魚皮膠原蛋白肽脫腥脫色工藝研究

大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院叢瑤黃婧阿依夏穆·買買提蔣仕潔石佳琦徐晨輝溫鳳凌趙慧

魚皮膠原蛋白肽脫腥脫色工藝研究

大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院叢瑤黃婧阿依夏穆·買買提蔣仕潔石佳琦徐晨輝溫鳳凌趙慧

本實(shí)驗(yàn)以鯉魚皮為原料，通過蒸煮法制備明膠，選用水解度高的胰蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)明膠進(jìn)行酶解，研究了D4006、D3520、X-5、AB-8四種吸附樹脂對(duì)鯉魚皮明膠水解液脫腥、脫色的效果；測(cè)定吸附后產(chǎn)物的蛋白損失率，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，篩選出樹脂類型。通過測(cè)定，胰蛋白酶水解度為19.19%，中性蛋白酶為15.25%；D4006樹脂對(duì)中性蛋白酶的明膠水解液脫腥、脫色的效果最佳，此時(shí)條件為樹脂與酶解液之比為5g∶100ml，脫腥、脫色時(shí)間為3h，溫度為25℃。

鯉魚皮；明膠；酶解；樹脂；脫腥與脫色

膠原蛋白多存在于動(dòng)物的真皮、肌肉、骨骼等部位，約占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的25%～30%[1]，在生物體器官組織的形成中起重要作用，并參與細(xì)胞多種功能的表達(dá)。膠原蛋白在生物制藥上有廣泛的應(yīng)用，包括治療骨關(guān)節(jié)炎、高血壓，以及植入人體，用于組織的再生和修復(fù)[2-5]。明膠是在膠原蛋白的基礎(chǔ)上將動(dòng)物的皮、骨、韌帶等進(jìn)行精制后得到的一種膠體物質(zhì)，是膠原蛋白的變性產(chǎn)物，可作為食物的穩(wěn)定劑、增稠劑，也可應(yīng)用于糖果中，使其更加堅(jiān)韌、具有彈性。

膠原蛋白和明膠多來源于牛、豬，但隨著瘋牛病、口蹄疫的傳播及宗教因素影響，限制了該類動(dòng)物膠原蛋白的應(yīng)用[6]。我國(guó)海洋漁業(yè)資源極為豐富，在魚類加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量未被利用的皮、鱗、骨和鰭等下腳料。因此，以魚類下腳料作為膠原蛋白、明膠的來源，既可避免疾病風(fēng)險(xiǎn)，也可提高魚類加工利用率。由于膠原蛋白和明膠分子量較大，導(dǎo)致生物體吸收緩慢，而利用酶法將其水解成分子量較小的生物活性肽，可減小人體腸胃消化吸收的負(fù)荷，利于發(fā)揮其效應(yīng)[7]。但由于魚類明膠的酶解產(chǎn)物會(huì)帶有一定的色素和腥味，阻礙了其在食品行業(yè)的推廣和發(fā)展，因此對(duì)膠原蛋白肽的脫腥脫色已成為一項(xiàng)重要的研究?jī)?nèi)容。

脫腥脫色的方法可分為感官掩蔽法、物理法、化學(xué)法、生物法[8]，實(shí)驗(yàn)中常見有活性炭法、氧化還原法、酵母法及樹脂吸附法等[9-10]。其中樹脂吸附法對(duì)有機(jī)物有較好的選擇性，可以分離有毒物質(zhì)，吸附量大、機(jī)械強(qiáng)度高，同時(shí)樹脂的物理和化學(xué)性質(zhì)也較為穩(wěn)定，并且一般利用水、稀酸稀堿或者有機(jī)溶劑即可令其再生。

本實(shí)驗(yàn)以鯉魚皮為原料制備明膠多肽，對(duì)不同樹脂的脫腥脫色效果進(jìn)行對(duì)比分析，確定了明膠多肽的提取、脫腥脫色條件。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

原料：鯉魚皮。

試劑：氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈉、石油醚、水合茚三酮、L-酪氨酸、無(wú)水碳酸鈉、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純。

酶制劑：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶均購(gòu)于天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；胃蛋白酶購(gòu)于上海蓮冠生物化工有限公司。

樹脂：D4006型樹脂、X-5型樹脂、D3520型樹脂、AB-8型樹脂購(gòu)于天津南開大學(xué)樹脂有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

BS224S分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

101-2-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

PHS-3C型精密PH計(jì)：上海安亭昌吉路149號(hào)雷磁儀器廠；

721可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；

YXZ80B高溫高壓蒸煮鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；

HJ-6多頭磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；

RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；

WD-9405A脫色搖床：北京六一儀器廠。

1.3 主要方法

1.3.1 鯉魚皮基本組分測(cè)定

水分：GB5009.3—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)〈食品中水分的測(cè)定〉》；

灰分：GB5009.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)〈食品中灰分的測(cè)定〉》；

粗蛋白質(zhì)：GB5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)〈食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定〉》；

粗脂肪：GB14772—2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》。

1.3.2 原料預(yù)處理

將鯉魚皮浸泡在0.1mol/LNaOH、NaCl的混合溶液（V/V=1：1）中4～6小時(shí)，用蒸餾水清洗至中性后浸泡于1%醋酸溶液中10min，除去魚表層黑皮及雜質(zhì)。

1.3.3 魚皮膠原蛋白肽的制備

將預(yù)處理后的魚皮與蒸餾水按料液比1∶3混合，調(diào)節(jié)pH值至6～6.5，在121℃下蒸煮20min，抽濾、冷凍干燥得到明膠固體。

配制4%的明膠（W/V）溶液，分別加入表1[11]中5種蛋白酶（W/V=4：100），依照對(duì)應(yīng)條件酶解明膠溶液，恒溫酶解6小時(shí)[13]，反應(yīng)結(jié)束在100℃下滅酶10min。

表1 蛋白酶最適反應(yīng)條件

1.3.4 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定

采用茚三酮比色法[12]測(cè)定明膠水解液水解度，篩選出A、B兩種效果較好的酶解液。

1.3.5 明膠酶解液的脫腥、脫色

采用D4006型、D3520型、X-5型以及AB-8型四種吸附樹脂對(duì)A、B水解液進(jìn)行脫腥脫色處理。向250ml錐形瓶中分別加入5g樹脂和100ml酶解液，在25℃下恒溫振蕩3h，抽濾后取上清液冷凍干燥并稱量，設(shè)置空白組（即不加入任何樹脂）作為對(duì)照，計(jì)算蛋白質(zhì)損失率。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

培養(yǎng)10名感覺器官機(jī)能良好[13]的檢察人員對(duì)脫腥脫色后的產(chǎn)物從色澤、氣味以及滋味三方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并按照表2填寫評(píng)價(jià)表格；對(duì)10名檢查人員的感官評(píng)價(jià)作統(tǒng)計(jì)并計(jì)算分析，分值越小表明測(cè)定結(jié)果越好。

表2 脫腥脫色評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與討論

2.1 鯉魚皮基本組分分析

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。魚皮的基本組分含量如下：

表3 鯉魚皮基本組分含量

由表3可看出，鯉魚皮蛋白質(zhì)的含量約占魚皮干重的28.32%，膠原蛋白十分豐富，表明鯉魚皮具有很高的研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)中利用蒸煮法提取魚皮明膠產(chǎn)率占魚皮干重的68.31%，與魚皮初始蛋白質(zhì)含量相比減少了17.09%，而產(chǎn)生這一差值的主要原因是在去除魚皮黑色表皮過程中損失了部分膠原蛋白。

2.2 蛋白酶水解度分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

以明膠蛋白質(zhì)為橫坐標(biāo)測(cè)定數(shù)值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 蛋白酶水解度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=1.1450x-0.1442，R2=0.9910；該標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值趨近于1，說明線性回歸好，數(shù)據(jù)與曲線吻合度高。

2.2.2 不同蛋白酶水解度的測(cè)定

根據(jù)待測(cè)樣品的光密度值從所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得明膠蛋白質(zhì)含量，并根據(jù)蛋白酶水解度公式計(jì)算出中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶五種不同酶解液蛋白質(zhì)的水解度（圖2）。

圖2 蛋白酶水解度測(cè)定結(jié)果

由圖2可看出，在酶最適條件下反應(yīng)相同時(shí)間，五種蛋白酶對(duì)魚皮明膠的酶解均有一定效果，其中蛋白質(zhì)水解度較高的兩種酶依次為胰蛋白酶和中性蛋白酶，水解度分別是19.19%和15.25%，因此，可篩選出的胰蛋白酶和中性蛋白酶的酶為酶解使用酶。

2.3 明膠酶解液脫腥、脫色分析

用D4006型、D3520型、X-5型以及AB-8型樹脂分別對(duì)胰蛋白酶、中性蛋白酶兩種酶解液分別進(jìn)行脫腥脫色處理，并將樣品冷凍干燥，計(jì)算得到兩種酶解液的蛋白質(zhì)損失率（圖3）。

圖3 蛋白質(zhì)損失率

由圖3可看出，在相同反應(yīng)條件下，中性蛋白酶酶解液的蛋白質(zhì)損失率普遍低于胰蛋白酶酶解液，且經(jīng)D4006型吸附樹脂處理過的魚皮明膠酶解液的蛋白質(zhì)損失率低于其他型號(hào)樹脂，其中經(jīng)D4006型樹脂吸附后的中性蛋白酶酶解液效果最佳，其蛋白質(zhì)損失率為7.27%。

2.4 感官鑒定評(píng)估結(jié)果分析

D4006型、D3520型、X-5型和AB-8型樹脂對(duì)中性蛋白酶、胰蛋白酶兩種酶解液脫腥脫色后的感官評(píng)價(jià)結(jié)果（圖4～圖6）。

圖4 不同樹脂對(duì)中性蛋白酶酶解液脫腥脫色感官評(píng)價(jià)

由圖4可知，空白組在色澤、氣味和滋味三方面的感官分值分別為2.6、3.7、3.4，與空白相比較，經(jīng)不同樹脂處理后的樣品感官分值均低于空白組，表明上述四種樹脂對(duì)中性蛋白酶酶解液具有一定的脫腥脫色效果，處理后的樣品在色澤、氣味及滋味方面有明顯的改善。其中，對(duì)中性蛋白酶酶解液脫色效果較好一組為X-5型樹脂組，平均分值為1.6；脫腥效果較好的是D4006型樹脂組，分值為1.8；口感滋味較好的是D4006型，分值為2.3。

圖5 不同樹脂對(duì)胰蛋白酶酶解液脫腥脫色感官評(píng)價(jià)

由圖5可知，空白組在色澤、氣味和滋味上的感官分值依次為4.7、3.0、3.5，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組在色澤、氣味和滋味上均得到了一定的改善，其中對(duì)胰蛋白酶酶解液脫色效果較好的樹脂為D4006型樹脂，平均分值為3.0；脫腥效果較好的是D4006型樹脂，分值為2.3；而口感滋味較好的是X-5型，分值為1.7。

圖6 蛋白酶酶解產(chǎn)物脫腥脫色整體感官評(píng)價(jià)

由6圖可知，四種樹脂對(duì)中性蛋白酶酶解液的脫腥脫色效果優(yōu)于胰蛋白酶酶解液，經(jīng)D4006型樹脂吸附后的酶解液整體感觀評(píng)價(jià)也優(yōu)于其他型號(hào)樹脂，且經(jīng)D4006型樹脂吸附后的酶解液的蛋白質(zhì)損失率也低于其他實(shí)驗(yàn)組。中性蛋白酶價(jià)格較低，適合工業(yè)化推廣，所以可以選用中性蛋白酶酶解魚皮明膠，并利用D4006型樹脂對(duì)明膠酶解液進(jìn)行脫腥脫色處理。

3 結(jié)論

（1）通過測(cè)定蛋白質(zhì)水解度，從中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中選取水解度較高的胰蛋白酶和中性蛋白酶兩種酶解液，水解度分別為19.19%，15.25%。

（2）對(duì)兩種酶解液分別用D4006、D3520、X-5和AB-8樹脂進(jìn)行脫腥、脫色研究，經(jīng)D4006樹脂處理過的魚皮明膠酶解液的蛋白質(zhì)干重?fù)p失率與感官評(píng)估分值較低，其中胰蛋白酶水解液干重?fù)p失率為7.97%，中性蛋白酶為7.27%。

（3）以D4006樹脂的脫腥脫色效果最佳，此時(shí)脫腥脫色條件為樹脂與魚皮明膠酶解液料液比為5g∶100ml，反應(yīng)時(shí)間3h，溫度為25℃。

[1]蔣挺大.膠原與膠原蛋白[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2006.

[2]GómezguillénMC,GiménezB,LópezcaballeroM E,etal.Functionalandbioactivepropertiesofcollagenand gelatinfromalternativesources：Areview[J].FoodHydrocolloids, 2012,25(08)：1813～1827.

[3]ZengL,LiLI,WangJB.ResearchProgressin FunctionCharacteristicsandPreparationTechnologyofAquatic CollagenProteinPeptidesLiteratureReview[J].Journalof ZhejiangOceanUniversity,2013.

[4]MaL,GaoC,MaoZ,etal.Enhancedbiologicalstability ofcollagenporousscaffoldsbyusingaminoacidsasnovel cross-linkingbridges.[J].Biomaterials,2004,25(15)：2997～3004.

[5]傅燕鳳,沈月新.淺談魚皮膠原蛋白的利用[J].食品研究與開發(fā),2004,25(02)：16～18.

[6]尹利端,石麗花,王桐等.海洋膠原蛋白肽在功能性食品中的應(yīng)用[J].明膠科學(xué)與技術(shù),2013,33(02)：55～58.

[7]宋維春,徐云升.水解明膠運(yùn)動(dòng)飲料的研究[J].食品工業(yè)科技,2005(02)：138～139.

[8]馮怡,汪薇,任文彬等.魚制品脫腥方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2014,33(12)：16～18.

[9]GuoYH,Yu-JinLI,Xin-YingWU,etal.Study ondecolorizinganddeodorizationofcodskinenzymolysis collagenpeptideliquid[J].ChinaFoodAdditives,2010.

[10]Jiu-HuMA.StudyonDeodorizationandDecolorizing TechnologyofKelp[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences, 2008,36(23)：10186～10005.

[11]馮偉偉,鄒艷敏,茆廣華等.人工養(yǎng)殖中華鱘魚皮中膠原蛋白提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(25)：12653.

[12]郭興鳳.蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定[J].中國(guó)油脂,2000,25(06)：176～177.

[13]郭玉華,李鈺金,吳新穎等.鱈魚皮膠原蛋白肽酶解液脫色脫腥工藝的研究[J].中國(guó)食品添加劑,2010(04)：125～128.