琥珀酰化改性花生蛋白研究

蘆 鑫，王克琴，張麗霞，宋國輝，孫 強，黃紀念

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術研究中心，鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，鄭州 450002)

油料蛋白

琥珀酰化改性花生蛋白研究

蘆 鑫1,2，王克琴3，張麗霞1,2，宋國輝1,2，孫 強1,2，黃紀念1,2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術研究中心，鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，鄭州 450002)

為考察琥珀酰化改性因素對花生蛋白改性效果及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，采用單因素試驗、響應面試驗分析花生蛋白質(zhì)量濃度、琥珀酸酐添加量、反應溫度對改性花生蛋白?；扰c產(chǎn)率的影響，確定最優(yōu)琥珀?；男詶l件。通過紅外光譜、電子顯微鏡、氮溶解指數(shù)評價琥珀?；男曰ㄉ鞍椎慕Y(jié)構(gòu)性質(zhì)。結(jié)果表明：花生蛋白質(zhì)量濃度、琥珀酸酐添加量是顯著影響因素；最佳改性條件為花生蛋白質(zhì)量濃度58.5 g/L、琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的19.55%、反應溫度49℃，在最佳條件下改性花生蛋白酰化度與產(chǎn)率分別為(82.82±0.59)%和(76.89±0.74)%；引入琥珀酰基改變了花生蛋白的分子結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子由折疊趨向伸展，蛋白質(zhì)聚集體尺寸減小；改性花生蛋白的溶解性得到明顯改善。

花生蛋白；酰化度；二級結(jié)構(gòu)；氮溶解指數(shù)

花生是世界重要的油料作物之一，年產(chǎn)量4 600萬t左右。我國是花生的生產(chǎn)大國，產(chǎn)量居世界第一，2015年花生產(chǎn)量為1 700萬t。花生蛋白是花生的主要組分，約占20%，由于花生蛋白的氨基酸組成均衡合理，營養(yǎng)價值高，適合人們消費，已經(jīng)成為世界第三大食用植物蛋白資源[1-2]。

雖然花生蛋白已經(jīng)被廣泛應用于食品領域，但同其他植物蛋白類似，花生蛋白在酸性、中性條件下溶解性差，易產(chǎn)生沉淀，影響產(chǎn)品品質(zhì)，限制其使用范圍[3-5]。研究表明：?；男钥梢杂行岣叩鞍踪|(zhì)分散性與溶解性[6-7]。Beuchat[8]通過琥珀?；男曰ㄉ鞍追?，提高其在pH 6～7的溶解性、持水力、乳化性；Monteiro等[9]發(fā)現(xiàn)花生蛋白的主要成分花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ都可以采用琥珀?；男裕瑢⑵涞入婞c降低到4以下，改善其溶解性和分散性。

目前國外開展了琥珀?；男曰ㄉ鞍椎难芯抗ぷ鳎珖鴥?nèi)該領域研究仍處于起步階段。本文以改性花生蛋白?；群彤a(chǎn)率為評價指標，考察花生蛋白質(zhì)量濃度、琥珀酸酐添加量、反應溫度對花生蛋白琥珀酰化改性的影響，建立最佳的琥珀?；男怨に?，并對比改性前后蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的差異，為琥珀?；男曰ㄉ鞍椎暮罄m(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生蛋白粉: 實驗室自制，具體條件見文獻[10]。丁二酸酐(琥珀酸酐)，上海阿拉丁試劑有限公司；茚三酮，瑞金特化學有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

K-05全自動凱氏定氮儀，UV-6300型分光光度計，IS5型傅里葉紅外分析儀，LyovacGT1冷凍干燥機，DL-5-B 離心機，XS205電子天平，DF-101S集熱式磁力攪拌器。

1.2 試驗方法

1.2.1 琥珀酰化改性花生蛋白

配制一定質(zhì)量濃度的花生蛋白溶液，在一定溫度下，逐步加入琥珀酸酐，攪拌反應1 h，整個過程中使用3 mol/L NaOH溶液維持反應體系pH在8.0～8.5之間。反應結(jié)束后，用3 mol/L鹽酸中和，以5 000 r/min 離心15 min，收集上清液，采用截留相對分子質(zhì)量為3 500 Da透析袋透析12 h，冷凍干燥獲得改性花生蛋白。

1.2.2 改性花生蛋白?；鹊臏y定

參考劉金陽等[11]的方法。取0.4 mL 1.2.1中離心上清液，加入0.4 mL蒸餾水，隨后加入0.1 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液及茚三酮溶液各0.2 mL，混合均勻后100℃水浴加熱15 min，反應結(jié)束后，迅速冷卻至室溫并加蒸餾水定容至5 mL，靜置15 min 后，以蒸餾水作為空白，測定在570 nm 處的吸光度Am。取相同質(zhì)量濃度的花生蛋白溶液0.4 mL，按照上述步驟處理，測定吸光度A0。按照下式計算酰化度：

1.2.3 改性花生蛋白產(chǎn)率的計算

分別采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010，系數(shù)為5.46)測定花生蛋白與改性花生蛋白的蛋白質(zhì)含量C0和Cm，采用下式計算改性花生蛋白產(chǎn)率：

式中：M0和Mm分別為改性前后花生蛋白的質(zhì)量。

1.2.4 花生蛋白的紅外光譜分析

將干燥的花生蛋白與琥珀?；男曰ㄉ鞍追謩e與溴化鉀按1∶100的比例充分研磨，用粉末壓片機以15 MPa壓制30 s，將壓片轉(zhuǎn)移到紅外分析儀中掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，采樣64次，以空氣為背景，樣品掃描前扣除背景。采用Origin 8.5計算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中ɑ-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲所占的比例[12]。

1.2.5 花生蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析

花生蛋白與琥珀?；男曰ㄉ鞍赘稍锖螅秒x子噴濺儀進行真空噴金，隨后在15 kV的加速電壓下，電子顯微鏡拍攝，照片分辨率600 DPI[13]。

1.2.6 花生蛋白氮溶解指數(shù)的測定

分別稱取1 g樣品，溶于50 mL純水中，調(diào)節(jié)pH 4、6、8緩慢攪拌30 min后，在4 000 r/min離心30 min，取上清液5 mL。凱氏定氮法測定上清液中可溶性氮質(zhì)量Ms與樣品總氮質(zhì)量Mt，然后按下式計算氮溶解指數(shù)(NSI)[14]:

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SAS 9.2進行Box-Behnken設計的響應面分析，以Duncan算法進行單因素方差分析。圖中同一曲線上帶有相同小寫字母的樣品間在0.05水平上無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生蛋白琥珀?；男詥我蛩卦囼?/p>

2.1.1 花生蛋白質(zhì)量濃度對花生蛋白琥珀?；男缘挠绊?/p>

分別配制質(zhì)量濃度為30、60、90、120、150、180 g/L的花生蛋白溶液，琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的10%，在溫度30℃、pH 8.0～8.5下反應1 h后，離心，取上清液測定酰化度與產(chǎn)率，結(jié)果見圖1。

圖1 花生蛋白質(zhì)量濃度對花生蛋白琥珀酰化

由圖1可知，隨著花生蛋白質(zhì)量濃度的增加，?；瘸尸F(xiàn)先小幅上升后顯著下降的趨勢，這是由于當花生蛋白質(zhì)量濃度增加時，單位體積溶液中可參與反應的蛋白質(zhì)分子數(shù)目增加，與琥珀酸酐碰撞概率增加，加快了反應速度。當花生蛋白分子持續(xù)增加時，由于琥珀酸酐的濃度一定，使得兩種分子碰撞概率減少，蛋白質(zhì)之間相互碰撞概率提高，導致?；冉档汀Ｒ陨辖Y(jié)果與李磊等[15]對琥珀?；男源蠖沟鞍椎慕Y(jié)果一致。

由圖1可知，改性花生蛋白產(chǎn)率隨著花生蛋白質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先小幅上升后顯著下降降趨勢，這是因為隨著酰化度降低，琥珀?；男孕Ч档?，對其溶解性的改善作用減弱，導致中性條件下，溶解在上清液中的蛋白質(zhì)減少，導致產(chǎn)率降低。綜合?；扰c產(chǎn)率，花生蛋白質(zhì)量濃度以60 g/L為宜。

2.1.2 琥珀酸酐添加量對花生蛋白琥珀?；男缘挠绊?/p>

配制質(zhì)量濃度為60 g/L花生蛋白溶液，分別添加花生蛋白質(zhì)量的5%、10%、15%、20%、25%、30%的琥珀酸酐，在溫度30℃、pH 8.0～8.5下反應1 h后，離心，取上清液測定?；扰c產(chǎn)率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著琥珀酸酐添加量從5%增加到10%，改性花生蛋白酰化度顯著增加，琥珀酸酐添加量繼續(xù)增加到25%的過程中，改性花生蛋白?；入m然持續(xù)增加，但增加幅度減弱，當琥珀酸酐添加量增加到30%，?；确炊陆?。產(chǎn)生以上變化的原因是：琥珀酸酐添加量增加提高了與蛋白質(zhì)分子的碰撞概率，從而提高酰化度；當琥珀酸酐添加量過高時，部分琥珀酸酐與水反應，導致未能有效提高酰化度[7]。

由圖2可知，改性花生蛋白產(chǎn)率隨著琥珀酸酐添加量的增加而增加，但是當琥珀酸酐添加量從25%增加到30%時，改性花生蛋白產(chǎn)率下降，這是受酰化度下降，蛋白質(zhì)溶解性削弱，降低改性花生蛋白產(chǎn)率。考慮生產(chǎn)成本與污水處理，琥珀酸酐添加量以15%為宜。此時，改性花生蛋白?；扰c產(chǎn)率分別為 (76.24±0.64)%和(69.22±0.60)%。

圖2 琥珀酸酐添加量對花生蛋白琥珀?；?/p>

2.1.3 反應溫度對花生蛋白琥珀?；男缘挠绊?/p>

配制質(zhì)量濃度為60 g/L的花生蛋白溶液，琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的15%，分別在25、30、35、40、45、50、55、60℃下，pH 8.0～8.5反應1 h后，離心，取上清液測定?；扰c產(chǎn)率，結(jié)果見圖3。

圖3 反應溫度對花生蛋白琥珀?；男孕Ч挠绊?/p>

反應溫度是影響琥珀?；男缘闹匾蛩兀头磻獪囟葧е路肿舆\動速度減慢，從而降低蛋白質(zhì)分子與琥珀酸酐的碰撞概率，降低反應速度，并且蛋白質(zhì)分子在較低溫度下，分子結(jié)構(gòu)未充分伸展，不利于活性中心暴露，也會降低花生蛋白改性效率；高反應溫度雖然可以加速分子運動速度，提高蛋白質(zhì)分子與琥珀酸酐碰撞概率，加速改性反應，但高反應溫度也會加快琥珀酸酐與水產(chǎn)生羧酸的副反應速度，同時蛋白質(zhì)在高溫時會發(fā)生聚集、變性，這都會導致體系內(nèi)參與改性反應的底物濃度的降低，進而影響改性效果。

由圖3可知，反應溫度對花生蛋白改性的影響符合上述規(guī)律，當反應溫度從25℃升高到50℃時，?；蕊@著增加，但繼續(xù)升高反應溫度后，?；确炊陆?。與酰化度變化趨勢相似，隨著反應溫度升高，琥珀?；男曰ㄉ鞍桩a(chǎn)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是由于琥珀酰化改性花生蛋白的溶解性與?；让芮邢嚓P，高?；鹊母男曰ㄉ鞍拙哂辛己玫娜芙庑?，從而增加中性條件下上清液中蛋白質(zhì)濃度，最終提高琥珀?；男曰ㄉ鞍桩a(chǎn)率。結(jié)合?；扰c產(chǎn)率，反應溫度采用50℃為宜，在此條件下，改性花生蛋白的酰化度與產(chǎn)率分別為(82.20±0.56)%和(75.59±0.66)%。

2.2 花生蛋白琥珀?；男皂憫嬖囼?/p>

在上述單因素試驗的基礎上為了分析單因素間的交互作用，以獲得最佳的花生蛋白改性條件，采用響應面試驗優(yōu)化，具體試驗設計與結(jié)果見表1，方差分析見表2、表3。

表1 花生蛋白琥珀酰化改性的響應面試驗設計與結(jié)果

表2 琥珀?；男詶l件對酰化度影響方差分析

注：顯著水平P為0.05，用*表示；高度顯著水平P為0.01，用**表示。下同。

由表2可知，在響應面考察的因素變化范圍中，花生蛋白質(zhì)量濃度和琥珀酸酐添加量是高度顯著因素(P<0.01)，且花生蛋白質(zhì)量濃度的影響大于琥珀酸酐添加量，而反應溫度是不顯著影響因素(P>0.05)；同時，因素間的交互作用不顯著。

表3 琥珀酰化改性條件對產(chǎn)率影響方差分析

分析影響因素的顯著性發(fā)現(xiàn)，花生蛋白質(zhì)量濃度是高度顯著因素(P<0.01)，琥珀酸酐添加量是顯著因素(P<0.05)，而反應溫度是不顯著影響因素(P>0.05)，因素間的交互作用不顯著。

由SAS預測，當花生蛋白質(zhì)量濃度58.2 g/L、琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的18.04%、反應溫度49.23℃時，獲得最高?；龋?82.98±0.67)%；當花生蛋白質(zhì)量濃度58.3 g/L、琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的19.55%、反應溫度49.17℃時，獲得最高產(chǎn)率，即(76.89±1.17)%。為獲得最高的產(chǎn)率，并結(jié)合實際生產(chǎn)條件，將花生蛋白琥珀酰化改性的最佳條件調(diào)整為：花生蛋白質(zhì)量濃度58.5 g/L，琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的19.55%，反應溫度49℃。在最佳條件下改性花生蛋白酰化度與產(chǎn)率分別為(82.82±0.59)%和(76.89±0.74)%。

2.3 琥珀?；男曰ㄉ鞍椎男再|(zhì)

2.3.1 改性花生蛋白的紅外光譜

為分析琥珀酰化改性對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響，采用紅外光譜分析琥珀酰化改性花生蛋白與未改性花生蛋白的差異，結(jié)果見圖4。

圖4 花生蛋白與琥珀?；男曰ㄉ鞍椎募t外光譜圖

為分析改性對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，采用Origin 8.5中峰型擬合工具分析1 600～1 700 cm-1的透光率，計算花生蛋白二級結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果見表4。

表4 花生蛋白和琥珀?；男曰ㄉ鞍椎亩壗Y(jié)構(gòu)組成 %

由表4可知，通過琥珀?；男钥梢詼p少花生蛋白中β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，增加α-螺旋與無規(guī)則卷曲，原因可能是由于帶負電的琥珀?；〈鷰д姷匿@離子，從而使蛋白質(zhì)分子內(nèi)帶負電的羰基與帶正電的氨基間的引力變?yōu)槌饬?，導致蛋白質(zhì)分子從原有的折疊彎曲結(jié)構(gòu)變?yōu)樯煺範顟B(tài)。

2.3.2 改性花生蛋白的微觀結(jié)構(gòu)

為考察改性對花生蛋白微觀形態(tài)的影響，采用掃描電鏡觀察花生蛋白與琥珀酰化改性花生蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5。

圖5 花生蛋白(a)與琥珀?；男曰ㄉ鞍?b)電子顯微鏡圖(×5 000)

由圖5可知，花生蛋白聚集成球狀或團狀，其表面光滑；而琥珀?；男曰ㄉ鞍壮尸F(xiàn)片狀，且聚集物尺寸要小于普通花生蛋白形成的聚集物。兩種蛋白質(zhì)微觀形態(tài)的差異可能是由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引發(fā)蛋白質(zhì)微觀聚集形態(tài)產(chǎn)生差別。

2.3.3 改性花生蛋白的氮溶解指數(shù)

為評價琥珀?；男詫ㄉ鞍兹芙庑蕴岣咝Ч瑴y試不同pH條件下，花生蛋白與琥珀酰化改性花生蛋白的NSI，結(jié)果見表5。

表5 花生蛋白與琥珀酰化改性花生蛋白的氮溶解指數(shù)

由表5可知，在pH 4、6、8下，琥珀酰化改性花生蛋白的NSI明顯高于花生蛋白的，這表明琥珀?；男钥梢蕴岣呋ㄉ鞍椎娜芙庑?，以上結(jié)果與琥珀?；男蕴岣呙卓返鞍?、大豆蛋白溶解性的結(jié)果一致[17-18]。因為琥珀?；瘻p弱了由于蛋白質(zhì)分子中氨基和羰基之間的引力使蛋白質(zhì)分子集聚的程度,這有利于蛋白質(zhì)分子與水分子發(fā)生水合，促進在水中分散、溶解。蛋白質(zhì)中凈負電荷的增加推動蛋白質(zhì)等電點向低pH移動，從而改善在酸性條件下的溶解性。

3 結(jié) 論

以改性花生蛋白?；扰c產(chǎn)率為評價指標，通過單因素試驗、響應面優(yōu)化試驗考察花生蛋白質(zhì)量濃度、琥珀酸酐添加量、反應溫度對琥珀?；男曰ㄉ鞍椎挠绊懀⒔⒆罴迅男怨に嚄l件。另外，采用紅外光譜、電子顯微鏡與氮溶解指數(shù)分析改性前后花生蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異。結(jié)果表明：花生蛋白琥珀?；男缘淖罴褩l件為花生蛋白質(zhì)量濃度58.5 g/L、琥珀酸酐添加量為花生蛋白質(zhì)量的19.55%、反應溫度49℃，在最佳條件下改性花生蛋白?；扰c產(chǎn)率分別為(82.82±0.59)%和(76.89±0.74)%。通過琥珀?；男裕ㄉ鞍捉Y(jié)構(gòu)與形態(tài)發(fā)生變化，分子結(jié)構(gòu)由折疊趨向伸展，蛋白質(zhì)聚集物尺寸減小；花生蛋白的溶解性提高，尤其在酸性條件下，溶解性改善明顯。

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Modification of peanut protein by succinylation

LU Xin1,2, WANG Keqin3, ZHANG Lixia1,2, SONG Guohui1,2,SUN Qiang1,2, HUANG Jinian1,2

(1.Research Center of Agricultural and Sideline Products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002, China; 2.Henan Engineering Research Center of Bioactive Substances in Agricultural Products, Zhengzhou 450002, China; 3. College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to investigate the impacts of succinylation modification factors on modification effect and structure of peanut protein, the effects of mass concentration of peanut protein, dosage of succinic anhydride and reaction temperature on acylation degree and yield of the modified peanut protein were analyzed by single factor experiment and response surface methodology, and the optimal conditions of modification by succinylation were determined. The structural properties of modified peanut protein by succinylation were evaluated by infrared spectra, electronic microscope and nitrogen solubility index. The results showed that the mass concentration of peanut protein and dosage of succinic anhydride were significant factors. The optimal modification conditions were obtained as follows: mass concentration of peanut protein 58.5 g/L, dosage of succinic anhydride 19.55% of peanut protein mass and reaction temperature 49℃. Under these conditions, the acylation degree and yield of the modified peanut protein reached (82.82±0.59)%and (76.89±0.74)% respectively. Because of the introduction of succinyl group, the molecular structure of peanut protein changed, so that the fold state inclined to extension and the size of protein aggregate shrank. The solubility of modified peanut protein was also improved notably.

peanut protein; acylation degree; secondary structure; nitrogen solubility index

2016-09-25;

2017-01-21

河南省科技開放合作項目(152106000053)

蘆 鑫(1981)，男，助理研究員，博士，研究方向為油脂加工(E-mail)xinlu1981@foxmail.com。

黃紀念，研究員，博士(E-mail)hjinian@sina.com。

TS229；TQ936.2

A

1003-7969(2017)05-0034-06