高粱不同溶劑提取物的抗氧化活性及抗細胞氧化應激作用

申迎賓 張 暉 程李琳 齊雅靜 王 立 錢海峰 齊希光

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室；江南大學食品學院，無錫 214122)

高粱不同溶劑提取物的抗氧化活性及抗細胞氧化應激作用

申迎賓 張 暉 程李琳 齊雅靜 王 立 錢海峰 齊希光

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室；江南大學食品學院，無錫 214122)

以紅高粱為原料，采用測定清除DPPH·和ABTS+·能力、總抗氧化能力3種方法比較了不同提取溶劑提取物的抗氧化活性，測定了總酚含量，并分析了總酚含量與抗氧化方法的相關性。并研究了高粱多酚對細胞氧化應激的影響。結果表明，60%乙醇提取物中總酚含量最高，達到315.45 mg GAE/100 g DW。DPPH·清除能力達到89.88%，ABTS+·清除能力達到89.9%，總抗氧化能力為15.93 mmol TEAC/100 g DW，其中ABTS+·與總酚的相關系數(shù)最高，為0.80 (P=0.193>0.05)，但是不顯著。高粱多酚質量濃度為2 mg/mL時，對H2O2誘導小鼠肝細胞產生MDA抑制率最高，為72.96%。在質量濃度為300 μg/mL時，使得PC12細胞的存活率達到94.11%。由此可見，紅高粱具有很強的體外抗氧化能力，并對細胞的氧化應激具有保護作用。

抗氧化活性 紅高粱 DPPH· ABTS+· PC12 MTT

大量的流行病學研究表明，長期食用全谷物食品可以降低患心血管疾病[1]、2型糖尿病[2-3]、某些癌癥[4](結腸癌)等慢性疾病[5]的風險。這可能是因為谷物多酚通過抗氧化活性改善機體的氧化還原平衡狀態(tài)[6]，并進一步影響慢性病的進程。但是，隨著人們生活水平的提高，所食米面越來越精，越來越講究口感，這導致谷物加工時大部分的多酚組分被去除，影響了人們的健康。多酚是谷物中十分重要的一類倍受關注的抗氧化活性成分，多存在于谷物的麩皮中，近年的全谷物概念提出并受到重視后，人們開始關注整粒谷物的營養(yǎng)和功能，多酚是其發(fā)揮抗氧化功能的主要物質基礎。

高粱是世界第五大糧食作物[7]，在我國東北、華北地區(qū)分布廣泛，栽培面積和產量均居世界前列，高粱的外種皮中含有大量的多酚類化合物[8]，包括酚酸、黃酮類化合物和原花青素等，這些多酚化合物具有很強的抗氧化活性。國外已經有研究對高粱中的多酚成分及其抗氧化活性進行報道[9-11]，但是主要集中在不同高粱品種間的比較，而不同溶劑對高粱多酚及其抗氧化活性的影響研究較少，張海暉等[12]雖然研究了70%乙醇、70%甲醇和70%的丙酮對高粱、甜高粱的多酚含量及抗氧化活性影響，認為70%乙醇更有利于多酚化合物的提取，但是沒有比較其他溶劑(純水和含中濃度水平的有機溶劑)對高粱多酚及抗氧化活性的影響，也沒有從細胞水平上分析高粱多酚的抗氧化應激作用。從細胞水平上來評價抗氧化活性是目前較為前沿的抗氧化活性評價方法，它可以反映抗氧化劑的吸收、代謝、分布的變化情況。與化學模型的分析法相比，更能準確反映生理特性；與動物實驗法相比，周期更短、測定程序更簡單。所以采用細胞水平上評價抗氧化活性的方法既可以反映抗氧化劑的生物活性，又可以節(jié)約成本，也減少了對動物的傷害。因此本試驗以高粱整籽粒為研究對象，采用測定清除DPPH·和ABTS+·、總抗氧化能力3種體外化學抗氧化體系，考察不同的提取溶劑提取物(水、60%乙醇、60%甲醇、60%丙酮)的抗氧化活性。同時研究60%乙醇提取物對H2O2誘導小鼠肝細胞產生MDA抑制作用，分析60%乙醇提取物對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激的保護作用。從體外化學模型和細胞的角度分析了高粱的抗氧化活性，為開發(fā)高粱中的多酚成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅高粱：市售，產地：東北，粉碎過60目篩備用。

福林試劑：上海荔達生物科技有限公司； DPPH、ABTS、Trolox：Sigma 公司； DEME培養(yǎng)基：美國Gibco公司；MDA檢測試劑盒、蛋白質測定試劑盒：南京建成生物技術研究所；MTT檢測試劑盒：碧云天生物技術有限公司。PC12細胞：江南大學細胞實驗室；FRAP試劑: 0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 3.6):10 mmol/L TPTZ (溶于40 mmol/L鹽酸): 20 mmol/L三氯化鐵=10∶1∶1。

搖擺式DFY-500高速中藥粉碎機：浙江溫嶺市林大機械有限公司；酶標儀SH-1000Lab：江南大學國家食品企業(yè)質量安全檢測技術示范中心；722N型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；L550離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

樣品處理：準確稱量1 g紅高粱粉末，10 mL相應各提取溶劑(水、60%乙醇、60%甲醇、60%丙酮)，超聲波輔助提取30 min，60 ℃下提取3 h，連續(xù)2次，定容25 mL容量瓶，質量濃度為40 mg全谷物/mL，4 ℃保存，待測。

樣品制備：取10 g紅高粱粉末，100 mL 60%乙醇溶液，超聲波輔助提取30 min，60 ℃下提取3 h，連續(xù)2次，合并提取液，旋蒸至無醇味，冷凍干燥，-20 ℃保存，待測。

1.2.1 總酚的測定

總酚含量的測定采用福林酚法[13]，檢測波長為765 nm，取0.5 mL不同溶劑的高粱提取物，加入0.5 mL福林酚試劑和2 mL 15%的碳酸鈉溶液，充分混合，定容10 mL搖勻，室溫下反應 60 min，以不加碳酸鈉溶液的反應液為空白，在特征吸收波長處, 測吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)沒食子酸標準曲線，計算樣品總酚的相對含量。以mg GAE/100 g DW計算。

1.2.2 DPPH自由基的測定

[14-15]并做一定修改，準確稱取7.88 mg DPPH·，用無水乙醇溶解，定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，配制濃度為2 ×10-4mol/L 的溶液，保存于冰箱中，備用。向4 mL 2×10-4mol/L DPPH自由基溶液中加入0.5 mL高粱多酚提取液樣品，搖勻于室溫下放置30 min，于517 nm下測定其吸光值AS；同時測定4 mL 2×10-4mo1/L DPPH自由基溶于0.5 mL 60%乙醇混合液的吸光值AC，根據(jù)以下公式計算樣品對DPPH自由基的抑制率。

式中：AS為加樣品液時DPPH自由基溶液的吸光值；AC為未加品液時DPPH自由基溶液的吸光值。

1.2.3 ABTS陽離子自由基的測定

根據(jù)參考文獻[16]并做相應修改，取4.9 mL ABTS陽離子自由基溶液與0.1 mL樣品混合，反應10 min，測定吸光度,空白為0.1 mL甲醇。按照下列公司計算。

式中：A0為未加樣品的ABTS陽離子自由基溶液的吸光值；A為樣品與ABTS陽離子自由基溶液反應后的吸光值。

1.2.4 總抗氧化能力測定

取4 mL FRAP試劑與0.1 mL樣品，反應10 min在593 nm下測吸光值。以不同濃度梯度的Trolox溶液為標樣作標準曲線，抗氧化能力用TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity)表示，空白為0.1 mL 60%乙醇，得到吸光值(Y)與Trolox 含量(x)之間的回歸方程。

1.2.5 抑制雙氧水誘導小鼠肝細胞產生MDA試驗

參照參考文獻[17]，略做調整。選取體重18～25 g的雄性昆明種小鼠1只，迅速分離肝組織，用冷生理鹽水洗凈后稱重，冰浴下勻漿，制成體積分數(shù)0.5%的懸浮液。取部分肝懸液用考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白質含量。試驗分組為空白對照(不加H2O2)，模型組(加H2O2)和高粱多酚樣品干涉組(加樣品+加H2O2)。各試驗組分別取700 μL的肝勻漿，在樣品干涉組分別加入不同濃度的高粱多酚樣品350 μL。在空白對照和模型組，加入700 μL的肝勻漿，混勻，37 ℃水浴15 min后，在空白對照組中加入700 μL生理鹽水，而在模型組中加入350 μL生理鹽水，然后除空白組，其余組加入350 μL 400 mmol/L的H2O2啟動反應，混勻，繼續(xù)水浴45 min后，在冰浴條件下，終止反應10 min，然后4 ℃下3 500 r/min離心10 min，取上清液500 μL分裝，用于測定各組MDA含量。

MDA含量(nmol/mg)=

1.2.6 MTT法測定PC12細胞的活力

PC12細胞[18]接種于DEME培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取出，離心(1 000 r/min, 3 min),去除上清，細胞培養(yǎng)液稀釋為3.6×104個/mL, 96孔培養(yǎng)板每孔加100 μL，分組為：正常細胞組、模型細胞組(200 μmol/L H2O2)、阿魏酸細胞組(200 μmol/L H2O2+0.1 mmol/L)、低濃度干涉組(200 μmol/L H2O2+75 μg/mL)、中濃度干涉組(200 μmol/L H2O2+150 μg/mL)、高濃度干涉組(200 μmol/L H2O2+100 μg/mL)。

接種細化孵育24 h后，除正常對照組外，其余各組吸棄原培養(yǎng)液，加入含有相應濃度樣品濃度培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入100 μL 含200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)2 h，除去培養(yǎng)基，加入MTT，4 h后，除去MTT，加入150 μL的DMSO，振蕩混勻15 min，上酶標儀檢測細胞活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用微軟辦公軟件Office 2003、SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，所有試驗均做3個重復。

2 結果與討論

2.1 總酚含量

不同提取溶劑對紅高粱總酚的影響如圖1所示，其中60%乙醇提取物中總酚含量最高，達到315.45mg/100 g DW, 高粱的水提取物中總酚含量較低。同時，水、60%甲醇和60%丙酮的提取效果沒有顯著差異，可見不同的提取溶劑對高粱中總酚含量有一定的影響，60%乙醇較其他溶劑效果好。又由于乙醇價格低廉，毒副作用小，所以在提取高粱多酚時選擇乙醇作為提取溶劑更為合適。

圖1 不同提取溶劑對紅高粱總酚的影響

2.2 DPPH自由基清除率

紅高粱不同溶劑提取物的DPPH·的清除能力見圖2。結果表明：60%的乙醇、60%的甲醇、60%的丙酮均較水提取物清除能DPPH·的能力強，且均比1 mmol/L Trolox的陽性對照清除DPPH·的能力強。60%乙醇提取物清除自由基的能力是最強的，達到了89.88%。同時，60%甲醇和60%丙酮較水提取物的DPPH·清除能力強。由此可見溶劑對DPPH·的清除能力影響較大，選擇合適的提取溶劑很重要，60%的乙醇是理想的提取溶劑。與以往研究類似，都表明高粱具有很強的清除自由基的能力[19]。

圖2 不同提取溶劑對DPPH·清除率的影響

2.3 ABTS自由基清除率

高粱不同提取溶劑提取物的ABTS+·清除能力見圖3，可知，水提取物、60%的乙醇、60%的甲醇、60%的丙酮提取物均較1 mmol/L的Trolox陽性對照強。同時，60%的乙醇提取物的ABTS+·清除能力最強達到了89.9%，同時，水、60%甲醇、60%丙酮提取物的ABTS+·清除能力差異不顯著。由此可見，溶劑對ABTS+·的清除能力影響不大，而60%乙醇提取物具有最強的ABTS+·清除能力。

圖3 不同提取溶劑對ABTS+·清除率的影響

2.4 FRAP測定總抗氧化能力

高粱不同溶劑提取物總抗氧化能力如圖4所示，可見，60%的乙醇、60%的甲醇、60%的丙酮提取物均比水提取物的總抗氧化能力強，且三者相比無顯著差異，但均比水提取的總抗氧化能力強。60%乙醇提取物的總抗氧化能力達到15.93 mmol TEAC/100 g DW。因此，結合上述選擇溶劑的情況，選擇60%乙醇作為提取溶劑較合適。

圖4 不同提取溶劑對總抗氧化能力的影響

2.5 相關性分析

總多酚與DPPH·清除能力的相關系數(shù)為0.62，為正相關，但是未到達顯著水平(P=0.38>0.05)，與總抗氧化能力的相關性為0.632(P=0.368>0.05)，這說明還有其他種類的抗氧化成分存在?？偠喾优cABTS陽離清除能力的相關系數(shù)最高，為0.80(P=0.193>0.05)，ABTS陽離子自由基清除能力與總酚含量密切相關, 但是沒有達到顯著水平，不具有統(tǒng)計學意義。這與以往研究谷物多酚與抗氧化方法間的相關性具有一致性[20-21], 結果表明，雖然高粱中富含多酚成分，但是提取物中總酚含量與抗氧化活性均未達到顯著水平，一方面，可能是試驗誤差造成的，另一方面，也間接表明可能存在其他抗氧化成分影響高粱提取物的抗氧化活性。

2.6 抑制H2O2誘導小鼠肝細胞產生MDA試驗

機體的體內的酶系統(tǒng)會產生氧自由基[22]，這些自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質過氧化作用，并伴有脂質過氧化物如MDA生成，進而引起細胞代謝及功能障礙甚至死亡[23]。因此常以MDA的含量來反應脂質過氧化的程度。

如表1所示，模型組的MDA含量比正常組顯著增加，若加入紅高粱提取物MDA的生成量明顯減少，且成一定的劑量關系，說明紅高粱提取物有抑制H2O2誘導的脂質氧化作用。高濃度的紅高粱提取物的抑制率最高為72.96%。這也表明高粱多酚具有抗細胞氧化應激的作用。

表1 紅高粱對H2O2誘導的肝細胞產生MDA生成的影響

注：數(shù)字旁字母不同，代表組間有顯著差異(P<0.05)。

2.7 紅高粱對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激的保護作用

隨著人們生活質量的改善，飲食引起的氧化應激損傷和抗氧化保護作用的理論受到普遍重視，長期膳食高脂肪、高能量的食品容易造成體內的氧化應激，引起多種慢性病如高血壓、動脈硬化、糖尿病等。攝入一定的抗氧化劑有助于緩解這一狀況。目前研究氧化應激的模型較多，其中PC12細胞是研究藥物對細胞氧化應激的常用細胞，多個文獻都有報道[24-25]。由表2知，PC12細胞經過H2O2處理后，模型組細胞存活率下降至(59.18±1.21)%，0.1 mmol/L的阿魏酸和低中高濃度的高粱總提取物能夠提高H2O2誘導的PC12細胞存活率，而高濃度的紅高粱總提取物(300 μg/mL)能夠大大提高細胞的存活率(94.11%)，較阿魏酸陽性組效果明顯(81.81%)。這表明高粱多酚對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激具有保護作用。

表2 紅高粱對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激的保護作用

3 結論

60%乙醇提取物中總酚含量最高，達到315.45 mg/100 g DW，DPPH·清除能力達到89.88%，ABTS+·清除能力達到89.9%，總抗氧化能力為15.93 mmol TEAC/100 g DW，均較其他溶劑提取的效果好。

清除ABTS+·能力與總酚的相關系數(shù)最高，為0.80 (P=0.193>0.05)，但是沒有達到顯著水平，不具有統(tǒng)計學意義。

高質量濃度(2 mg/mL)的紅高粱提取物對H2O2誘導小鼠肝細胞產生MDA抑制率最高，為72.96%。

紅高粱總提取物為300 μg/mL時，能夠大大提高細胞的存活率，達到94.11%。

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Antioxidant Activity and Anti-Oxidative Stress of Different Solvent Extracts from Sorghum

Shen Yingbin Zhang Hui Cheng Lilin Qi Yajing Wang Li Qian Haifeng Qi Xiguang

(State Key Laboratory of Food Science and Technology; School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)

In this paper, antioxidant activity of different extraction solvent extract was measured by DPPH· scavenging , ABTS+· scavenging and total antioxidant activity using red sorghums as raw materials, and total phenolic content was measured, and the correlation was analyzed between the total phenolic content and antioxidant methods. The effects of sorghum polyphenol on oxidative stress in cells were also measured. The results showed that 60% ethanol extract had the highest total phenolic content, reaching 315.45 mg GAE/100 g DW. DPPH· scavenging capacity reached 89.88%. ABTS+· scavenging capacity reached 89.9%. Total antioxidant capacity was 15.93 mmol TEAC/100 g DW. There was the highest correlation coefficient between the scavenging ABTS+· ability and total phenolic content (R=0.80,P=0.193>0.05), but it was not significant. The rate of H2O2-induced inhibition of mouse liver cells to produce MDA reached 72.96% with high concentrations of sorghum polyphenol (2 mg/mL). Meanwhile, the survival rate of PC12 cells was 94.11% with the concentration of 300 μg/mL. Therefore, red sorghum had a strong antioxidant capacity in vitro, and had protective effects against oxidative stress in cell.

antioxidant activity, red sorghum, DPPH·, ABTS+·, PC12, MTT

863計劃(2013AA102203-7)，國家自然科學基金(31471617)，“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD 37B08-3)

2015-07-21

申迎賓，男，1981年出生，博士，糧食深加工及資源利用

張暉，女，1967年出生，教授，谷物功能成分

TS21

A

1003-0174(2017)02-0019-06