微小RNA-146a在新生隱球菌、格特隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性反應(yīng)中的機(jī)制研究

王 妍， 高 睿， 陳 宏， 陳 歡， 金 怡，廖寧馨， 陳江漢

微小RNA-146a在新生隱球菌、格特隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性反應(yīng)中的機(jī)制研究

王 妍1， 高 睿1， 陳 宏1， 陳 歡2， 金 怡1，廖寧馨1， 陳江漢1

目的 觀察并分析微小RNA-146a （miR-146a）在新生隱球菌（標(biāo)準(zhǔn)株WM148）、格特隱球菌（標(biāo)準(zhǔn)株R265）刺激人單核巨噬細(xì)胞系（THP-1細(xì)胞）中表達(dá)的差異，探討miR-146a在隱球菌所致隱球菌腦膜炎中的調(diào)控作用及機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)的人單核巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞分成新生隱球菌誘導(dǎo)組、格特隱球菌誘導(dǎo)組，按滅活菌數(shù)∶THP-1=5∶1的比例與THP-1細(xì)胞共孵育0、3、6、9和12 h后離心收集上清液和細(xì)胞沉淀。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞miR-146a的表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)各組上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的釋放量。結(jié)果 新生隱球菌誘導(dǎo)組細(xì)胞中miR-146a表達(dá)量與0 h相比明顯升高（P＜0.01），且在3 h達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)；上清液中TNF-α 的表達(dá)量在誘導(dǎo)后12 h達(dá)到最高值，IL-6的表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)沒有明顯變化。格特隱球菌誘導(dǎo)后，miR-146a的表達(dá)逐漸升高，12 h達(dá)到最高值，但3 h、6 h 點(diǎn)變化與0 h比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上清液中TNF-α的表達(dá)12 h到達(dá)峰值；IL-6的表達(dá)逐漸增加，12 h達(dá)到最高值，變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 新生隱球菌、格特隱球菌刺激THP-1細(xì)胞炎性反應(yīng)后，miR-146a表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的規(guī)律，TNF-α、IL-6的動(dòng)態(tài)變化表現(xiàn)不同的特點(diǎn)。研究表明新生隱球菌、格特隱球菌誘導(dǎo)THP-1炎性反應(yīng)可能存在不同的調(diào)控機(jī)制。

微小RNA-146a； 新生隱球菌； 格特隱球菌； THP-1細(xì)胞； 炎性反應(yīng)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染，以隱球菌侵襲最為常見，致病性隱球菌多為新生隱球菌和格特隱球菌。巨噬細(xì)胞通常被認(rèn)為是防御真菌感染的第一道防線中重要免疫細(xì)胞。抵御隱球菌感染需要誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)南忍烀庖叻磻?yīng)，而過度的免疫激活可能導(dǎo)致機(jī)體損傷或急慢性炎性疾病[1]。因此，人體需要有效的免疫調(diào)節(jié)以避免隱球菌感染所誘發(fā)的不當(dāng)免疫應(yīng)答，這種不當(dāng)免疫應(yīng)答在隱球菌發(fā)病中起重要作用。

微小RNA（microRNA，miRNA）是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一組非編碼小RNA分子，廣泛存在于各種病毒、線蟲、植物及動(dòng)物體內(nèi)[2]。近年來，越來越多的報(bào)道顯示miRNA在免疫細(xì)胞的分化和功能調(diào)節(jié)中起到了至關(guān)重要的作用，其中miR-146a在調(diào)節(jié)固有免疫、炎性反應(yīng)、病毒感染以及一些人類疾病中發(fā)揮著重要的作用[3]。我們通過觀察并分析miR-146a在新生隱球菌（標(biāo)準(zhǔn)株WM148）、格特隱球菌（標(biāo)準(zhǔn)株R265）刺激THP-1細(xì)胞中表達(dá)的差異及相關(guān)炎性因子表達(dá)變化，為探討miR-146a在隱球菌性腦膜炎中的發(fā)病機(jī)制和可能調(diào)控靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞（購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫）；新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株WM148、格特隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株R265來源于（上海）第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科真菌保藏實(shí)驗(yàn)室；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司；FBS購自美國(guó)Hyclone；人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）盒購自美國(guó)ebioscience；TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）；TaqMan MicroRNA Reverse TranscriptionKit、TaqMan Universal PCR Master Mix、Taq-Man MicroRNA Assays（大連TaKaRa公司）；氯仿、異丙醇及無水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞、菌株培養(yǎng) 人單核巨噬細(xì)胞系THP-1培養(yǎng)于含10 %胎牛血清（100 U /mL青霉素、100 U /mL鏈霉素），培養(yǎng)瓶置于37?℃、5 %CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3 d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞密度達(dá)80 %時(shí)傳代培養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)株WM148、標(biāo)準(zhǔn)株R265培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基（1 %酵母提取物、2 %蛋白胨和2 %葡萄糖）3～5 d，30 ℃培養(yǎng)，收集后滅菌0.9 % NaCl洗滌2次，并在56 ℃下失活60 min，計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞分組、處理 將THP-1細(xì)胞按1×106個(gè)/mL接種于六孔板，每孔加培養(yǎng)液至2 mL。實(shí)驗(yàn)分為2組：新生隱球菌誘導(dǎo)組、格特隱球菌誘導(dǎo)組。按照數(shù)量之比為5∶1比例將滅活隱球菌與THP-1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)0、3、6、9、12 h后，離心收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞沉淀，保存于-80?℃冰箱。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）測(cè)定miR-146a的表達(dá) 采用TRIzol法提取細(xì)胞沉淀中的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度。采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit特異miRNA的莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有操作均在冰上完成。采用SYBR?Premix Ex TaqTM II （TliRNaseH Plus）檢測(cè)試劑盒。按說明書加樣在ABI7300定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測(cè)，反應(yīng)條件：95?℃ 30 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95?℃ 5 s，60?℃ 30 s）。選取使用U6作為內(nèi)參照，獲得Ct值后，miR-146a的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，所用引物見表1。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-6含量 按照ELISA試劑盒使用說明書步驟進(jìn)行操作。置于分光光度計(jì)450 nm處測(cè)吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程來計(jì)算各組培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6相應(yīng)濃度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，各組間兩兩差異比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用雙變量Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a在各組細(xì)胞中表達(dá)變化

新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞以后，3 h、6 h、9 h、12 h細(xì)胞中表達(dá)miR-146a量較0 h組明顯升高，3 h達(dá)到最高值，隨后逐漸下降（P＜0.05）。格特隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞3 h、6 h、9 h、12 h細(xì)胞中表達(dá)miR-146a逐漸升高，12 h達(dá)到最高值，9 h、12 h與0 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。見圖2。

表 1 qRT-PCR引物信息表Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR in this study

圖1 miR-146a表達(dá)倍數(shù)變化Figure 1 Fold change of miR-146a expression at different time points after induction by C. neoformans and C. gattii

圖2 TNF-α表達(dá)量Figure 2 TNF-α expression at different time points after induction by C. neoformans and C. gattii

新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞后，IL-6在上清液中的表達(dá)3 h、6 h、9 h、12 h逐漸增加，但3 h與0 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，6 h、9 h、12 h與0 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；格特隱球菌在誘導(dǎo)后，上清液中IL-6的表達(dá)早期變化不明顯，3 h、6 h與0 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），9 h、 12 h逐漸增高，與0 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖3。

圖3 IL-6表達(dá)量Figure 3 IL-6 expression at different time points after induction by C. neoformans and C. gattii

2.2 TNF-α、IL-6在各組上清液中表達(dá)變化

新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞以后，3 h、6 h、9 h、12 h上清液中TNF-α 的表達(dá)量逐漸升高，12 h達(dá)到最高值，與0 h相比差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；格特隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞3 h、6 h、9 h、12 h上清液中TNF-α 的表達(dá)均有所增高，12 h達(dá)到最高值，但3 h、6 h與0 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，9 h、12 h與0 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），

3 討論

隱球菌腦膜炎預(yù)后兇險(xiǎn)、治療困難、死亡率高。近年來該病的發(fā)病率及死亡率在全球呈顯著上升趨勢(shì)[4]。具有致病性的隱球菌絕大多數(shù)為新生隱球菌和格特隱球菌，我國(guó)以新生隱球菌感染為主，格特隱球菌感染少見。流行病學(xué)顯示2/3的隱球菌腦膜炎患者無已知免疫功能低下的基礎(chǔ)疾病；這類“免疫功能正?！被颊吲R床治療困難[5]。

我們通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能研究miR-146a在隱球菌感染中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌刺激以后miR-146a的表達(dá)3 h達(dá)到峰值，而格特隱球菌刺激后miR-146a表達(dá)緩慢升高，并在12 h測(cè)量時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰。同時(shí)，在兩種隱球菌刺激THP-1細(xì)胞以后新生隱球菌誘導(dǎo)組TNF-α、IL-6表達(dá)逐步升高；格特隱球菌誘導(dǎo)組TNF-α逐漸增高、IL-6的表達(dá)在誘導(dǎo)早期變化不明顯。新生隱球菌刺激THP-1細(xì)胞以后，miR-146a、炎性因子的表達(dá)量和表達(dá)規(guī)律與格特隱球菌誘導(dǎo)組有明顯差別，格特隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性反應(yīng)要輕。

已有研究表明：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的自身抗體生成是格特隱球菌性腦膜炎個(gè)體的危險(xiǎn)因素之一[6]，GM-CSF抗體生成抑制GM-CSF的趨化作用，進(jìn)而影響粒細(xì)胞的分化成熟和功能，從而不能有效地誘導(dǎo)保護(hù)性炎性因子去消滅病原微生物[7]。新生隱球菌、格特隱球菌對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的易感性也是不同的，HIV-1的轉(zhuǎn)基因Tg小鼠對(duì)新生隱球菌易感性顯著增強(qiáng)，而格特隱球菌變化不明顯[8]。Cheng等[9]研究表明，在用C57BL / 6小鼠作為對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中，3種格特隱球菌株由于抑制或未能有效激活嗜中性粒細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)的保護(hù)性炎性因子與新生隱球菌相比要少。

綜上所述，新生隱球菌、格特隱球菌誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的過程中存在不同作用機(jī)制，miR-146a 在兩者誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)中都發(fā)揮不同作用。不同病原菌與宿主機(jī)體的不同免疫狀態(tài)的交互作用是隱球菌感染的內(nèi)在機(jī)理，miR-146a等miRNA在新生隱球菌致病中具有重要調(diào)控作用，這方面將是新生隱球菌發(fā)病機(jī)制中深入研究的一個(gè)重要方向。

[1] LAWRENCE T，NATOLI G. Transcriptional regulation of macrophage polarization： enabling diversity with identity[J]. Nat Rev Immunol， 2011， 11（11）： 750-761.

[2] BUSHATI N， COHEN SM. microRNA functions[J]. Ann Rev Cell Dev Biol， 2007，23： 175-205.

[3] 吳思宇，何莉，黃曦. MiR-146a在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 11（12）： 1447-1449.

[4] PARK BJ， WANNEMUEHLER KA， MARSTON BJ，et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS[J]. AIDS，2009，23（4）： 525-530.

[5] YUCHONG C， FUBIN C， JIANGHAN C，et al. Cryptococcosis in China （1985-2010）： review of cases from Chinese database[J]. Mycopathologia， 2012， 173（5-6）： 329-335.

[6] KWON-CHUNG KJ， FRASER JA， DOERING TL，et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii， the etiologic agents of cryptococcosis[J]. Cold Spring Harb Perspect Med，2014，4（7）： a019760.

[7] SAIJO T， CHEN J， CHEN SC，et al. Anti-granulocytemacrophage colony-stimulating factor autoantibodies are a risk factor for central nervous system infection by Cryptococcus gattii in otherwise immunocompetent patients[J]. MBio， 2014，5（2）：e00912-e00914.

[8] LEONGSON K， COUSINEAU-COTE V， GOUPIL M，et al. Altered immune response differentially enhances susceptibility to Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii infection in mice expressing the HIV-1 transgene[J]. Infect Immun， 2013，81（4）： 1100-1113.

[9] CHENG PY，SHAM A， KRONSTAD JW. Cryptococcus gattii isolates from the British Columbia cryptococcosis outbreak induce less protective inflammation in a murine model of infection than Cryptococcus neoformans[J]. Infect Immun，2009， 77（10）： 4284-4294.

Mechanistic study on the role of microRNA-146a in THP-1 cells-associated inflammatory response induced by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii

WANG Yan, GAO Rui, CHEN Hong, CHEN Huan, JIN Yi, LIAO Ningxin, CHEN Jianghan. （Department of Dermatology, Aff i liated Changzheng Hospital, The Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China）

Objective To analyze the differential expression of microRNA-146a (miR-146a) in monocyte-macrophage cell line (THP-1 cells) after induction by Cryptococcus neoformans (C. neoformans, reference strain WM148) or Cryptococcus gattii (C. gattii, reference strain R265), and investigate the mechanism of miR-146a in regulating the inflammatory response of cryptococcal meningitis. Methods The cultured THP-1 cells were divided into two groups to be induced by C. neoformans or C. gattii, respectively. THP-1 cells were induced with inactivated WN148 (or R265) strains at multiplicity of infection (MOI) of 5 in all experiments. The supernatant and the cell pellet were collected separately after incubation. The expression of miR-146a was measured by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) technique. The levels of TNF-α and IL-6 release were assayed by ELISA. Results The expression of miR-146a increased signif i cantly in the C. neoformans induction group compared to 0 h. It reached peak at 3 h (P＜0.01), and then declined gradually. The level of TNF-α increased in supernatant and reached peak at 12 h. The expression of IL-6 did not change signif i cantly at eachtime point. The expression of miR-146a and TNF-α increased gradually and reached peak at 12 h in the C. gattii induction group (P＜0.01), but the change did not reach statistical signif i cance at 3 h, 6 h time points. The expression of IL-6 gradually increased, and reached peak at 12 h time point. Conclusions Following stimulation with C. neoformans or C. gattii, the expression of miR-146a in THP-1 cells showed different patterns over time. The expression levels of TNF-α and IL-6 showed different patterns. These f i ndings suggest that there may be different regulatory mechanisms in the THP-1 cells-associated inf l ammatory response after stimulation by inactivated C. neoformans and C. gattii strains.

microRNA-146a; Cryptococcus neoformans; Cryptococcus gattii; THP-1 cells; inf l ammatory response

R379.5

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0393-04

10.16718/j.1009-7708.2017.04.009

2016-10-14

2017-01-09

國(guó)家重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目。

1. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；2. 南京金陵醫(yī)院皮膚科。

王妍（1991—），女，碩士研究生，主要從事隱球菌腦膜炎分子機(jī)制研究。

陳江漢，E-mail: chenjianghancjh@126.com。