家禽活疫苗中禽白血病病毒污染檢測方法比較

楚電峰，杜元釗，馮嫣芳，薄智勇，劉秋云，馬洪芹，劉相娥

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

家禽活疫苗中禽白血病病毒污染檢測方法比較

楚電峰，杜元釗，馮嫣芳，薄智勇，劉秋云，馬洪芹，劉相娥

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

本研究對家禽活疫苗中禽白血病病毒的不同檢測方法進(jìn)行了對比，通過直接ELISA檢測法、RT-PCR法、病毒分離法和SPF雞抗體檢測法，對不同來源的家禽活疫苗進(jìn)行了禽白血病病毒污染的檢測。通過進(jìn)一步測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，直接ELISA檢測法和RT-PCR檢測法都可出現(xiàn)“假陽性”。試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒分離法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但是操作難度大、技術(shù)要求高，而SPF雞抗體檢測法既簡單、準(zhǔn)確，又能確切反映疫苗的純凈性，利于推廣應(yīng)用。

活疫苗；禽白血病病毒；檢測方法；SPF雞抗體檢測法

禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）是禽反轉(zhuǎn)錄病毒科C型腫瘤病毒亞屬的一種單股RNA病毒。不同鳥類可感染不同的ALV。ALV根據(jù)與宿主細(xì)胞特異性相關(guān)的囊膜蛋白抗原性不同，可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和J等10個(gè)亞群。雞的ALV可分為外源性和內(nèi)源性兩大類。其中：A、B和 J亞群為雞群感染的主要外源性ALV，而J亞群的致病性和傳染性最強(qiáng)[1]；E亞群屬于內(nèi)源性ALV，為非致病性或者致病性很弱的病毒[2]。外源性ALV可以形成完整的病毒顆粒，主要通過種雞垂直傳播，不會(huì)通過宿主細(xì)胞染色體傳遞。內(nèi)源性ALV是指前病毒cDNA可整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體基因組中，可通過染色體垂直傳播的ALV。它可能只是基因組的不完全片斷，不會(huì)產(chǎn)生傳染性病毒，通常沒有致病性或致病性很弱[3-4]，但會(huì)干擾對禽白血病的鑒別診斷，尤其干擾RTPCR的檢測[5-6]。種雞群ALV凈化在現(xiàn)階段主要是凈化外源性病毒，內(nèi)源性ALV目前還無法徹底凈化。檢測雞群有無ALV感染，目前主要是指有無外源性病毒感染。目前監(jiān)測疫苗中外源性ALV感染的最常用的方法有細(xì)胞分離法[7]、SPF雞抗體檢測法[8]，RT-PCR[9-10]、ELISA法[10-11]等。本研究對比了幾種常見的檢測方法，以期為一線檢測人員提供一種能準(zhǔn)確檢測疫苗中外源ALV污染的方法，為廣大養(yǎng)殖戶選擇純凈的疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1家禽活疫苗。收集目前市場上國產(chǎn)與進(jìn)口家禽活疫苗，按家禽組織來源和尿囊液來源分組。家禽國產(chǎn)組織來源活疫苗為雞傳染性法氏囊活疫苗（B87株）、雞傳染性喉氣管炎活疫苗（K317株）；家禽國產(chǎn)尿囊液來源活疫苗為雞新城疫活疫苗（La Sota株）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）、進(jìn)口組織苗1、進(jìn)口組織苗2、進(jìn)口尿囊液苗3。以上疫苗均為1 000羽/瓶。

1.1.2主要試劑。IDEXX公司禽白血病抗原檢測試劑盒（批號AJ944），購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；Taq酶和dNTP等試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；引物和測序，由上海生工完成；DF-1細(xì)胞，購自ATCC（美國組織培養(yǎng)中心）；新城疫陽性血清、雞傳染性法氏囊陽性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2方法

1.2.1ELISA直接檢測法。將組織來源疫苗和尿囊液來源疫苗（均為1 000羽/瓶）分別加入2 mL滅菌0.01 mol/L PBS稀釋，則100 μL含有疫苗50羽份；以此為檢測樣本，采用IDEXX公司禽白血病抗原檢測試劑盒，按試劑盒說明書要求進(jìn)行ELISA檢測。

1.2.2RT-PCR檢測法

1.2.2.1樣品處理。將組織來源疫苗和尿囊液來源疫苗（均為1 000羽/瓶）分別用2 mL滅菌0.01 mol/L PBS還原。

1.2.2.2RT-PCR檢測。針對ALV不同亞群病毒共有的p27基因設(shè)計(jì)檢測引物，擴(kuò)增片段長度為348 bp。上游引物：5′-CACAAGACTGGCTGATACGGT-3′；下游引物：5′-GACGCCGTAATAGCAACCA-3′。

1.2.2.3核酸提取與凝膠電泳。按照Takara公司一步法（RT-PCR）試劑盒說明書操作要求，進(jìn)行核酸提取與基因擴(kuò)增，采用凝膠電泳鑒定。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒法

1.2.3.1疫苗處理接種。將雞傳染性法氏囊活疫苗（B87株）用不含血清的M-199培養(yǎng)基溶解，使最終為500羽份/2 mL，置2～8 ℃，10 000 g離心10 min；取上清2 mL與等量的雞傳染性法氏囊病病毒特異性血清混合，37 ℃作用60 min，接種CEF細(xì)胞；將雞新城疫活疫苗（La Sota株）用不含血清的M199培養(yǎng)基溶解，使最終為200羽份/0.8 mL，2～8 ℃，10 000 g離心10 min，取上清2.0 mL與等量的雞新城疫病毒特異性血清混勻，37 ℃作用60 min后，接種CEF細(xì)胞；將雞傳染性喉氣管炎活疫苗（K317株）和雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）用不含血清的M-199培養(yǎng)基溶解，使終濃度為500羽份/2.0 mL，置2～8 ℃，10 000 g離心10 min；不中和（因K317和H120在CEF上不產(chǎn)生細(xì)胞病變），取上清2.0 mL接種CEF細(xì)胞。

1.2.3.2細(xì)胞培養(yǎng)的傳代與處理。待細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d后，按常規(guī)方法消化、收獲細(xì)胞；將其中1/2細(xì)胞（P1），置于-70 ℃冰箱保存留作檢驗(yàn)用，其余細(xì)胞分散到2個(gè)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 d后，按同樣方法收獲細(xì)胞，置-70 ℃，留樣（P2）。按同樣方法培養(yǎng)收獲第3代（P3）。對照組細(xì)胞按相同方法培養(yǎng)。將P1、P2、P3的細(xì)胞培養(yǎng)物（包含樣品及所有對照組）反復(fù)凍融3次，置2～8 ℃，5 000 g離心3 min，取上清作為待檢樣品，利用IDEXX公司禽白血病抗原檢測試劑盒進(jìn)行p27檢測。

1.2.4SPF雞抗體檢測法

1.2.4.1樣品處理。取尿囊液類和組織類疫苗樣品，每瓶樣品加入5 mL無菌PBS溶解；同一樣品取3瓶苗混合均勻作為待檢樣品，最終濃度為20羽份/0.1 mL。對進(jìn)口組織苗1、進(jìn)口組織苗2、進(jìn)口尿囊液苗3，按照瓶簽注明羽份稀釋使其終濃度為20羽份/0.1 mL。

1.2.4.2免疫接種。接種適用本疫苗日齡的SPF雞20只/組，每只雞同時(shí)滴鼻、點(diǎn)眼各10羽份，肌肉注射100羽份，同時(shí)在另一隔離器中飼養(yǎng)同批SPF雞20只作對照。首免21 d后，再以相同劑量和方法二免，第1次免疫后42 d采血。采用商品化的IDEXX禽白血病抗體檢測試劑盒，檢測ALVAB和ALV-J特異性抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1ELISA直接檢測法

通過IDEXX禽白血病抗原檢測試劑盒，直接檢測活疫苗中是否存在禽白血病抗原（表1）。

表1 ELISA直接檢測活疫苗中禽白血病抗原S/P值

如表1所示，組織類疫苗組：雞傳染性法氏囊活疫苗B87株、雞傳染性喉氣管炎活疫苗K317株以及進(jìn)口組織苗1、2檢測結(jié)果為陽性；尿囊液類疫苗組：新城疫活疫苗La Sota株檢測為陽性，傳染性支氣管炎活疫苗H120株為陰性。有研究表明，不同檢測材料對ELISA方法檢測ALV-P27抗原的結(jié)果有較大的影響[12]。采用禽白血病ELISA抗原檢測試劑盒，直接檢測疫苗中的ALV，檢測結(jié)果可能會(huì)顯示較高的“假陽性”。實(shí)際上IDEXX公司禽白血病抗原檢測試劑盒說明書已注明，該試劑盒僅適用于蛋清、泄殖腔拭子和血清樣品中的ALV-p27的檢測，ELISA直接檢測法不適用于檢測疫苗中ALV，尤其不適用于檢測用雞胚組織生產(chǎn)的疫苗樣品。

2.2RT-PCR檢測法

尿囊液類樣品中：新城疫活疫苗La Sota株、雞傳染性支氣管炎活疫苗H120株及陰性尿囊液檢測結(jié)果為陰性（圖1）；所示組織類樣品中：雞傳染性法氏囊活疫苗B87株、進(jìn)口組織苗1和陰性組織樣品均檢測為陽性（圖2）。

將陽性樣品348 bp處條帶回收測序，在GenBank上對比，結(jié)果見表2。

如上陽性樣品均為內(nèi)源性ALV的基因序列。由此可見，RT-PCR檢測法不能準(zhǔn)確區(qū)分內(nèi)和外源性ALV，并且容易受到檢測樣品中非特異性物質(zhì)的干擾，還會(huì)因?qū)嶒?yàn)室氣溶膠污染，造成假陽性。因此，RT-PCR法不適合用于禽用活疫苗中的禽白血病的檢測，尤其不適宜于檢測組織類活疫苗，會(huì)呈現(xiàn)較高的假陽性。

圖1尿囊液類樣品PCR檢測ALV結(jié)果

圖2組織類樣品PCR檢測結(jié)果ALV檢測ALV

表2 PCR陽性樣品測序比對

2.3細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒法

利用IDEXX禽白血病毒抗原檢測試劑盒，分別檢測不同活疫苗樣品經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)3個(gè)代次分離的禽白血病抗原（表3）。

表3 ELISA直接檢測活疫苗中禽白血病抗原S/P值

通過表3檢測結(jié)果可知，不同疫苗樣品組中均未檢測到ALV。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是通過連續(xù)3代的細(xì)胞培養(yǎng)，能較準(zhǔn)確檢測出疫苗中是否污染了ALV。缺點(diǎn)是檢測周期較長，檢測單位需要具有-70 ℃超低溫冰箱，而且能開展細(xì)胞檢測工作；需具有中和效價(jià)較高的單特異性陽性血清，用于中和疫苗毒株，以免疫苗株在CEF上感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變，不利于ALV的培養(yǎng)。

2.4SPF雞抗體檢測法

通過IDEXX公司禽白血病抗體檢測試劑盒，檢測不同疫苗樣品免疫的20只SPF雞血清抗體，結(jié)果見表4、表5。由表4可知，所有疫苗免疫組及對照組AB亞群抗體檢測全部為陰性。由表5可知，所有疫苗免疫組及對照組J亞群抗體檢測全部為陰性。

3 討論

3.1ELISA直接檢測法對結(jié)果影響

采用IDEXX禽白血病抗原檢測試劑盒，直接檢測家禽活疫苗中ALV，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況，尤其是組織活疫苗樣品。該檢測試劑盒采用的是雙抗夾心ELISA檢測法，而雞胚組織類疫苗含有較多的蛋白成分，同時(shí)尿囊液疫苗中含有的其它賦形劑，如脫脂奶、蔗糖、明膠、海藻糖等保護(hù)劑成分，具有一定的粘滯性，在洗板時(shí)不易沖洗干凈，這樣在加入二抗時(shí)，會(huì)使二抗粘附于孔底，接觸底物顯色；在進(jìn)行ELISA檢測時(shí)，還會(huì)造成酶標(biāo)抗體的非特異性吸附，使酶標(biāo)抗體粘附于孔底，當(dāng)接觸底物時(shí)會(huì)顯色，導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)[13]。因此，隨著抗體檢測試劑盒檢測假陽性的不斷出現(xiàn)，確保試劑盒的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性對該方法的可靠性非常重要。

表4 ELISA檢測免疫雞抗體的S/P值（ALV-AB）

表5 ELISA檢測免疫雞抗體的S/P值（J亞群）

3.2RT-PCR法對檢測結(jié)果影響

針對ALV不同亞群病毒共有的p27基因設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR法直接檢測疫苗中的ALV，結(jié)果有時(shí)會(huì)出現(xiàn)陽性率較高的現(xiàn)象。究其原因，PCR僅對病毒的一段基因進(jìn)行檢測，不能區(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV，也不能區(qū)分死毒和活毒[14]；因家禽組織的基因組中整合有ALV內(nèi)源性基因片段，而雞胚組織類疫苗是由雞胚體組織經(jīng)研磨生產(chǎn)的，組織成分比較復(fù)雜，干擾檢測結(jié)果，所以很大程度上呈現(xiàn)“假陽性”結(jié)果，不能對疫苗的純凈性作出正確判斷。只有對完整env基因進(jìn)行測序鑒定，才能進(jìn)一步確定檢測樣品是外源性ALV，還是內(nèi)源性ALV污染。

同時(shí)某些細(xì)胞基因組中帶有ALV-AB、J的gp85基因，單獨(dú)擴(kuò)增出gp85基因仍不能作為依據(jù)，同時(shí)需確保擴(kuò)增到完整Env基因及其相連的3′-末端序列，并證明其3′-末端序列中的LTR也是外源性ALV特異性的，才有較大把握作出判斷。目前，市場上的糾紛均是由于檢測gp85基因測序后發(fā)現(xiàn)是ALV-J的gp85序列造成，針對env未曾出現(xiàn)問題。但要最終定論，還要靠分離到病毒，才更為可靠[15]。

3.3病毒分離法（細(xì)胞培養(yǎng)法）對檢測結(jié)果影響

通過對樣品的連續(xù)3代細(xì)胞培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的樣品，采用IDEXX公司禽白血病抗原檢測試劑盒進(jìn)行ALV的檢測。若3代樣品均為陰性，判定該批產(chǎn)品為陰性；若3代樣品檢測為陽性，并且檢測數(shù)值呈上升趨勢，判定該批產(chǎn)品為陽性；若3代樣品中第1代為陽性，后2代為陰性，則判定為可疑，須作進(jìn)一步鑒定。

對陽性或可疑樣品進(jìn)一步鑒定，可接種DF-1細(xì)胞（對E亞群ALV有抵抗力）培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d為1代，收取細(xì)胞培養(yǎng)物標(biāo)記為P1代，一部分放-70 ℃冰箱保存，一部分作為接種物，再接種DF-1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，作為P2代，依次類推培養(yǎng)至P3代；采用IDEXX公司禽白血病抗原檢測試劑盒，對3代培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，若有ALV污染，3代培養(yǎng)物檢測的數(shù)值逐代升高；若3代均為陰性，則判定樣品無外源ALV污染；若僅P1或P1、P2同為陽性，P2和P3或P3為陰性，但數(shù)值逐步下降，可將陽性樣品再用DF-1重檢1次，結(jié)果判定同上。此種方法能較準(zhǔn)確地檢測出疫苗中是否污染ALV。但此方法耗時(shí)太長，且對細(xì)胞培養(yǎng)的操作要求較高，可能造成人為操作污染，影響結(jié)果判定，不利于在基層普遍采用。

3.4抗體檢測法對檢測結(jié)果影響

將疫苗接種適宜日齡SPF雞。這一方法操作簡單結(jié)果可靠，也更具說服力，不會(huì)受到其它因素的干擾，是目前檢測外源ALV污染最經(jīng)典的檢測方法[16]。但該方法試驗(yàn)周期較長，成本高，且需要具有SPF雞的飼養(yǎng)條件，方可開展檢測。

4 小結(jié)

綜上所述，列舉的4種檢測方法外，還有其它檢測方法，如IFA（需有特異性單克隆抗體）[17]、接種SPF雞后臨床診斷和組織病理學(xué)診斷（此法只有對ALV感染雞臨床癥狀和組織病理學(xué)有較豐富的經(jīng)驗(yàn)，才可作出判斷，不適宜大多數(shù)疫苗公司和養(yǎng)殖場采用）。上述檢測方法中，在國內(nèi)外被普遍認(rèn)可的是SPF雞抗體檢測法。這種方法檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，但因由于時(shí)間周期較長、成本高，在基層沒有被廣泛采用，而以操作簡便的ELISA和RT-PCR檢測法取而代之，但檢測結(jié)果卻不能真實(shí)反映疫苗的純凈性。為了給廣大養(yǎng)殖生產(chǎn)企業(yè)提供真正純凈疫苗，需要?jiǎng)游镆呙缟a(chǎn)者和養(yǎng)殖企業(yè)認(rèn)真對待禽白血病的檢測，采用正確可靠的檢測方法，排除一切ALV污染，只有這樣才能為家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparison of Diagnostic Methods of Avian Leukosis Virus Contamination in Live Poultry Vaccines

Chu Dianfeng，Du Yuanzhao，F(xiàn)engYanfang，Bo Zhiyong，Liu Qiuyun，Ma Hongqin，Liu Xiang′e
（Qingdao YEBIO Bioengineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266114）

The comparative study of different detection methods for Avian leukosis virus in poultry live vaccine were carried out using direct ELISA method，RT-PCR method，virus isolation and SPF chicken antibody detection method. Avian leukosis virus contamination was detected in live poultry vaccines of different origins. By further sequencing，it was found that both the direct ELISA assay and the RT-PCR assay were “false positive”. The test results showed that although the virus separation method was accurate，it was diff i cult to operate and high technology should be required. The SPF chicken antibody detection method was simple and accurate. And the purity of the vaccine could be ref l ected，which was conducive to popularization and application.

live vaccines；Avian leukosis virus；diagnosis method；antibody test of SPF chicken

S855.3

A

1005-944X（2017）08-0108-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.028

青島市高新區(qū)科技計(jì)劃（QGX-15-KJ2-05）

杜元釗