈塔假絲酵母和釀酒酵母的比例為4∶1時(shí)，糖利用率最高，為94.87%。乙醇得率隨休哈塔假絲酵母菌增加呈先增加后減小趨勢，這可能是因?yàn)獒劸平湍讣?xì)胞只能利用葡萄糖，而休哈塔假絲酵母可同步利用葡萄糖和木糖，由于休哈塔假絲酵母比例增大，提高了木糖利用效率。在休哈塔假絲酵母和釀酒酵母的比例為4∶1時(shí)，乙醇得率最高，為64.65%。綜合考慮糖利用率和乙醇得率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知兩種菌的最適比例為4∶1。

圖5 休哈塔假絲酵母和釀酒酵母比例對固定化混合菌發(fā)酵性能的影響Fig. 5 Effect of proportion of C. shehatae andS. cerevisiae on fermentation byimmobilized mixed yeast

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對固定化混合菌發(fā)酵的影響

由于休哈塔假絲酵母和釀酒酵母發(fā)酵時(shí)對氧氣需求量不同，本試驗(yàn)通過改變搖床轉(zhuǎn)速以控制兩種酵母菌的需氧量。初始碳源質(zhì)量濃度為45 g/L，休哈塔假絲酵母和釀酒酵母比例為4∶1，搖床轉(zhuǎn)速分別為150，170，190 和210 r/min，在30℃條件下發(fā)酵24 h，結(jié)果見圖6。隨搖床轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵液中通氧量增加，加快了酵母菌對糖的利用效率。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為190 r/min時(shí)，糖利用率達(dá)最大值，為97.07%，乙醇得率為65.53%。乙醇得率隨搖床轉(zhuǎn)速增加呈先增加后減少趨勢，這是因?yàn)檫^大氧氣量使得酵母菌利用更多底物來生長酵母菌。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min時(shí)，糖利用率95.18%，乙醇得率最高，可達(dá)69.83%。綜合考慮糖利用率和乙醇得率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知最適搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對固定化混合菌發(fā)酵性能的影響Fig. 6 Effect of shaking speed on fermentation by immobilized mixed yeast

2.2.4 發(fā)酵溫度對固定化混合菌發(fā)酵的影響

休哈塔假絲酵母和釀酒酵母的最適發(fā)酵溫度不同，一般認(rèn)為，酵母細(xì)胞的最適發(fā)酵溫度為27～35℃[21]。為確定固定化混合菌的最適發(fā)酵溫度，本試驗(yàn)研究了固定化混合菌在溫度分別為28，30，32和34℃條件下的發(fā)酵效果。初始碳源質(zhì)量濃度為45 g/L，兩種菌的比例為4∶1，搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min條件下發(fā)酵24 h，結(jié)果見圖7。隨溫度升高，糖利用率從95.10%下降至92.19%；乙醇得率在發(fā)酵溫度為30℃時(shí)達(dá)到最大值，為68.34%，隨后乙醇得率逐漸下降。這可能是因?yàn)殡S溫度升高，酵母菌在發(fā)酵過程中受到抑制作用。綜合考慮糖利用率和乙醇得率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知30℃為最適發(fā)酵溫度。

圖7 發(fā)酵溫度對固定化混合菌發(fā)酵性能的影響Fig. 7 Effect of temperature on fermentation by immobilized mixed yeast

2.3 優(yōu)化前后固定化混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵比較分析

優(yōu)化前后固定化混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵的比較結(jié)果見圖8。優(yōu)化后的固定化混合菌在發(fā)酵4 h時(shí)葡萄糖基本被利用完，碳源質(zhì)量濃度僅剩2.13 g/L，葡萄糖代謝速率加快，從而減少了對木糖的抑制效果，提高了木糖利用效率。發(fā)酵24 h時(shí)，優(yōu)化后的固定化混合菌發(fā)酵乙醇的質(zhì)量濃度為15.21 g/L，比優(yōu)化前提高了10.70%。

圖8 優(yōu)化前后固定化混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵過程比較Fig. 8 Comparison of pentose and hexose simultaneous fermentation by immobilized mixed yeast before and after optimization

3 結(jié) 論

筆者以海藻酸鈣為固定化載體，通過比較固定化混合菌種和固定化休哈塔假絲酵母單菌發(fā)酵效果，研究了固定化混合菌種對戊糖和己糖同步發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的影響。固定化混合菌發(fā)酵時(shí)，釀酒酵母細(xì)胞能夠快速利用葡萄糖，從而解除了發(fā)酵過程中葡萄糖代謝對木糖代謝的抑制作用，增加木糖的利用時(shí)間，與固定化單菌發(fā)酵相比，發(fā)酵時(shí)間縮短了16.67%，乙醇質(zhì)量濃度提高了12.12%。對固定化混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并比較了優(yōu)化前后固定化混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵效果。優(yōu)化后固定化混合菌發(fā)酵乙醇的質(zhì)量濃度為15.21 g/L，比優(yōu)化前提高了10.70%。本研究利用固定化混合菌戊糖和己糖同步發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，木糖代謝速率慢，發(fā)酵時(shí)間長，且容易積累中間產(chǎn)物，影響了木糖的發(fā)酵效率，在今后的工作中將通過對木糖發(fā)酵菌馴化或構(gòu)建高效代謝的木糖發(fā)酵菌以提高木糖發(fā)酵效率。

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Co-fermentation of pentose and hexose to ethanol byimmobilized mixed yeasts method

JIANG Feng, FANG Lingyan, WANG Hao, ZHU Junjun, FAN Yimin, SONG Xiangyang*

(CollegeofChemicalEngineering,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China)

To study the effect of immobilized multi-microorganisms method on ethanol fermentation, strains ofCandidashehataeandSaccharomycescerevisiaewere immobilized on calcium alginate by embedding technology for the simultaneous fermentation of pentose and hexose. Meanwhile, the fermentation conditions of immobilized mixed multi-microorganisms were optimized. The results showed that the immobilization ofC.shehataeandS.cerevisiaerapidly increased the rate of glucose consumption and effectively relieved the inhibition of xylose consumption caused by glucose metabolism. Specifically, compared with that of individually immobilizedC.shehatae, the fermentation time of immobilized mixed yeast decreased from 24 h to 20 h, which reduced by 16.67%. The yield of ethanol increased from 13.28 g/L to 14.89 g/L, which increased by 12.12%. The optimal conditions of immobilized mixed yeast are as follows: 45 g/L of mixed sugar (glucose and xylose) as carbon source, fermentation temperature of 30℃, shaking speed of swing bed at 170 r/min, and the inoculation ratio ofC.shehataeandS.cerevisiaeat 4∶1. Under the above fermentation conditions, the maximum yield of 15.21 g/L total ethanol was achieved from the simultaneous fermentation of pentose and hexose. The yield of ethanol increased by 10.70% with the immobilized mixed multi-microorganisms method. The results of this study could provide some basic information for the industrialization of produce ethanol by immobilized mixed yeast method.

C.shehatae;S.cerevisiae; immobilized cells; fermentation of mixed yeasts; optimization

2016-11-30

2017-01-12

國家自然科學(xué)基金(30871992)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

江楓，男，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。通信作者：宋向陽，男，教授。E-mail:xiangyangsong@hotmail.com

TQ920.6

A

2096-1359(2017)04-0090-06