高效排阻液相色譜法分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量和純度

高雪麗 陳復(fù)生 張麗芬 郭興鳳 樊明濤

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院1，鄭州 450001) (許昌學(xué)院食品學(xué)院2，許昌 461000) (西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院3，楊凌 712100)

高效排阻液相色譜法分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量和純度

高雪麗1,2,3陳復(fù)生1張麗芬1郭興鳳1樊明濤3

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院1，鄭州 450001) (許昌學(xué)院食品學(xué)院2，許昌 461000) (西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院3，楊凌 712100)

本文采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量和純度。首先，對(duì)SE-HPLC的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳的SE-HPLC色譜條件是：洗脫液(水/乙腈)70/30，洗脫液流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。其次，繪制分子質(zhì)量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為L(zhǎng)og (M)=-0.222 1x+3.878 9，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 9。以10倍信噪比確定定量限，得到7S(y=299.59x+3.771 2，R2=0.979 2)和11S(y=197.08x+4.148 5，R2=0.986 1)純度分析標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。最后根據(jù)分子質(zhì)量和純度分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量和純度。將所提純的7S和11S樣品的分子質(zhì)量與7S和11S標(biāo)品特征峰分子質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，表明所提純樣品為7S和11S。本試驗(yàn)所制得7S和11S的純度分別達(dá)到86.3%和92.0%。

高效排阻液相色譜 大豆7S和11S球蛋白 分子質(zhì)量 純度

大豆蛋白根據(jù)生理功能，可分為貯藏蛋白和生物活性蛋白兩大類(lèi)。貯藏蛋白約占蛋白質(zhì)的75%左右，大豆7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白，7S)和大豆11S球蛋白(11S)占大豆貯藏蛋白的80%多，它們與大豆制品的加工性質(zhì)關(guān)系比較密切[1-4]。因此，為了研究大豆7S和11S球蛋白的性質(zhì)及其在食品加工中的應(yīng)用，需對(duì)其進(jìn)行分離提純。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)大豆7S和11S球蛋白分離純化的研究較多[5-15]。這些研究大多針對(duì)大豆7S和11S組分的得率、蛋白質(zhì)含量，而對(duì)于最終樣品的純度、分子質(zhì)量鑒定較少，或只采用SDS-PAGE電泳法進(jìn)行鑒定。

蛋白質(zhì)的定量鑒定方法很多，如SDS-PAGE電泳法、等電聚焦電泳法、N-末端氨基酸殘基分析、高效液相法等。由于蛋白質(zhì)數(shù)量多，性質(zhì)相似者在所難免，一個(gè)條件下兩個(gè)蛋白質(zhì)不能分開(kāi)的可能性是很大的，選用任何一種鑒定方法都不能完全確定蛋白質(zhì)的純度，必須同時(shí)采用2～3種不同的純度鑒定法才能確定[16]。高效排阻液相色譜(size exclusion-high-performance liquid chromatography, SE-HPLC)是定性和定量分析貯藏蛋白的有效方法，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行SE-HPLC分析，可以定量蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布及純度，且檢測(cè)靈敏度高、速度快[17-18]。其測(cè)定提取蛋白的原理是通過(guò)樣品色譜柱中的固定相，把樣品溶在流動(dòng)相里，經(jīng)過(guò)色譜柱，樣品會(huì)在流動(dòng)相與固定相之間徘徊，不同性質(zhì)貯藏蛋白，在各相中停留的時(shí)間比例也不同，就造成速度不同，最后到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間就不同，在顯示器上的圖形就會(huì)出峰，實(shí)現(xiàn)分離[19-21]。

本研究采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量和純度，對(duì)于大豆7S和11S球蛋白提取中的定量鑒定有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脫脂豆粉(TSF)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)54.2%：鄭州同創(chuàng)益生食品有限公司；SDS：天津市光復(fù)精密化工；鹽酸：洛陽(yáng)市昊華公司；三氨基甲烷(Tris)：上海市山浦化工有限公司；甘氨酸(氨基乙酸)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；AP(過(guò)硫酸銨)：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；15～600 Ku 蛋白標(biāo)品(808541，色譜級(jí))、大豆7S球蛋白標(biāo)品(C5868，色譜級(jí))、大豆11S球蛋白標(biāo)品(G3171，色譜級(jí))：Sigma公司；其他化學(xué)試劑(分析純)：鄭州新風(fēng)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

D-37520真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Kendro公司；2300K全自動(dòng)凱氏定氮儀：瑞典FOSS TECATOR公司；HMS-3C型精密酸度計(jì)：臺(tái)州市新恩精密糧儀器有限公司；D-37520型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Kendro公司；2300K全自動(dòng)凱氏定氮儀：瑞典FOSS TECATOR公司； 1200高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司(中國(guó))；SEC G4000SW高效排阻液相色譜柱：日本TSK公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆7S和11S球蛋白的提取

大豆7S和11S球蛋白的提取方法參照文獻(xiàn)[22]。

1.3.2 高效排阻液相色譜(SE-HPLC)法分析條件的優(yōu)化

采用SE-HPLC，用 TSK SEC 4000 柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行分離。洗脫液為色譜純乙腈和水(含0.05%三氟乙酸)(V/V)，采樣時(shí)間為18 min。在214 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量(ku)為：核糖核酸酶A(13.7)、卵清蛋白(44.3)、醛縮酶(150)和甲狀腺球蛋白(670)。每個(gè)樣品平行測(cè)量3次。所有待測(cè)樣溶液進(jìn)行SE-HPLC分析前，需經(jīng)過(guò)0.45 μm的PVDF過(guò)濾器過(guò)濾。

1.3.2.1 洗脫液(水/乙腈)比例的優(yōu)化

開(kāi)始采樣后，控制流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量15 μL，洗脫液水/乙腈分別為60/40、68/32、70/30、72/28和80/20進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)條件平行測(cè)量3次。采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析和對(duì)比，確定洗脫液(水/乙腈)的比例。

1.3.2.2 洗脫液流速的優(yōu)化

開(kāi)始采樣后，將條件設(shè)置為：進(jìn)樣量15 μL，洗脫液(水/乙腈)70/30，流速分別為0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min，進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)條件平行測(cè)量3次。采樣分析，進(jìn)行分析和對(duì)比，確定最佳流速。

1.3.2.3 進(jìn)樣量的優(yōu)化

開(kāi)始采樣后，將條件設(shè)置為：流速1.0 mL/min，洗脫液(水/乙腈)70/30，進(jìn)樣量分別為10、15、20 μL，進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)條件平行測(cè)量3次。采樣分析，進(jìn)行分析和對(duì)比，確定最佳進(jìn)樣量。

1.3.3 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量

1.3.3.1 大豆7S和11S球蛋白分子質(zhì)量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1.3.2中蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)1.3.2的優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置SE-HPLC分離條件。采集分析，對(duì)SE-HPLC分離條件優(yōu)化效果進(jìn)行驗(yàn)證。并繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間的線性擬合圖。

1.3.3.2 大豆7S和11S球蛋白分子質(zhì)量的分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取提純后的7S和11S 20.0 mg(精確到0.1 mg)，置于50 mL容量瓶中，用色譜純水溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的待測(cè)樣溶液。根據(jù)1.3.2的優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置SE-HPLC分離條件，采集分析。得到7S和11S的SE-HPLC色譜圖，根據(jù)1.3.3.1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)7S和11S的分子質(zhì)量進(jìn)行分析。

1.3.4 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的純度

1.3.4.1 大豆7S和11S球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

7S和11S標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 mg(精確到0.1 mg)標(biāo)準(zhǔn)品，置于不同的10 mL容量瓶中，用色譜純水溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度為500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；準(zhǔn)確移取0.04、0.1、0.2、0.4 mL 7S或11S標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別加入0.96、0.9、0.8、0.6 mL色譜純水，即得濃度分別為20、50、100、200 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.4.2 大豆7S和11S球蛋白純度分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1.3.4.1中質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、500 μg/mL的系列7S和11S標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)1.3.2中的優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置SE-HPLC分離條件，采集分析。得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度與峰面積的線性擬合曲線方程。

1.3.4.3 大豆7S和11S球蛋白純度的分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取提純后的7S和11S 20.0 mg(精確到0.1 mg)，置于50 mL容量瓶中，用色譜純水溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的待測(cè)樣溶液。根據(jù)1.3.2中的優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置SE-HPLC分離條件，采集分析。得到7S和11S的SE-HPLC色譜圖，對(duì)色譜圖中7S和11S峰面積進(jìn)行積分，根據(jù)1.3.4.2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，對(duì)7S和11S的純度進(jìn)行定量。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用 GraphPad Prism 5和Origin 8.5軟件作圖，采用 SASV 8 分析系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 SE-HPLC分析條件的優(yōu)化

2.1.1 洗脫液(水/乙腈)比例的優(yōu)化

水/乙腈分別為60/40、68/32、70/30、72/28、80/20的SE-HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1a可知，當(dāng)水/乙腈為60/40時(shí)，4種蛋白，核糖核酸酶A(13.7)、卵清蛋白(44.3)、醛縮酶(150)和甲狀腺球蛋白(670)中，僅3種組分有明顯的出峰。色譜峰從左向右依次為醛縮酶(150)、卵清蛋白(44.3)、核糖核酸酶A(13.7)。而分子質(zhì)量較大的甲狀腺球蛋白(670)雖有出峰趨勢(shì)，但不明顯。當(dāng)水/乙腈為70/30時(shí)(圖1c)，4種組分均獲得了良好的分離效果。然而，當(dāng)水/乙腈為72/28、80/20時(shí)(圖1d、e)，分子質(zhì)量較大的組分的出峰不明顯。

圖1 不同水/乙腈的SE-HPLC色譜圖

因此可知，隨著水/乙腈混合溶液中水分比例的增大，液相色譜對(duì)4種蛋白組分的分離效果也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是生物大分子，有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)組成，具有一定的極性，水/乙腈不同，洗脫液極性不同，只有合適的洗脫液極性才有利于蛋白質(zhì)在液相中的分離。當(dāng)洗脫液水/乙腈為70/30時(shí)，分離效果較好，4種組分都出現(xiàn)在色譜圖中，得到有效的分離，峰型也較好。因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇洗脫液水/乙腈為70/30。

2.1.2 進(jìn)樣量的優(yōu)化

進(jìn)樣量分別為10、15、20 μL的SE-HPLC色譜圖見(jiàn)圖2。隨著進(jìn)樣量的逐漸增大，洗脫峰的響應(yīng)值在逐漸增加。當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，得到SE-HPLC色譜圖峰型較好，響應(yīng)值也適中。當(dāng)進(jìn)樣量繼續(xù)增大到為15、20 μL時(shí)，得到SE-HPLC色譜圖反而峰型不好，峰的分離度也受到一定的影響，另外，進(jìn)樣量大也對(duì)標(biāo)品造成浪費(fèi)，增加試驗(yàn)的成本。響應(yīng)值太低影響峰的觀察，也難以區(qū)分樣品峰和含有微量雜質(zhì)的雜質(zhì)峰。因此本試驗(yàn)確定的最佳進(jìn)樣量為10 μL。

圖2 不同進(jìn)樣量的SE-HPLC色譜圖

2.1.3 洗脫液流速的優(yōu)化

圖3是洗脫液流速分別為0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min的SE-HPLC色譜圖。由圖3可知，隨著洗脫液流速的逐漸增大，洗脫峰出來(lái)的時(shí)間在逐漸縮短。洗脫液流速過(guò)小，峰的保留時(shí)間就大，增加檢測(cè)時(shí)間。洗脫液流速過(guò)大，峰的保留時(shí)間就小，影響峰的分離效果。本試驗(yàn)所選的幾個(gè)洗脫液流速對(duì)峰型的影響不大。隨著洗脫液流速的逐漸增大，離縱軸最近的峰的峰型也有微量的變化。綜合分析，選取洗脫液流速為1.0 mL/min。

圖3 不同洗脫液流速的SE-HPLC色譜圖

因此，最佳的SE-HPLC色譜條件為：洗脫液(水/乙腈)70/30，洗脫液流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述最佳SE-HPLC色譜條件進(jìn)行采樣。標(biāo)準(zhǔn)蛋白的SE-HPLC色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 最優(yōu)條件下的SE-HPLC色譜圖

由圖4可以看出，在優(yōu)化的SE-HPLC色譜條件下，標(biāo)品得到很好的分離，峰型較好，采樣時(shí)間適中，重復(fù)試驗(yàn)表明該條件下進(jìn)樣得到的SE-HPLC色譜圖重復(fù)性很好?？梢栽诖藘?yōu)化條件下對(duì)樣品進(jìn)行分子質(zhì)量及純度的鑒定。

2.2 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量

2.2.1 分析大豆7S和11S球蛋白分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

根據(jù)圖4最優(yōu)條件下的SE-HPLC色譜圖中標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留時(shí)間，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與出峰保留時(shí)間做線性擬合圖，得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與出峰保留時(shí)間的線性擬和方程Log (M)=-0.222 1x+3.878 9，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 9。

2.2.2 大豆7S和11S球蛋白分子質(zhì)量分析

在以上試驗(yàn)得到的最佳SE-HPLC色譜條件下，對(duì)7S和11S標(biāo)品及提純樣品進(jìn)行采樣。得到7S和11S標(biāo)品及提純樣品的SE-HPLC色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5a可以看出，11S標(biāo)品出現(xiàn)2個(gè)峰，7S標(biāo)品出現(xiàn)1個(gè)峰，從出峰個(gè)數(shù)上可以看出7S標(biāo)品的純度較高一些，這與標(biāo)品說(shuō)明書(shū)介紹的純度相一致。7S和11S是大豆蛋白的2個(gè)主要組分。11S的酸性亞基和一個(gè)基礎(chǔ)的肽通過(guò)二硫鍵連接在一起，11S的分子質(zhì)量約為360 000 Ku，約占大豆蛋白總量25%～35%，由6個(gè)不同的亞單位(多肽)組成的非糖蛋白，每個(gè)亞單位分別由1個(gè)酸性亞基和1個(gè)堿性亞基B通過(guò)二硫鍵連接而成。7S的分子質(zhì)量約為180 000 Ku，由 α、α’ 和 β亞基組成，約占大豆蛋白30%～35%[4, 14]。將7S和11S標(biāo)品的SE-HPLC色譜圖中出峰的保留時(shí)間代入蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)及出峰的保留時(shí)間的線性擬合方程，Log (M)=-0.222 1x+3.878 9，得到7S和11S的分子質(zhì)量與上述一致。

圖5b為所提純的7S和11S樣品的SE-HPLC色譜圖，7S和11S的SE-HPLC色譜圖中最大的峰與7S和11S標(biāo)品特征峰出峰時(shí)間一致，表明所提純樣品為7S和11S。

圖5 7S和11S標(biāo)品、樣品的SE-HPLC色譜圖

2.3 SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的純度

按1.3.4的方法進(jìn)行試驗(yàn)，以10倍信噪比確定定量限，得到7S和11S純度分析標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見(jiàn)表1。7S和11S均具有良好的線性關(guān)系(R2>0.970 0)，說(shuō)明用該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分析結(jié)果具有可靠性，可用于實(shí)際樣品的分析。按1.3.4.3的方法進(jìn)行試驗(yàn)，將得到峰面積帶入表1中的線性方程求得7S和11S的含量(相對(duì)于7S和11S標(biāo)品)，進(jìn)而求得7S和11S的純度。本試驗(yàn)所制得7S和11S的純度分別達(dá)到86.3%和92.0%。

表1 7S和11S含量分析的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論

本研究采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子質(zhì)量和純度，提供了一種快速鑒定大豆7S和11S球蛋白分子質(zhì)量和純度的方法，對(duì)SE-HPLC的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最佳的SE-HPLC色譜條件是：洗脫液(水/乙腈)70/30，洗脫液流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。采用SE-HPLC法分析7S和11S的分子質(zhì)量，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為L(zhǎng)og (M)=-0.222 1x+3.878 9，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 9。將所提純的7S和11S樣品的分子質(zhì)量與7S和11S標(biāo)品特征峰分子質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，表明所提純樣品為7S和11S。根據(jù)優(yōu)化的色譜條件對(duì)7S和11S標(biāo)品進(jìn)行采樣，以10倍信噪比確定定量限，得到7S(y=299.59x+3.771 2，R2=0.979 2)和11S(y=197.08x+4.148 5，R2=0.986 1)純度分析標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可以用于7S和11S純度的分析。本試驗(yàn)所制得7S和11S的純度分別達(dá)到86.3%和92.0%。

[1]Nishinari K, Fang Y, Guo S, et al. Soy proteins: A review on composition, aggregation and emulsification[J]. Food Hydrocolloids, 2014 (39): 301-318

[2]Klein B P, Perry A K, Adair N. Incorporating soy proteins into baked products for use in clinical studies[J]. The Journal of Nutrition, 1995, 125(3 Suppl): 666S-674S

[3]Leiner I E. Nutritional aspects of soy protein products[J]. Journal of The American Oil Chemists’ Society, 1977, 54(6): 454A-472A

[4]Delwiche S R, Pordesimo L O, Panthee D R, et al. Assessing glycinin (11S) and beta-conglycinin (7S) fractions of soybean storage protein by near-infrared spectroscopy[J]. Journal of The American Oil Chemists, Society, 2007, 84(12): 1107-1115

[5]李成賢. 大豆球蛋白、β-伴球蛋白的分離提取及對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞增殖和免疫功能的影響[D].成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007 Li C X. Isolation and extraction of glycinin and β-conglycinin and the influence of the extract on the proliferation and immune function of weaning young pigs peripheral bloodLymphocytomacells in vitro culture[D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2007

[6]徐君. 大豆球蛋白和β-伴球蛋白對(duì)小鼠腸上皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)生理功能的影響與分子機(jī)理研究[D]. 成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009 Xu J. The Influence of the extracted soybean glycinin and β-conglycinin on the function and molecular mechanism of miceintestinal-epithelial cells in primary cultivation[D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2009

[7]宋佳, 陳野, 鄭曉晨, 等. 大豆11S和7S球蛋白提取工藝優(yōu)化研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2013, 2: 77-81 Song J, Chen Y, Zheng X C, et al.Study on extraction process optimization of soybean 11S and 7S globulin[J]. Food Research and Development, 2013, 2: 77-81

[8]黃行健. 酶解大豆蛋白功能特性、結(jié)構(gòu)及在肉糜中的應(yīng)用[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010 Huang X J. Function character and strueture of hydrolyzed protein and application in pork paste[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2010

[9]張明成. 大豆蛋白中7S與11S組分的分離方法[J]. 綏化學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 5: 150-153 Zhang M C. Separation method of 7S and 11S from soy protein[J]. Journal of Suihua University, 2014, 5: 150-153

[10]Teng Z, Liu C, Yang X Q, et al. Fractionation of soybean globulins using Ca2+and Mg2+: A comparative analysis[J]. Journal of The American Oil Chemists’ Society, 2009, 86(5): 409-417

[11]Arone A G, Fasolin L H, Perrechil F D A, et al. Influence of drying conditions on the gelling properties of the 7S and 11S soy protein fractions[J]. Food and Bioproducts Processing, 2013, 91(2): 111-120

[12]Deng K Q, Huang Y R, Hua Y F. Isolation of glycinin (11S) from lipid-reduced soybean flour: effect of processing conditions on yields and purity[J]. Molecules, 2012, 17(3): 2968-2979

[13]Liu C, Wang H, Cui Z, et al. Optimization of extraction and isolation for 11S and 7S globulins of soybean seed storage protein[J]. Food Chemistry, 2007, 102(4): 1310-1316[14]Zhao X, Chen F, Xue W, et al. FTIR spectra studies on the secondary structures of 7S or 11S globulins from soybean proteins using AOT reverse micellar extraction[J]. Food Hydrocolloids, 2008, 22(4): 568-575

[15]朱曉燁, 遲玉杰, 劉紅玉. 大豆蛋白7S和11S組分分離方法的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2011(7): 267-269, 273 Zhu X Y, Chi Y J, Liu H Y. Optimization of separation method of 7S and 11S in soy protein[J]. Science and Technology of Food Industry, 2011, 7: 267-269, 273

[16]田琨. 大豆蛋白的結(jié)構(gòu)表征及應(yīng)用研究[D]. 上海: 復(fù)旦大學(xué), 2010 Tian K. Structure characterization and applieation of soy protein [D]. Shanghai: Fudan University, 2010

[17]Oszvald M, Tomoskozi S, Larroque O, et al. Characterization of rice storage proteins by SE-HPLC and micro z-arm mixer[J]. Journal of Cereal Science, 2008, 48(1): 68-76[18]李永紅, 裴德寧, 陶磊, 等. 重組人干擾素α2a成品中蛋白含量體積排阻高效液相色譜法的建立[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2013, 8: 1175-1178 Li Y H, Pei D N, Tao L, et al. Development of size exclusion-high performance liquid chromatography method for determination of protein content in final product of recombinant human interferon α2a[J]. Chinese Journal of Biologicals, 2013, 8: 1175-1178

[19]Mu W M, Zhang D F, Xu L, et al. Activity assay of his-tagged E. coli DNA photolyase by RP-HPLC and SE-HPLC [J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2005, 63(2): 111-124

[20]Nordqvist P, Johansson E, Khabbaz F, et al. Characterization of hydrolyzed or heat treated wheat gluten by SE-HPLC and C-13 NMR: Correlation with wood bonding performance[J]. Industrial Crops and Products, 2013(51): 51-61

[21]Tian Y Q, Li Y, Xu X M, et al. A novel size-exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) method for measuring degree of amylose retrogradation in rice starch[J]. Food Chemistry, 2010, 118(2): 445-448

[22]高雪麗, 陳復(fù)生, 張麗芬, 等. 大豆7S和11S球蛋白對(duì)面團(tuán)特性及饅頭品質(zhì)的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014(10): 13-18 Gao X L, Chen F S, Zhang L F, et al. Effects of 7S and 11S soy protein on the qualities of dough and chinese steamed bread[J]. Modern Food Science and Technology, 2014(10): 13-18.

Molecular Weight and Purity of Soy 7S, 11S Globulin Analyzed by Size Exclusion-High-Performance Liquid Chromatography

Gao Xueli1,2,3Chen Fusheng1Zhang Lifen1Guo Xingfeng1Fan Mingtao3

(College of Food Science and Technology，Henan University of Technology1, Zhengzhou 450001) (College of Food Science, Xuchang University2, Xuchang 461000) (College of Food Science, Northwest A&F University3, Yangling 712100)

In this paper, the molecular weight and purity of soy 7S, 11S globulin were quantificationally analyzed by SE-HPLC. Firstly, the optimization of the SE-HPLC chromatographic conditions were carried out, and the optimal SE-HPLC chromatographic conditions were: eluant (water/acetonitrile) 70/30, flow rate of eluant 1.0 mL/min, sample size 10 μL. Secondly, the standard curve of molecular weight analysis was drawn, and the standard curve equation of molecular weight was Log (M)=-0.222 1x+3.878 9, and the linear correlation coefficient wasR2=0.996 9. With the 10 times signal-to-noise ratio quantitative limit, the standard curve equation of 7S molecular purity (y=299.59x+3.7712,R2=0.979 2) and 11S molecular purity (y=197.08x+4.1485,R2=0.986 1) were obtained. Finally, this study provided a quick identification method of the molecular weight and purity of soy 7S, 11S globulin. The purity of 7S or 11S was respectively 86.3% and 92.0%.

size exclusion-high-performance liquid chromatography, soy 7S and 11S globulin, molecular weight, purity

863計(jì)劃(2013AA102208-5)，“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2014BAD04B10)

2015-07-18

高雪麗，女，1982年出生，博士，食品蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)及利用

陳復(fù)生，男，1963年出生，教授，食品蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)及利用 樊明濤，男，1963年出生，教授，生物技術(shù)、食品蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)及利用

TS21

A

1003-0174(2017)02-0098-06