重組Ad-SOCS1介導(dǎo)的樹突狀細胞源外泌體對銀屑病樣小鼠模型的影響

曾凡杞 冉靈芝 胡鵬飛 劉鵠蔭

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·論著·

重組Ad-SOCS1介導(dǎo)的樹突狀細胞源外泌體對銀屑病樣小鼠模型的影響

曾凡杞 冉靈芝 胡鵬飛 劉鵠蔭

目的： 明確重組腺病毒(Ad-SOCS1)介導(dǎo)的樹突狀細胞(DCs)分泌的外泌體對銀屑病樣小鼠模型的影響。方法： Ad-SOCS1腺病毒感染小鼠骨髓來源的DCs，分離純化培養(yǎng)物中的外泌體，Western blot分析鑒定外泌體中的CD63、SOCS1和ICAM-1蛋白。咪喹莫特(IMQ)誘導(dǎo)10只銀屑病樣小鼠模型，其中5只給予外分泌體治療(外分泌體組)組，5只作為對照(IMQ組)。RT-PCR檢測小鼠外周血IL-17A、IL-22和IL-23 mRNA的表達水平。結(jié)果： 外泌體中能夠鑒定到SOCS1、CD63和ICAM-1蛋白。外分泌體組小鼠的銀屑病樣表現(xiàn)較IMQ組輕。外分泌體組小鼠外周血IL-17A和IL-23 mRNA的表達低于IMQ組(P<0.01)，IL-22水平兩組間無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論： Ad-SOCS1感染DC后培養(yǎng)物分離的外泌體可改善銀屑病的癥狀，其機制可能與外泌體SOCS1抑制IL-17A有關(guān)。

SOCS1； 銀屑??； 樹突狀細胞； 外泌體； IL-17A

銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫異常疾病，因其具有發(fā)病率較高和主要累及青壯年等特點而在皮膚科臨床倍受重視。從病理學(xué)上看，角質(zhì)形成細胞增殖和分化的異常、角質(zhì)層Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤是銀屑病的三個最主要的特點[1]。近年來許多研究表明白細胞介素(interleukin，IL)中IL-23/IL-17炎癥反應(yīng)軸在銀屑病皮損發(fā)展中起重要作用[2]。樹突狀細胞分泌的IL-23與受體結(jié)合后誘導(dǎo)T輔助細胞17(T helper 17,Th17)活化并分泌IL-17、IL-22等多種細胞因子[3]，Th17細胞是IL-17家族細胞因子的主要來源，IL-17被認為是建立和維持銀屑病表型的關(guān)鍵細胞因子[4]。目前治療銀屑病的藥物主要有維A酸類藥物、傳統(tǒng)免疫抑制劑以及新型免疫抑制劑，但這些藥物仍不能有效根治銀屑病，因此探索銀屑病新的治療方法或藥物非常必要。

細胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling1, SOCS1)是信號傳導(dǎo)通路JAK/STAT的一個負性調(diào)控分子，通過SH2結(jié)構(gòu)域與細胞因子受體胞內(nèi)段與Janus激酶(Janus kinases,JAK)結(jié)合，泛素化后降解，從而阻滯干擾素(interferon，IFN)中的IFN-α、IFN-7、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15等多種因子信號，抑制樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)和其他細胞內(nèi)JAK-STAT信號通路[5]。因此，SOCS1可能對銀屑病的治療具有一定的作用。前期我們利用腺病毒介導(dǎo)SOCS1治療銀屑病樣小鼠模型取得了一定療效，但腺病毒含有其他蛋白能刺激宿主產(chǎn)生中和抗體，影響再次使用。因此，探尋新的載體非常必要。

外泌體(exosome,Exo)是直徑約50～100 nm的小囊體，產(chǎn)生于血細胞或非血細胞的多囊體。含許多重要的生物活性分子，如MHC-I，MHC-II，CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和miRNAs，Exo靶向受體細胞的各種不同黏附分子起免疫調(diào)節(jié)作用[6]。此外，Exo因為其納米大小，較細胞穩(wěn)定，具有良好的生物依從性，是國際納米醫(yī)學(xué)研究的前沿和熱點，是天然的納米載體。研究表明IL-10處理不成熟的DCs獲得的Exo能夠抑制小鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)和減少關(guān)節(jié)炎炎癥程度[7]。用表達FasL或IL-4的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs產(chǎn)生的Exo抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)炎癥，以MHC-II依賴而不是MHC-I依賴的機制能部分逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)炎[8,9]。該研究證明了通過外源基因修飾的DCs獲得的外泌體具有免疫抑制的功能。

在本研究中，用重組Ad-SOCS1病毒感染DCs后獲得的Exo治療用咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)銀屑病樣的小鼠模型，并研究其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 小鼠模型 Bal/C小鼠(雄性，18～20克，8周齡)購自廣東省實驗動物中心20只，分成對照組、IMQ組、IMQ+DCs-Exo-s組，每組5只，小鼠背部用脫毛機去毛2 cm×2 cm，對照組背部涂凡士林21 mg，1次/2 d,。其余兩組小鼠背部用含5% IMQ軟膏，劑量為62.5 mg涂抹，1次/2d，連續(xù)4次。同時IMQ+DCs-Exo-s組于IMQ涂抹后第2 d于皮損處以1.0 μg/kg劑量多點皮下注射，1次/2 d，連續(xù)4次。對照組和IMQ組用等量的PBS代替Exo。皮損的嚴(yán)重性用修正的人評分系統(tǒng)PASI分級評價[7]。累積得分的多少表明炎癥的嚴(yán)重性，得分越多表明炎癥越重。第8 d用斷頸方法處死小鼠，收集皮損標(biāo)本和血液標(biāo)本。所有動物的操作按照醫(yī)院倫理學(xué)委員會制定的指導(dǎo)手冊進行。

1.2 Ad-SOCS1和Ad-EGFP病毒的構(gòu)建和鑒定 Ad-SOCS1和Ad-EGFP重組病毒由本院中心實驗室保存，用Adeno-X Rapid Titer kit(BD Clontech)檢測病毒滴度。操作按BD Company試劑盒說明書進行。

1.3 小鼠DCs的培養(yǎng) 小鼠DCs的培養(yǎng)參照文獻[11]，具體如下。Bab/C小鼠(體重20～25 g，年齡4～6周)處死后在75%酒精中浸泡10 min，取后腿骨和脛骨，用無血清培養(yǎng)基沖洗骨髓后，用0.83%氯化銨破碎紅細胞，離心去上清，再用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次，然后用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，6 h后除去未貼壁細胞，繼續(xù)在含rm-IL-4(10 ng/mL)、白血病抑制因子(LIF)(5 ng/mL)和rm-GM-CSF(10 ng/mL)的完全培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，加入重組Ad-SOCS1或Ad-EGFP病毒(感染復(fù)數(shù)為10)到DCs培養(yǎng)物中，48 h后，收集細胞培養(yǎng)物。

1.4 Exo的分離純化和鑒定 Exo用梯度離心分離得到[7]，具體方法如下。被收集的培養(yǎng)上清液以300 g離心10 min,1200 g離心20 min,10 000 g離心30 min；上清液再以100 000 g超速離心1 h。Exo用生理鹽水洗滌，再以100 000 g超速離心1 h，以120 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，Exo蛋白濃度用微量Bradford蛋白實驗定量(Bio-Rad,CA)。每批用蛋白定量進行標(biāo)準(zhǔn)化，1 μg Exo蛋白溶解在20 μL PBS后用于小鼠體內(nèi)研究。分離后的Exo用電子顯微鏡鑒定其大小，用Western blot分析鑒定Exo中的蛋白，如CD63、ICAM-1和SOCS1。

1.5 Western blot分析Exo 用Western blot分析鑒定Exo。蛋白樣品用12% SDS-PAGE膠電泳后轉(zhuǎn)膜到0.22 μm PVDF膜上。膜用含5%脫脂牛奶的TBST(10 mM Tri-HCL，150 mM NaCl，0.25% Tween-20,pH 7.5)室溫下封閉1 h，然后加入一抗孵育過夜。一抗是兔抗小鼠多克隆抗體SOCS1(Santa Cruz)、抗-ICAM-1、HSP70(所有一抗以1∶1000稀釋)，用TBST洗滌后，膜在室溫下與羊抗兔的IgG-HRP二抗孵育1 h,用加強的化學(xué)熒光(ECL)顯色。

1.6 外周血細胞因子的檢測 外周血細胞因子的濃度用Th1/Th2/Th17 CBA試劑盒(BD Pharmingen,USA)檢測。

1.7 病理分析 石蠟包埋的皮損組織用冰凍切片機制成4 μL薄片，按照常規(guī)的病理進行H&E染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察皮損的病理變化。

1.8 實時定量RT-PCR 用TRIzol試劑盒(Invitrogen,USA)從皮損提取總RNA，用NucleoSpin RNA試劑盒(Macherey-Nagel,Germany)純化。用AcDNA合成試劑盒(Agilent Technologies,USA)和特異引物產(chǎn)生互補cDNA，用實時定量RT-PCR檢測基因的相對表達水平(Roche,USA)。與β-Actin比較進行歸一化處理，mRNA的表達用相對倍數(shù)表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SSPS 17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗比較兩組之間的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC和DC來源的Exo的鑒定 以前我們已證明Ad-SOCS1感染DCs表達SOCS1[10]。由于未成熟的DCs具有免疫抑制功能，我們在培養(yǎng)DCs的過程中加入LIF、IL-4，一方面促進DCs的培養(yǎng)，另一方面抑制DCs的成熟。透射電鏡觀察顯示自DCs培養(yǎng)物分離純化的Exo直徑為50 nm左右，Western blotting分析表明Exo含SOCS1、CD63和ICAM-1蛋白,而沒有感染Ad-SOCS1的DCs細胞獲得的Exo含SOCS1蛋白較少Ad-SOCS1和Ad-EGFP病毒感染的DCs來源的Exo均含CD63、ICAM-1蛋白。這些結(jié)果表明我們成功地從Ad-SOCS1和Ad-EGFP病毒感染DCs后培養(yǎng)物中分離和純化了Exo,Ad-SOCS1感染DCs后培養(yǎng)物的Exo中含SOCS1蛋白(圖1)。

a：用透射電鏡觀察Exo；b：Western blot分析Ad-SOCS1感染和未感染的DC分離的Exo中蛋白CD63、ICAM-1和SOCS1。

圖1 DC培養(yǎng)物分離純化的Exo的鑒定

2.2 Exo對銀屑病樣小鼠模型的治療觀察 從圖2可以看出對照組皮損無鱗屑、無增厚，呈正常皮膚外觀。IMQ組從第2 d開始出現(xiàn)紅斑、皺褶，并隨著時間的推移皮損加重，至8 d皮損深紅，大量的鱗屑，呈層狀增厚，鱗屑脫落可見點狀出血，呈典型銀屑病樣外觀。IMQ+DCs-Exo-s組可見少許紅斑、鱗屑，皮膚輕度增厚。我們采用修正的PASI評分系統(tǒng)對小鼠皮損進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組在PASI總分、紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度方面具有顯著差異(P<0.05)，見表1。H&E染色結(jié)果表明對照組皮膚薄，細胞形態(tài)正常，IMQ組的皮損棘細胞角化不全，棘層肥厚，有延長

的“網(wǎng)狀”背脊，真皮淺層血管周圍炎癥細胞浸潤，呈現(xiàn)銀屑病樣的典型表型，但IMQ+DCs-Exo-s組顯著減少表皮層厚度，減輕IMQ誘導(dǎo)的銀屑病。病理分析進一步支持DCs-Exo-s能夠改善角質(zhì)形成細胞角化，顆粒層增加，棘層減少，真皮淺層血管周圍淋巴細胞浸潤減少(圖3)。這些結(jié)果表明Ad-SOCS1感染的DC來源的Exo對銀屑病樣的小鼠模型皮損有顯著的改善作用。

表1 不同處理對IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型后第7 d的得分、鱗屑、厚度和紅斑指標(biāo)

注：與對照組比較，*P<0.01；與IMQ組比較，#P<0.05

圖2 不同處理的皮膚表觀

a:對照組;b:IMQ組;c:IMQ+DCs-Exo-s組

圖3 Exo治療IMQ誘導(dǎo)小鼠的銀屑病樣組織的病理分析(HE，×100)

2.3 外周血細胞因子水平的檢測 與對照組比較，IMQ組小鼠外周血中IL-17A、IL-10、IL-4、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平分別提高5.1、9.0、8.3、6.5、6.1、3.6和3.3倍。與對照組比較DCs-Exo-s組外周血中IL-17A、IL-10、IL-4、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平分別為2.8、6.4、5.3、2.8、3.0、1.3和1.4。這些結(jié)果表明IMQ的反復(fù)涂抹小鼠皮膚能夠激活免疫系統(tǒng)，而Ad-SOCS1感染DCs的Exo能夠抑制IMQ誘導(dǎo)的免疫激活(表2)。

2.4 皮損組織中IL-17A、IL-22和IL-23 mRNA的表達 為了更清楚研究Exo的作用，我們根據(jù)前面的實驗，用RT-PCR分析比較對照組、IMQ組和IMQ+DCs-Exo-s組小鼠皮損中IL-17A、IL-22和IL-23的表達。結(jié)果表明DCs-Exo-s能顯著抑制IL-17A和IL-23的表達，各處理組對IL-22的表達沒有明顯差異(P>0.05)，見圖4。

表2 IMQ組和IMQ+DCs-Exo-s組細胞因子水平較對照組提高的倍數(shù)

與同組對照組和IMQ+DCs-Exo-s組比較，*P<0.01

3 討論

SOCS1是各種不同細胞因子刺激細胞后細胞內(nèi)的負反饋因子，為JAK/Stat信號途徑中JaK激酶的假底物，從而抑制JAK/Stat信號途徑。DCs細胞在先天免疫和獲得性免疫中處于中心地位，由不同的亞群組成，不同亞群所起的作用也不完全相同。臨床上一般從外周血分離的單個核細胞在IL-4/Flt3和rm-GM-CSF誘導(dǎo)成未成熟的DCs，用抗原脈沖，用LPS或TNF-α使DCs成熟制備DCs細胞疫苗，用于腫瘤或病毒的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，未成熟的DCs表明具有免疫抑制功能，對自身免疫性疾病具有一定的治療作用。但是，體外培養(yǎng)的DCs難以保存。研究表明DCs或Tregs分泌的Exo與其母體一樣具有免疫調(diào)節(jié)作用，主要因為Exo含有各種生物活性分子，如mRNA、microRNA、lncRNA、酶和蛋白質(zhì)等[12]。在本研究中，我們從未成熟的DCs培養(yǎng)物中通過多次離心獲得了Exo，其直徑約50 nm,用Western blotting分析證明了這些Exo含CD63和ICAM-1特征性標(biāo)記物。Ad-SOCS1感染的DC培養(yǎng)物Exo中含SOCS1蛋白。含生物活性的Exo被細胞攝取后，生物活性分子在受體細胞中發(fā)揮其功能。

用IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型能模擬人類銀屑病，包括紅斑、過度角化、鱗屑、表皮中性粒細胞的微膿瘍和真皮淺層血管周圍炎癥細胞浸潤，是研究銀屑病較為理想的模型[7]。在本研究中，我們研究了表達SOCS1的腺病毒感染樹突狀細胞后獲得的Exo，能顯著改善角質(zhì)形成細胞的增殖和炎性細胞浸潤，抑制Th17細胞分化和IL-17A的分泌，這可能與Ad-SOCS1感染DC細胞后獲得的Exo中含SOCS1蛋白有關(guān)，因為Ad-SOCS1感染的DCs來源的Exo對銀屑病樣小鼠模型的表觀改善更為顯著，更能抑制IL-17A的分泌。因此，Ad-SOCS1感染DCs獲得的Exo能抑制Th17/IL17信號軸。盡管Th1細胞是銀屑病的主要細胞類型，但目前認為Th17/IL-23在銀屑病免疫致病中起關(guān)鍵作用[12]。而IL-23是推動初始T細胞分化成Th17的關(guān)鍵細胞因子，是架設(shè)先天性免疫和獲得性免疫所必需的細胞因子，并啟動早期局部免疫反應(yīng)；IL-23結(jié)合受體后可激活JAK-STAT3信號途徑，有研究表明在銀屑病患者皮損及外周血IL-23的mRNA和分子水平均有較高水平表達[14，15]，在本研究中，IMQ組皮損中IL-23的mRNA顯著升高(P<0.01),IMQ+DCs-Exo-s組皮損中IL-23的mRNA較IMQ組顯著降低(P<0.01),但仍高于對照(P<0.05)。因此，我們推斷并支持IL-23在銀屑病的致病機制中起主要作用，靶向IL-23的藥物(如Tildrakizumab和Guselkumab)有助于治療銀屑病[16]。Th17細胞與各種自身免疫病和炎癥性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、實驗自身免疫腦膜炎)相關(guān)[17]。IL-23是從初始CD4+T細胞在TGF-β和IL-6誘導(dǎo)下分化和維持致病Th17關(guān)鍵的上游細胞因子。DCs和巨噬細胞產(chǎn)生的IL-23結(jié)合到被激活的Th17細胞上的IL-23受體，強化極化的Th17主要轉(zhuǎn)錄因子-孤兒核受體c-t(orphan nuclear receptor c-t,RORc-t)的表達。RORc-t和IL-6相互作用共同誘導(dǎo)STAT3信號刺激效應(yīng)細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22的產(chǎn)生[18，19]。在本研究中，源自Ad-SOCS1感染的DCs后分泌的Exo能減少皮損和外周血中的IL-17A的表達，可能直接減少CD4+IL-17A細胞的百分比，抑制IL-17A的表達，表明Ad-SOCS1感染的DCs后分泌的Exo不僅能抑制Th17細胞分化而且抑制Th17細胞功能。Th17細胞和其它炎癥細胞分泌前炎癥細胞因子TNF-α，該細胞因子被認為是銀屑病治療的重要靶點[20，21]。在IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中，DCs后分泌的Exo減少TNF-α的表達，而且減少Th1相關(guān)細胞因子IFN-γ的表達。此外，DCs后分泌的Exo抑制IMQ誘導(dǎo)的IL-10表達。我們推測增加IL-4表達保護Th1/Th2平衡，IL-10表達增加前炎癥細胞因子的分泌，因而抑制銀屑病樣小鼠模型的Th17/Treg平衡。因為DCs后分泌的Exo抑制IL-17A，IL-10的表達。

總之，我們證明了Ad-SOCS1感染DCs后分泌的Exo通過抑制Th17細胞的分化和IL-17A的分泌減輕IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣炎癥。該結(jié)果表明Ad-SOCS1感染DCs后分泌的Exo能作為抑制銀屑病局部炎癥的潛在制劑。

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(收稿：2017-01-08 修回：2017-03-09)

Effects of Ad-SOCS1 infected DCs-secreted exosome on the therapy of psoriasis-like murine models

ZENGFanqi,RANLingzhi,HUPengfei,LIUHuyin.

ShenzhenGuangmingNewDistrictPeople'sHospital518106,Guangdong,China

Correspondingauthor:ZENGFanqi,E-mail:zeng-2005@126.com

Objective: To determine the effect of exosome derived from the dendritic cells (DCs) induced by Adenovirus-Suppressor of cytokine signaling1 (Ad-SOCS1) on the psoriasis-like murine models. Methods: The exosomes of murine DCs were infected by Ad-SOCS1. The levels of SOCS1, CD63 and ICAM-1 from exosome were detected by Western Blot. The psoriasis-like murine models were induced by imiquimod (IMQ) and were divided into the DC-exo(s) group and IMQ-group. The mRNA levels of IL-17A, IL-22 and IL-23 in peripheral blood were detected by RT-PCR. Results: SOCS1, ICAM-1 and CD63 proteins in exosomes were detected. The symptoms of the psoriasis-like mouse in the DC-exo(s) group were better than that in the control group. The level of IL-17A and IL-23 mRNA were higher in the DC-exo-S group than that in the control group. There was no significant difference in the IL-22 level between the DC-exo-S group and control group. Conclusion: Exosome from Ad-SOCS1-infected DCs culture can improve the psoriasis-like murine models. The mechanisms may be associated with the inhibition of IL-17A and IL-23.

suppressor of cytokine signaling1 (SOCS1); psoriasis, dendritic cells (DCs); exosome; IL-17A

深圳市科技計劃項目(編號：201103214)

深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，廣東深圳,518106

曾凡杞，E-mail：zeng-2005@126.com