orexin-1受體抑制劑通過Wnt通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

張麗媛 納青青 吳天秀 李近 吳敬開 劉鈺瑜

1.廣東醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，廣東 湛江 524023 2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023

Orexins是神經(jīng)細(xì)胞用來進(jìn)行相互通訊的一種蛋白，自15多年前德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的研究人員發(fā)現(xiàn)Orexins以來，它們被證實(shí)調(diào)控了許多的行為，包括覺醒、食欲、報(bào)償、能量消耗和失眠[1]。目前對(duì)其研究，最為熟知的就是Orexin缺陷可引起發(fā)作性睡病——自發(fā)性日間嗜睡。因此，orexin拮抗劑有望治療失眠癥，其中默沙東制藥公司的suvorexant已經(jīng)2014年8月被FDA批準(zhǔn)上市。

近年來，越來越多的證據(jù)顯示,神經(jīng)肽,比如neuromedin U(NMU)和神經(jīng)肽Y(NPY),可以通過中樞和局部功能調(diào)節(jié)骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)[2]，然而,神經(jīng)肽orexin是否也能調(diào)節(jié)骨量還是未知的。在對(duì)orexins生理功能的研究過程中，德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的研究人員和日本的同事們一起，發(fā)現(xiàn)缺失orexins的小鼠骨骼非常的薄且脆，很容易折斷[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種存在于骨髓內(nèi)來源廣泛、易于擴(kuò)增、具有多種分化潛能的非造血干細(xì)胞，在不同條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膽道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞[4-5]。MSCs成骨分化能力下降是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因，Wnt通路是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的重要通路。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于orexin-1系統(tǒng)與骨代謝的報(bào)道較少，因此本研究通過探討Wnt通路對(duì)orexin-1受體抑制促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化的影響，為開發(fā)新的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物提供新的視點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物

由廣東醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室提供1月齡大鼠10只，雌雄各半，體重70±10g(廣東省動(dòng)物質(zhì)量合格證：scxk(粵)2004-2008；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證：2008B012)。實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)物處理符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2藥物和試劑

DMEM低糖培養(yǎng)液：Gibco公司；胎牛血清：Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)Sigma公司；美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒：Beyotime；Dickkopf-1 Abcam；噻唑藍(lán)(MTT)：美國(guó)SIGMA公司；orexin-1受體抑制劑(SB408124):英國(guó)TOCRIS公司，批次：S154501；wnt3a購(gòu)自R&D公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:Takara公司；PCR試劑盒:Takara公司。

1.1.3儀器

BOXUN 超凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；2424-2型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱：美工SHELLAB公司；XD-101倒置相差顯微鏡：江南光電股份有限公司；TMQ-R-3250自動(dòng)臺(tái)式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；流式細(xì)胞儀FASC Aria：美國(guó)BD公司；超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；定量光度儀：德國(guó)eppendorf公司；定時(shí)定量PCR儀：瑞士羅氏公司；電泳儀：BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞收集

采用傳代貼壁法分離純化大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，具體步驟：1月齡SPF級(jí)SD大鼠6只，雌雄各半，頸部脫臼后，浸泡于75%酒精10 min，無菌分離大鼠兩側(cè)的股骨，75%酒精浸泡，無菌PBS中浸泡，DMEM(L)中浸泡，去除軟組織，用8 mL不完全DMEM(L)培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗出的細(xì)胞液吹打混勻，1000 rmp離心10 min后，棄上清液，沉淀用含10%FBS的DMEM(L)培養(yǎng)液重懸，以1×107/cm2密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，48 h后首次全量換液去除懸浮細(xì)胞，此為原代細(xì)胞P0，以后每2～3d全量換液一次。

1.2.2大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鑒定

1.2.2.1大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：采用倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及一般形態(tài)特征。

1.2.2.2流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMSCsP3細(xì)胞，胰酶消化后1000 rmp，10 min離心后棄去上清，加PBS液1000 rmp，10 min重懸三次，制成單細(xì)胞懸液，用PBS稀釋相應(yīng)抗體。實(shí)驗(yàn)分4組：對(duì)照組、CD90-PE組、CD29-FITC組、CD45-PE-CY5組、CD90-PE+CD29-FITC+CD45-PE-CY5組，每組分別加入相應(yīng)單克隆抗體，30分鐘避光孵育后洗滌，免疫熒光法流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原。

1.2.3免疫印跡方法檢測(cè)orexin-1受體抑制劑對(duì)Wnt通路主要靶點(diǎn)蛋白的影響

取BMSCsP3細(xì)胞消化后，1.5×105/cm2種于6孔板，次日加藥，分組：Control、50μg/LWnt3a、1×10-5mol/L orexin-1受體抑制劑、1×10-6mol/L orexin-1受體抑制劑。待測(cè)定時(shí)間消化細(xì)胞，用PBS洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上靜置15至20 min，每3 min渦旋振蕩混勻一次，4℃離心機(jī)13200 rpm，15 min，吸取上清液，放于-20℃?zhèn)溆谩Ｎ∶靠?0 μL的樣品加入96孔板，每孔PBS10 μL，每孔100 μL染液，室溫靜置120 min，用酶標(biāo)儀在570 nm下檢測(cè)吸光值。蛋白上樣樣品制備蛋白樣品和5×上樣緩沖液按4∶1量配比，將蛋白放置煮沸的水中10 min后，取出備用。將制膠裝置組裝完成后用超純水撿漏，將配好的分離膠注入裝好的制膠板間，30 min后待分離膠凝固后，加入配制好的濃縮膠，同時(shí)將齒梳裝好，待濃縮膠凝固后，拔出齒梳，每孔加入25 μL的蛋白上樣樣品。用80 V電泳3 min后，改用120 V待樣品跑至分離膠與濃縮膠交界處改用100 V，100 min，當(dāng)Maker分層后，電泳至Maker分離至分離膠底部，停止電泳。將膠從板上剝離后，切除濃縮膠，保留分離膠，并放置進(jìn)已準(zhǔn)備好的三文治結(jié)構(gòu)的盒子中，纖維布、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙、纖維布，排盡氣泡后，裝好裝置用100V轉(zhuǎn)膜，90 min后停止轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜后，用含封閉液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床1小時(shí)后，封閉完成。取出PVDF后，加入封閉液稀釋一抗(1∶200)，用塑料膜封口后，放于4℃冰箱搖床過夜。取出加入一抗過夜的PVDF膜，放于搖床上一小時(shí)復(fù)溫后，用TBST洗PVDF膜3次，每次5 min后，加入含封閉液稀釋二抗(1∶5 000)，放置于塑料封口膜中搖床搖1 h。用TBST洗PVDF膜5次每次5 min，浸泡于TBST中。PVDF膜浸泡發(fā)光液中，放入盒子用底片曝光，洗片機(jī)顯影定影后取出底片。

1.2.4orexin-1受體抑制劑對(duì)Wnt通路靶點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

取BMSCsP3細(xì)胞消化，3×105/cm2種于6孔板，次日加藥。分組：Control、50 μg/LWnt3a、1×10-5mol/Lorexin-1受體抑制劑、1×10-6mol/L oreixn-1受體抑制劑。每3天更換新鮮的培養(yǎng)液和藥物，放進(jìn)孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。用藥物處理BMSCs5天后，棄去培養(yǎng)液和藥物，用PBS潤(rùn)洗3次棄去PBS后，將Trizol加入板內(nèi)，裂解細(xì)胞后，收集液體。每1 mL的Trizol加入200 μL的氯仿，劇烈混勻15 s，室溫下靜置2 min，4℃，12000 rpm離心15 min，取上層上清液，加入等體積異丙醇，靜置10 min，4℃，12000 rpm離心10 min，棄去上清，加入75%DEPC水配制的乙醇，混勻后7000 rpm，4℃離心5 min，棄去乙醇溶液，室溫下風(fēng)干10 min，加入適量DEPC水溶解RNA，-20℃?zhèn)溆谩? μLRNA樣品加入適量的稀釋液，混勻后轉(zhuǎn)入比色杯。用稀釋液調(diào)零，將樣本管放入定量光度儀，在260 nm處讀取OD值。OD值×倍數(shù)，即得RNA濃度(μg/μL)，在280nm處測(cè)OD值，計(jì)算OD260/OD280(1.7<比值<2.1的樣本用于PCR反應(yīng))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

剛分離的BMSCs，呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中，與骨髓中的其他雜細(xì)胞相混，不能很好被辨認(rèn)。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開始貼壁，呈圓形發(fā)亮，48 h后首次全量換液，顯微鏡觀察可見小部分貼壁展開細(xì)胞，呈不規(guī)則生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為短條狀或圓形，出現(xiàn)一些團(tuán)簇集落。4到5天后貼壁細(xì)胞數(shù)量增多，并逐漸長(zhǎng)出偽足，呈梭形、三角形或扁平形，先形成不同大小分散小集落，胞漿豐富，胞核大且清晰。7到9天后，細(xì)胞達(dá)到融合生長(zhǎng)，集落間融合，細(xì)胞形態(tài)較均一，細(xì)胞呈梭形，此時(shí)進(jìn)行首次傳代。胰酶消化時(shí)，細(xì)胞逐漸收縮，把吹打下來的細(xì)胞重新種回培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞重新貼壁展開，經(jīng)過2～3次傳代換液后，細(xì)胞形態(tài)基本均一，呈均勻有序的長(zhǎng)梭形。見圖1。

圖1 傳四代大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3d時(shí)的細(xì)胞形態(tài)(×100倍)Fig.1 Micrographs of the fourth passage BMSCs at 3d(×100)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面抗原

收集BMSCsP3進(jìn)行CD29-PE，CD90-FITC，CD45-FITC熒光染色，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：從第三代開始，BMSCs表面抗原CD29表達(dá)陽性，陽性細(xì)胞率>99%(圖2K、N、Q)；CD90表達(dá)陽性，陽性細(xì)胞率>99%(圖2L、O、Q)，CD45表達(dá)陰性，陽性細(xì)胞率為3.4%(圖2M、P、Q))；共表達(dá)CD29+和CD90+、CD45-細(xì)胞率為96.5%(圖2Q)，由此可以說明經(jīng)過傳代，BMSCs純度>96%。提示運(yùn)用傳代貼壁法體外無菌分離傳代純化可以獲得純度較高的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代BMSCs表面抗原CD29、vCD45和CD90表達(dá)Fig.2 Surface antigen expression of CD29, CD45 and CD90 in BMSCsP3 detected by Flow cytometry

2.3 orexin-1受體抑制劑對(duì)Wnt通路主要靶點(diǎn)蛋白Dickkopf-1、Gsk3β、β-catenin的影響

由圖3和表1所示，BMSCs經(jīng)Wnt3a和orexin-1受體抑制劑處理后的Dickkopf-1、β-catenin和GSK3β表達(dá)都升高，其中1×10-5mol/Lorexin-1受體抑制劑組Dickkopf-1的表達(dá)比1×10-6mol/L orexin-1受體抑制劑組的高；而GSK-3β、β-actin的表達(dá)比1×10-6mol/Lorexin-1受體抑制劑組的低，兩組β-catenin的表達(dá)無明顯差別。

圖3 免疫印跡曝光后X光片掃描圖Fig.3 Scanned image on X-rays after exposure of Western blot

表1 orexin-1受體抑制劑對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞Wnt通路靶點(diǎn)蛋白影響Table 1 Effects of orexin-1 receptor inhibitor on target protein of Wnt signaling pathways in BMSCs

2.4 orexin-1受體抑制劑對(duì)Wnt通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

如表2所示，與Control組對(duì)比，Wnt3a上調(diào)β-catenin mRNA和GSK3βmRNA的表達(dá)(P<0.05)；與Control組對(duì)比，orexin-1受體抑制劑也上調(diào)了β-catenin mRNA和GSK3βmRNA的表達(dá)(P<0.05)。

表2 orexin-1受體抑制劑對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞基因的影響Table 2 Effects of orexin-1 receptor inhibitor on the

注：與對(duì)照組相比▲P<0.05
Note：▲P<0.05 vs control

3 討論

Wnt蛋白是一組由半胱氨酸殘基組成的分泌型糖脂蛋白，作為調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的重要信號(hào)途徑，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路主要由19種分泌蛋白組成，一般認(rèn)為Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8、Wnt8b是經(jīng)典Wnt蛋白，而Wnt4、Wnt5a，Wnt5b、Wn6t、Wnt7a、Wnt11是非經(jīng)典蛋白[6]，這些蛋白和相應(yīng)的膜受體發(fā)生結(jié)合可激發(fā)一系列的繼發(fā)反應(yīng)，能和一7次跨膜大分子(發(fā)卷樣蛋白)特異性識(shí)別，在低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6(LRP5/6)協(xié)同下共同作用[7]。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，主要調(diào)控成骨分化的靶點(diǎn)有DKKs、sFRPs、GSK3β、WIF、Sclerostin等，最終由于β-catenin表達(dá)增多而促進(jìn)骨形成。當(dāng)Wnt與frizzled受體以及其共受體，還有低密度脂蛋白相關(guān)蛋白LRP 5/6受體結(jié)合，繼而與Axin、Frat-1形成復(fù)合體，抑制糖原合成激酶3(GSK3)的活性，β-catenin的分解被抑制，在胞質(zhì)內(nèi)蓄積的β-catenin進(jìn)而轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，然后與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(LEF)相互作用，從而介導(dǎo)Wnt引起的基因轉(zhuǎn)錄的改變，影響細(xì)胞的分裂、分化和成熟[8]。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，廣泛存在于骨髓及松質(zhì)骨中，在骨代謝中起重要作用。同時(shí)作為一種多潛能干細(xì)胞，主要表現(xiàn)出自我增殖和多向分化潛能，可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等方向分化，即具有可塑性。此外，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化與向脂肪細(xì)胞方向分化之間存在著此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者其骨髓中的松質(zhì)骨骨量與脂肪細(xì)胞呈反比，骨量的減少總是相伴骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的增多，而通過靶向調(diào)控BMSCs分化方向的相關(guān)因素能調(diào)控BMSCs的分化方向，從而增加成骨細(xì)胞的數(shù)目和活性。目前誘導(dǎo)BMSCs成骨分化有機(jī)械因素如剛度矩陣[9-10]，還有化學(xué)刺激如β-磷酸甘油、地塞米松和抗壞血酸。BMSCs來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，已被認(rèn)為是理想的工程種子細(xì)胞，越來越受到學(xué)者們的青睞，BMSCs替代療法以及定向調(diào)控BMSCs分化方向的方法成為治療骨質(zhì)疏松等骨丟失相關(guān)疾病的新途徑。

Wnt3a是作用于經(jīng)典Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的TCF/LEF靶基因的Wnt蛋白之一，能激活Wnt/β-catenin，從而引起Wnt信號(hào)通路基因和蛋白的改變。Wnt3a和GSK3β抑制物會(huì)抑制地塞米松作用的hMSC成骨分化。研究發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)的早期加入Wnt3a干預(yù)可促進(jìn)MSCs堿性磷酸酶表達(dá)，促進(jìn)成骨分化，晚期則會(huì)抑制堿性磷酸酶表達(dá)抑制成骨分化[11]，推斷當(dāng)MSCs開始成骨分化時(shí)，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)干細(xì)胞向成骨方向分化，但在分化的終末又會(huì)抑制成骨細(xì)胞的最終分化成熟。本實(shí)驗(yàn)中Wnt3a組的β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表達(dá)都比Control組高，與Filali M結(jié)果一致[12]。

Dickkopf-1與GSK3β蛋白表達(dá)升高對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路是起抑制作用的，本實(shí)驗(yàn)中orexin-1受體抑制劑對(duì)Dickkopf-1與GSK3β蛋白表達(dá)的抑制作用，其意義有待進(jìn)一步的研究。我們推測(cè)，orexin-1受體抑制劑的作用可能是多靶點(diǎn)的，除了對(duì)Dickkopf-1與GSK3β蛋白有作用外，還可能作用于Wnt/β-catenin信號(hào)通路其他的靶點(diǎn)，綜合的結(jié)果使β-catenin的表達(dá)升高。此外，由于非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在MSCs成骨分化過程中可促進(jìn)成骨分化，所以orexin-1受體抑制劑也可能通過激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，使β-catenin的表達(dá)升高。