雙酶法制備富含多酚的蕎麥濃縮蛋白及體外消化研究

陳雅君 陳小威 楊曉泉 郭 健 王金梅

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

雙酶法制備富含多酚的蕎麥濃縮蛋白及體外消化研究

陳雅君 陳小威 楊曉泉 郭 健 王金梅

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

開(kāi)發(fā)一種雙酶結(jié)合膜分離的方法制備富含多酚的蕎麥濃縮蛋白，系統(tǒng)比較了雙酶法與傳統(tǒng)堿溶酸沉法、鹽提法在蛋白質(zhì)及多酚的含量和回收率、溶解性等方面的差異；并結(jié)合SDS-PAGE、氮釋放量、膠束多酚釋放量等，考察了蕎麥濃縮蛋白的模擬體外消化。結(jié)果表明：相對(duì)于堿溶酸沉法和鹽提法，雙酶法制備蕎麥蛋白不僅具有較高的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(49.07%)和最高的蛋白回收率(57.93%)，而且多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(11.35%)顯著高于堿溶酸沉法(3.65%)和鹽提法(2.67%)，回收率更高達(dá)70.89%，多酚多以結(jié)合態(tài)與蛋白共存；體外消化試驗(yàn)后，3種殘?jiān)鞍譙DS-PAGE分析結(jié)果相似，分子質(zhì)量大于14.4 ku的組分全部裂解；此外，雙酶法制備的蕎麥蛋白氮釋放量相對(duì)較低(43.30%)，而膠束的多酚釋放量高達(dá)2.05%，是良好的抗消化蛋白。

蕎麥濃縮蛋白 多酚 雙酶法 堿溶酸沉法 鹽提法 體外消化

蕎麥(buckwheat, BW)在分類上屬于Polygonaceae屬禾谷類谷物，在全世界廣泛種植，尤其是北半球(如中國(guó)、俄羅斯)。由于蕎麥，尤其是苦蕎麥，富含高生物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)(8.51%～18.87%)、可食纖維(3%～15%)、豐富的多酚(1.97%～3.03%)以及優(yōu)質(zhì)的多聚不飽和脂肪酸等，近年來(lái)作為獨(dú)特的食藥兩用糧食在美國(guó)、加拿大、日本和歐洲備受歡迎[1-3]。蕎麥蛋白生理價(jià)值高，具有良好的氨基酸組成，尤其是富含其他植物蛋白缺乏的賴氨酸，生理作用甚至優(yōu)于大豆蛋白[4]。長(zhǎng)期食用蕎麥蛋白可抑制體脂肪蓄積、降血壓、改善便秘、抗衰老、抑制結(jié)石形成，降低乳腺癌和結(jié)腸癌的發(fā)病率，并能降低慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，這歸因于它高含量的多酚化合物(如蘆丁、槲皮素、阿魏酸等)與之結(jié)合存在[5-7]。且由于其本身對(duì)蛋白酶降解作用的敏感性，蕎麥蛋白還是天然的抗消化蛋白，類似于膳食纖維[8]。可應(yīng)用于功能性食品配料，可降低膽固醇，抑制脂肪蓄積，改善便秘，預(yù)防腫瘤發(fā)生以及改善腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的發(fā)酵過(guò)程等[9-10]。

近年來(lái)，對(duì)蕎麥的研究一直是熱點(diǎn)問(wèn)題，主要集中在蛋白或多酚成分的提取和理化性質(zhì)研究等方面。其中，國(guó)外對(duì)蕎麥蛋白的利用主要針對(duì)產(chǎn)品配料方面，改善食品的組織結(jié)構(gòu)，增加營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。而蕎麥蛋白的制備方法有多種，常用的有堿溶酸沉法[8]、鹽提法[11]、蛋白酶酶解法[12]等，其中堿溶酸沉法因其操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多[13]。然而，傳統(tǒng)的制備方法存在制得的蕎麥蛋白色澤深、純度低、回收率低以及多酚含量低等缺點(diǎn)[8]，未能使蕎麥的功能性成分得以充分保留，這大大阻礙了蕎麥蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究開(kāi)發(fā)一種雙酶結(jié)合膜分離的方法制備蕎麥濃縮蛋白，對(duì)比傳統(tǒng)堿溶酸沉法、鹽提法，探討其對(duì)多酚、蛋白含量及回收率的影響，并對(duì)蛋白質(zhì)的溶解性和體外消化性進(jìn)行了考察，旨在尋找高效制備富含多酚蕎麥濃縮蛋白的方法，以此推進(jìn)蕎麥生產(chǎn)和深加工，開(kāi)發(fā)新型功能性食品配料，形成新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎皮層粉、苦蕎芯層粉、苦蕎籽：四川大涼山甘洛縣；480L α-淀粉酶(480 KNU/g)：丹麥諾維信公司；糖化酶(≥2 100 U/g)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白：上海升正生物技術(shù)有限公司。

UV-2450分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；Rapid N Cube杜馬斯定氮儀：法國(guó)Elementar公司；CR22G高速冷凍離心機(jī)：日立Hitachi公司；Mini-Sub Cell電泳槽、電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蕎麥濃縮蛋白(BPC)的制備

1.2.1.1 雙酶法

取一定量苦蕎皮層粉與蒸餾水以料液比1∶15(m/V)混合，分散機(jī)6 000 r/min處理10 min后調(diào)節(jié)pH至6.0，添加5% 480L α-淀粉酶，并放置于70 ℃水浴攪拌(300 r/min)酶解3 h；隨后樣液冷卻至室溫并調(diào)節(jié)pH至4.0，添加5%糖化酶，于60 ℃水浴并攪拌(300 r/min)酶解1 h，并于100 ℃保溫5 min滅酶處理；冷卻至室溫后采用80 ku的聚砜膜進(jìn)行超濾滲濾，流速為1 500 mL/min，滲濾體積為上樣體積4倍，截留液經(jīng)冷凍干燥得雙酶法苦蕎麥濃縮蛋白，簡(jiǎn)稱雙酶法蛋白。

1.2.1.2 堿溶酸沉法

取一定量苦蕎皮層粉1∶20充分分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至8.0，磁力攪拌90 min，8 500 r/min離心20 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH至4.6，隨后8 500r/min離心20 min，得到蛋白沉淀物；二次水洗沉淀物，調(diào)節(jié)pH至7.0復(fù)溶，經(jīng)透析、冷凍干燥后得到堿溶酸沉法苦蕎麥濃縮蛋白，簡(jiǎn)稱堿溶酸沉法蛋白[8]。

中國(guó)國(guó)際商會(huì)副秘書長(zhǎng)張屹在致辭中表示，中國(guó)國(guó)際商會(huì)負(fù)責(zé)與瀾湄對(duì)口機(jī)構(gòu)開(kāi)展機(jī)制性的務(wù)實(shí)合作。作為2018瀾湄合作博覽會(huì)的主辦單位，中國(guó)國(guó)際商會(huì)積極發(fā)揮對(duì)外交流的渠道和專業(yè)服務(wù)的優(yōu)勢(shì)，為云南的對(duì)外開(kāi)放和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展作出一份貢獻(xiàn)。他強(qiáng)調(diào)，中國(guó)國(guó)際商會(huì)愿與瀾湄國(guó)家貿(mào)易投資促進(jìn)機(jī)構(gòu)和商協(xié)會(huì)組織共同努力，為瀾湄國(guó)家企業(yè)提供更好的專業(yè)化貿(mào)易信息以及投資、促進(jìn)、綜合一體化服務(wù)，為瀾湄國(guó)家綜合服務(wù)作出努力。

1.2.1.3 鹽提法

一定量苦蕎皮層粉與含0.033 mol/L NaHCO3的0.086 mol/L NaCl鹽溶液以料液比1∶10(m/V)混合，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，之后膠體磨4 000 r/min均質(zhì)分散處理15 min，液料10 000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)透析、冷凍干燥，即得鹽提法苦蕎麥濃縮蛋白，簡(jiǎn)稱鹽提法蛋白[11]。

1.2.2 蛋白含量及回收率測(cè)定

采用杜馬斯定氮法測(cè)定樣品中蛋白含量(×5.83)。根據(jù)所得蛋白提取物的質(zhì)量及蛋白質(zhì)純度、原料的質(zhì)量及蛋白質(zhì)純度，可得蛋白提取物的蛋白質(zhì)回收率：

蛋白回收率=[蛋白提取物質(zhì)量×蛋白提取物蛋白質(zhì)含量/(原料質(zhì)量×原料蛋白質(zhì)含量)]×100%

1.2.3 不同形態(tài)多酚及多酚回收率測(cè)定

多酚含量測(cè)定方法參考Carbonaro等[14]的方法。0.02～0.15 g樣品溶于1 mL 0.1 mol/L NaOH堿液中，10 000 r/min離心15 min，取2份上清液：一份上清液于紫外波長(zhǎng)328 nm處檢測(cè)，測(cè)定總酚吸光度A1；另一份加入等體積10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三氯乙酸(TCA)，沉淀蛋白質(zhì)，10 000 r/min離心15 min，上清液于328 nm處測(cè)定游離多酚吸光度A2；并以蘆丁標(biāo)品為參照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)合酚含量=總酚含量-游離酚含量。

多酚回收率=[蛋白提取物質(zhì)量×蛋白提取物多酚含量/(原料質(zhì)量×原料多酚含量)]×100%

1.2.4 SDS-PAGE分析

凝膠電泳采用Laemmli[15]系統(tǒng)，在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)上進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。取適量樣品，添加電泳緩沖液配制成4 mg/mL溶液，沸水煮3 min，上樣量為2.5 μL；凝膠電泳在恒流下進(jìn)行，樣品在濃縮膠中時(shí)電流為15 mA，進(jìn)入分離膠后電流調(diào)整為25 mA；凝膠用0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250染色1 h，脫色采用甲醇乙酸脫色液(甲醇∶乙酸∶水=1∶1∶8)進(jìn)行12 h脫色。

1.2.5 蛋白溶解性的測(cè)定

將蛋白樣品配制成為1%(m/V)溶液，磁力攪拌30 min后用0.5 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至2.0～9.0，離心(10 000 r/min，20 min)，上清液稀釋50倍后Lowry法測(cè)定蛋白含量，以BSA為標(biāo)樣。

1.2.6 體外消化

參考White等[16]和Wu等[17]的方法進(jìn)行體外模擬消化試驗(yàn)，略作改動(dòng)。堿溶酸沉法蛋白、鹽提法蛋白和雙酶法蛋白分散液各1份，用6 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，于37 ℃條件下保溫10 min，加入100mg/mL胃蛋白酶0.2 mL并于37 ℃恒溫?fù)u床酶解1 h。分別在不同消化時(shí)間(0、30、60 min)取樣待測(cè)，并調(diào)節(jié)pH至7.0終止反應(yīng)。胃蛋白酶消化結(jié)束后，用 2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值為7.0，加入100 mg/mL胰蛋白酶0.12 mL和脫氧膽酸鈉(體系最終濃度為8.6 mmol/L)，于37 ℃條件下恒溫?fù)u床酶解2 h。期間在不同消化時(shí)間(30、60、120 min)取樣待測(cè)。消化后的樣品經(jīng)165 000 g離心95 min制備膠束，測(cè)定總酚含量。同時(shí)對(duì)體外消化過(guò)程中的亞基降解情況進(jìn)行SDS-PAGE的分析以及蛋白可溶性氮釋放量測(cè)定，并計(jì)算生物可接受率：生物可接受率=(膠束中總酚質(zhì)量/蛋白總酚質(zhì)量)×100%。

蛋白消化過(guò)程中釋放的可溶性氮釋放量的測(cè)定采用TCA-NSI法。取3 mL不同消化時(shí)間的樣品溶液加入3 mL 10%TCA，靜置30 min后離心(5 000 g，20 min)，棄去上清液，沉淀部分再次用10%TCA洗滌、離心，棄去上清液即得TCA不溶組分，然后測(cè)定其中的氮含量。樣品蛋白質(zhì)總氮和TCA不溶性氮含量均采用杜馬斯定氮儀進(jìn)行測(cè)定。消化過(guò)程中氮釋放量(%)按下式計(jì)算：氮釋放量=[(N0-Nt)/Ntot]×100%，式中：Nt為消化tmin時(shí)的TCA不溶性氮/mg，N0為消化0 min蛋白樣品中的TCA不溶性氮/mg，Ntot為蛋白樣品中的總氮量/mg。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件中的One-Way ANOVA對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用Duncan′s多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Means±SD)表示，P<0.05表示顯著。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 苦蕎麥基本成分分析

蕎麥中的蛋白和多酚含量因品種的差異有很大不同，而其中多酚在苦蕎籽中的含量較為豐富[1,8]。所選苦蕎籽不僅含有優(yōu)良豐富的全價(jià)蛋白質(zhì)[(12.28±0.24)%，濕基]，而且還含有豐富的多酚(2.41±0.03)%，遠(yuǎn)高于其他谷物，如小麥、大米、高粱等[7,18]。蕎麥不同部位的蛋白、多酚含量相差較大(表1)。大量的蛋白和多酚富集在苦蕎的皮層部位，蛋白質(zhì)和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(15.66±1.03)%和(2.96±0.05)%，而在芯層中的含量顯著(P<0.05)低于皮層中，這是因?yàn)樵谛緦又械矸酆枯^高[19]。多酚與蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的相互作用(疏水相互作用和氫鍵結(jié)合)[20]，使得大部分多酚同蛋白一起存在于苦蕎皮層中，其中以結(jié)合態(tài)存在的多酚約占總酚的41.5%。綜上可得，苦蕎皮層粉為制備富含多酚蕎麥蛋白的優(yōu)選原料。

表1 苦蕎麥基本組成分析(n=3)

注：不同小寫字母表示同一列數(shù)值間有顯著性差異(P<0.05)，余同。

2.2 不同制備方法對(duì)BPC純度、得率及多酚回收率的影響

以苦蕎皮層粉為原料對(duì)比了不同制備方法對(duì)蕎麥濃縮蛋白回收率、純度以及多酚回收率的影響。由表2可知，雙酶法的蛋白回收率(57.93%)顯著(P<0.05)高于堿溶酸沉法(33.35%)與鹽提法(38.40%)，這是因?yàn)樵诘矸勖?糖化酶的雙酶解作用下使大量存在的淀粉顆粒酶解成分子量較小的寡糖及單糖并在超濾過(guò)程中脫除，而全蛋白組分被截留下來(lái)，提高回收率；堿溶酸沉法與鹽提法是通過(guò)改變蛋白分子周圍電荷，沉淀或提高蛋白分子與水分子間的相互作用而分離得到蛋白，主要獲得為水溶性清蛋白與鹽溶性球蛋白[13]，回收率相對(duì)較低，分別為(33.35±1.5)%和(38.40±4.29)%。雙酶法獲得的蛋白純度相對(duì)較低(49.07%)，這是由于淀粉酶和糖化酶僅僅除去淀粉，而保留了活性多酚、膳食纖維和維生素等。還值得一提的是，前期的試驗(yàn)僅僅使用480Lα-淀粉酶對(duì)苦蕎皮層粉進(jìn)行酶解提取蛋白，獲得的蛋白純度僅有28.91%；而添加糖化酶的雙酶法處理后，蛋白純度提高了近一倍，這是因?yàn)榈矸勖该附忾L(zhǎng)鏈淀粉、結(jié)合糖化酶酶解成寡糖，更有利于超濾膜脫除淀粉，提高了蛋白含量。此外，雙酶法顯著(P<0.05)保留了多酚成分(70.89±1.15)%，這可能是因?yàn)殡p酶法高效地保留了蛋白，而多酚多與蛋白多以結(jié)合方式存在(表1)，促進(jìn)多酚隨同蛋白一起被保留下來(lái)。而堿溶酸沉法與鹽提法則由于蛋白回收率不高，可推測(cè)在離心過(guò)程中部分多酚伴隨蛋白被除去，因而多酚回收率也相對(duì)偏低。

表2 不同方法制備的蕎麥蛋白純度、回收率及多酚回收率(n=3)

2.3 不同方法制備的BPC凝膠色譜電泳分析

蕎麥中蛋白質(zhì)的主要成分是鹽溶性球蛋白，主要由分子質(zhì)量280 ku的13S球蛋白組成，約占總蛋白的43%，由43～68、57～58、26～36 ku的亞基多肽鏈構(gòu)成，鏈與鏈之間由二硫鍵連接；8S球蛋白的亞基分子分子量約為60 ku，相對(duì)含量較低[13]；2S清蛋白主要分子帶則集中在8～16 ku的范圍內(nèi)[13]?？嗍w皮層粉和3種方法制備的蕎麥蛋白在還原狀態(tài)下的電泳圖譜，如圖1。雙酶法制備的蛋白與苦蕎皮層粉原料的分子量分布基本一致，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在36 ku以及26 ku附近，而堿溶酸沉法和鹽提法制備的蛋白缺少60 ku以上的條帶。堿溶酸沉法蛋白和鹽提法蛋白與原料間的差異可能是在離心操作過(guò)程中，分子質(zhì)量大的蛋白聚集體隨沉淀物被分離除去。說(shuō)明雙酶法制備的蛋白能有效保留原料蛋白質(zhì)的全組分。

圖1 苦蕎皮層粉及3種蕎麥濃縮蛋白的SDS-PAGE圖譜(M道電泳帶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，1～4道電泳帶分別為：苦蕎皮層粉、堿溶酸沉法蛋白、鹽提法蛋白、雙酶法蛋白)。

2.4 不同制備方法對(duì)BPC多酚存在方式的影響

植物多酚是人類膳食中的一類重要活性成分，其與蛋白質(zhì)的絡(luò)合反應(yīng)是其最重要的特性之一[20]。圖2比較了苦蕎皮層粉原料以及3種方法提取蛋白的總酚含量、共價(jià)結(jié)合酚以及以弱電作用結(jié)合的游離酚的含量[21]。堿溶酸沉法蛋白、鹽提法蛋白、雙酶法蛋白的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.65%、2.67%和11.35%，雙酶法制備的蕎麥蛋白中總酚含量是堿溶酸沉法的3.1倍，是鹽提法的4.3倍。堿溶酸沉法和鹽提法蛋白中結(jié)合酚含量顯著(P<0.05)高于游離酚，而雙酶法蛋白的多酚含量相對(duì)較高。這可能是不同處理方法對(duì)多酚-蛋白質(zhì)相互作用影響的結(jié)果[22-23]。

圖2 苦蕎麥皮層粉及不同方法制備的蕎麥濃縮蛋白的多酚存在方式

2.5 不同制備方法對(duì)BPC溶解度的影響

溶解性直接影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。3種方法制備的蕎麥蛋白的溶解度-pH曲線(圖3)顯示，在pH 2.0～9.0的環(huán)境下，蕎麥蛋白溶解性：鹽提法蛋白>堿溶酸沉法蛋白>雙酶法蛋白。蛋白質(zhì)的溶解性差異與制備方法相關(guān)，鹽提法蛋白之所以具有良好的溶解性，是由于鹽提法制備的蛋白以可溶性清蛋白和球蛋白為主(圖 1)，此外，有研究表明添加NaCl(1.0 mol/L)能明顯提高BPC的溶解性[24]；雙酶法制備的蛋白多酚含量相對(duì)高，疏水多酚與蛋白的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致其低溶解性[21]。此外，索氏提取法測(cè)得雙酶法蛋白的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)(13.30%)高于堿溶酸沉法(8.39%)和鹽提法蛋白(4.19%)，為高油脂蛋白。當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷增加并分裂蛋白聚合體而起到增溶作用，脂肪的存在會(huì)減弱蛋白聚合體的這種分裂[25]。

圖3 不同方法制備的蕎麥濃縮蛋白的溶解度-pH曲線

2.6 體外消化

研究了胃蛋白酶-胰蛋白酶體外模擬人體胃腸消化過(guò)程以考察蕎麥濃縮蛋白的體外消化性，如圖4所示。胃蛋白酶消化結(jié)束后，堿溶酸沉法和鹽提法蛋白中分子質(zhì)量大于36 ku的組分被裂解形成分子質(zhì)量較低的寡肽，而小于14.4 ku的組分仍然存在，這與Ikeda等[26]的報(bào)道相似，而D-BPC的亞基降解要更慢于前2種蛋白。胰蛋白酶消化結(jié)束后，3種蛋白中分子質(zhì)量大于14.4 ku的組分幾乎都裂解，說(shuō)明大部分小分子質(zhì)量的寡肽被繼續(xù)裂解成分子質(zhì)量更小的肽(已經(jīng)難以染色或跑出分離膠)，這與隨后的可溶性氮釋放情況是一致的。

圖4 不同方法制備的蕎麥濃縮蛋白體外消化過(guò)程的SDS-PAGE圖譜(從左到右泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白，2、3、4依次為堿溶酸沉法蛋白消化0、60、180 min，5、6、7依次為鹽提法蛋白消化0、60、180 min，8、9、10依次為雙酶法蛋白消化0、60、180 min)。

蛋白體外消化過(guò)程中的可溶性氮釋放變化可以補(bǔ)充說(shuō)明SDS-PAGE結(jié)果。如圖5a所示，在胃蛋白酶消化階段，3種蛋白質(zhì)的可溶性氮釋放量增加趨勢(shì)相似，都是在0～30 min內(nèi)急劇增加，然后增加緩慢，直到胃蛋白酶消化結(jié)束而到達(dá)最大值；在進(jìn)一步的胰蛋白酶消化階段，鹽提法與雙酶法蛋白的變化趨勢(shì)較堿溶酸沉法蛋白緩慢，消化結(jié)束時(shí)3種蛋白的可溶性氮釋放量依次是堿溶酸沉法蛋白(61.22%)>鹽提法蛋白(49.52%)>雙酶法蛋白(43.30%)。該結(jié)果說(shuō)明蕎麥蛋白是抗消化蛋白，其中富含多酚的雙酶法蛋白體現(xiàn)了良好的抗消化性，這與Tang等[8]的報(bào)道一致。這是因?yàn)樵谙^(guò)程中，多酚一方面可與消化酶結(jié)合導(dǎo)致消化率降低，另一方面，其與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物也在一定程度上阻礙了人體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收和利用[27]。

圖5 不同方法制備的蕎麥濃縮蛋白體外消化過(guò)程中氮釋放量的變化以及消化前后的總酚釋放量

生物可接受率被定義為胃腸道內(nèi)從食物基質(zhì)釋放或者萃取并可用于腸吸收的復(fù)合物。本研究模擬消化階段可釋放到膠束相并可用于通過(guò)絨毛上皮細(xì)胞吸收的多酚含量。結(jié)果表明，體外消化前堿溶酸沉法蛋白超速離心后的上清液中的總酚含量最高(圖5b)。經(jīng)過(guò)體外消化后雙酶法蛋白膠束中的總酚量大大提高(2.05%)，顯著高于堿溶酸沉法和鹽提法蛋白，通過(guò)計(jì)算，生物可接受率由0.96%增加至5.22%，生物可接受率的增加可歸因于膠束的形成使得消化過(guò)程中多酚的溶解性提高。

3 結(jié)論

以苦蕎皮層粉作為原料，雙酶法制備的蕎麥濃縮蛋白富含多酚特點(diǎn)突出，蛋白回收率57.93%，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.35%，顯著高于堿溶酸沉法(3.1倍)和鹽提法(4.3倍)。此外，該蛋白組分完整，雖然溶解性較低，但體外消化試驗(yàn)表明該蛋白的膠束總酚釋放量高達(dá)2.05%，顯著(P<0.05)高于堿溶酸沉法和鹽提法得到的蛋白，而氮釋放量較低43.30%，是良好的抗消化蛋白。雙酶法能高效、環(huán)保地提高蕎麥蛋白的回收率、較大程度地保留活性多酚，是未來(lái)制備高活性成分蛋白產(chǎn)品的一種趨勢(shì)。

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Evaluation of Double-Enzyme Extraction andinvitroDigestion of Buckwheat Protein Concentrate Rich in Polyphenols

Chen Yajun Chen Xiaowei Yang Xiaoquan Guo Jian Wang Jinmei

(School of Food Science and Engineering; Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, South China University of Technology, Guangzhou 510640)

The aim of this work was to develop a new method, double-enzyme extraction in combination with membrane separation, to prepare buckwheat protein concentrate (BPC) rich in polyphenols. Double-enzyme extraction method and traditional protein preparation method, the alkaline extraction-acid precipitation method and the salt extraction method, were compared in regard to the protein content and recovery, polyphenols contents and recovery and the solubility of BPC. In addition, the in vitro digestion of protein was also evaluated combined with SDS-PAGE, nitrogen release and polyphenols micelle release analysis. Compared to alkaline extraction-acid precipitation and salt extraction, double-enzyme extraction showed the highest protein recovery (57.93%), with a protein content of 49.07%. Furthermore, double-enzyme extraction method displayed the highest polyphenols contents(11.35%) and recovery (70.89%), compared to those of the alkaline extraction-acid precipitation method(3.65% and 8.58%, respectively) and the salt extraction method (2.67% and 7.99%, respectively). Similar results from the SDS-PAGE analysis of BPC prepared by these three methods were observed after theinvitrodigestion. Additionally, the nitrogen release of BPC from double-enzyme extraction method was only 43.30%, whereas the micellar polyphenol released was up to 2.05%, suggesting that the buckwheat protein concentrate prepared from double-enzyme extraction possessed a high resistibility to digestion.

buckwheat protein concentrate, polyphenols, double-enzyme extraction, alkaline extraction-acid precipitation, salt extraction method,invitrodigestion

國(guó)家自然科學(xué)基金(31130042、31371744)

2015-10-03

陳雅君，女，1991年出生，碩士，植物蛋白加工與利用

楊曉泉，男，1965年出生，教授，博士生導(dǎo)師，植物蛋白加工與利用

TS201.1

A

1003-0174(2017)02-0067-07