功能性單核苷酸多態(tài)性調控結核病易感的分子機制研究

朱秀云 汪文斐 張培澤 張潔云 邱智輝 王召欽 張明霞 鄧國防

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·論著·

功能性單核苷酸多態(tài)性調控結核病易感的分子機制研究

朱秀云 汪文斐 張培澤 張潔云 邱智輝 王召欽 張明霞 鄧國防

目的 通過構建花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX-12)基因(ALOX-12基因)啟動子區(qū)域rs3840880位點不同基因型的雙熒光素酶表達質粒，分析此單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)對ALOX-12基因啟動子活性的影響及其對基因表達的影響，闡明功能性SNP調控結核病易感的分子機制。方法 從全血樣本中提取人全基因組，PCR擴增ALOX-12基因啟動子區(qū)域包含rs3840880位點在內的約1700 bp的基因片段，構建pGL3-Basic-rs3840880G質粒，對此質粒進行定點突變得到pGL3-Basic-rs3840880 D放散型(DEL)質粒，分別轉染人宮頸癌細胞株Hela細胞后使用雙熒光報告酶檢測系統(tǒng)(dual luciferase assay system)檢測相對熒光值。結果 成功構建了ALOX-12基因啟動子區(qū)rs3840880位點等位基因G的表達質粒pGL3-basic-G，采用定點突變技術成功將pGL3-basic-G質粒改造為pGL3-Basic-DEL質粒，測序驗證后，兩質粒其他序列完全相同。分別將此兩個質粒轉染Hela細胞并檢測相對熒光比值[熒光值(F)/熒光(R)]后，發(fā)現(xiàn)pGL3-Basic質粒F/R=0.129，等位基因G的F/R=0.194，低于等位基因DEL質粒的F/R(0.274)，采用單因素方差分析，二者之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=25.09，P=0.001)。結論 不同等位基因構建的質粒轉染細胞后，熒光報告基因的表達差異具有統(tǒng)計學意義，故ALOX-12基因啟動子區(qū)域的功能性SNPs確實能夠影響啟動子的活性，從而調控結核病的易感性。

花生四烯酸鹽12-脂氧合酶； 多態(tài)性, 單核苷酸； 熒光光度測定法； 結核?。?基因表達調控, 細菌

結核病作為一種慢性炎癥反應疾病，是多因素導致的復雜疾病。據世界衛(wèi)生組織最新的調查報告顯示，全球約有1/3的人口感染結核分枝桿菌，而在發(fā)生結核分枝桿菌感染的人群中僅有5%～10%發(fā)生結核病的事實表明，宿主遺傳易感性在結核病的發(fā)生中起著關鍵作用，抗炎藥物應答反應具有宿主基因型特異性也是結核病靶向基因和藥物治療的基礎。

全國結核病流行病學抽樣調查表明，我國結核病發(fā)病率下降緩慢，每年因結核病死亡的患者約12萬例，相當于其他傳染病死亡總和的2倍[1-2]。結核病的發(fā)病受多種因素影響，目前具體機制尚不清楚[3]。脂氧合酶(LOX)家族的多個基因亞型表達具有物種和組織特異性[4]，12-羥基二十碳四烯酸(12-HETE)是由脂氧合酶-12(LOX-12)催化花生四烯酸(AA)產生，它廣泛參與多種炎癥疾病的病理生理過程，被認為是體內最重要的內源性脂質促炎介質之一。雖然有關花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX-12)基因(ALOX-12基因)多態(tài)性與疾病遺傳易感性的有關研究有限，但在這些僅有的少量報道中業(yè)已發(fā)現(xiàn)ALOX-12基因與多個人類疾病易感性有關，包括炎癥反應性疾病、腫瘤和慢性感染性疾病[3]。LOX基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點rs2115819也被報道與結核病的易感性有關，是LOX基因家族多態(tài)性在中國漢族人群，尤其是兒童群體中為數(shù)不多的研究之一[5]。Tobin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，位于白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase, LTA4H)(LTA4H基因)啟動子區(qū)域的rs17525495位點，在結核性腦膜炎中，TT基因型患者未經地塞米松抗炎治療，其死亡率高于CC基因型；而經過地塞米松治療后，TT基因型的患者死亡率反而最低。這些研究進一步提示我們，宿主基因多態(tài)性不僅與疾病的易感性相關，而且影響藥物的應答反應，進而影響疾病的臨床轉歸。

熒光素酶報告系統(tǒng)是通過雙熒光素酶基因表達的轉錄調控來研究培養(yǎng)細胞的生物學特性。將不同的ALOX-12基因的SNP與啟動子分別插入到帶有螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因PGL3-Basic載體中，兩種基因分別轉染到狀態(tài)良好的Hela細胞，利用目的基因表達時熒光素酶基因也同時表達的作用，分別利用螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶相應的不同底物反應產生熒光，通過檢測熒光強度反應反映出不同SNP對ALOX-12基因啟動子活性的影響。本研究所取得的成果將深入地揭示宿主ALOX-12基因遺傳易感性在結核病發(fā)生發(fā)展中的作用，為結核病易感人群的預防干預決策及結核病基因型特異性個體化治療提供理論依據。

資料和方法

一、材料

實驗標本：取人血液樣本2 ml提取全基因組DNA，通過紫外分光光度計測定DNA濃度均≥50 ng/μl，NanoDrop DNA測定儀(美國Thermo Fisher公司)測定DNA純度[吸光度(A)260/280比值(指260 nm和280 nm下吸光度比值)]。

二、試劑

(1)全血DNA抽提試劑盒 QIAamp DNA Blood Mini kit購自Qiagen 公司；(2)雙熒光素酶檢測試劑盒Dual-Glo?luciferase assay system購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；(3)內切酶、T4連接酶、PCR反應試劑購自Takara公司；(4)細胞轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；(5)StarMut多點基因定點突變試劑盒(StarMut Site-directed Mutagenesis Kit)購自安捷倫生物技術有限公司；(6)熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic和Hela細胞系由本實驗室保存。

三、方法

1.不同SNP位點雙熒光素表達質粒的構建：根據ALOX-12基因啟動子基因片段設計PCR引物，以前期提取的基因組DNA為模板進行擴增，酶切回收的ALOX-12基因啟動子片段與pGL3-Basic質粒進行連接，構建pGL3-Basic-rs3840880G表達質粒，將此表達質粒進行定點突變得到pGL3-Basic-rs3840880DEL表達質粒，并測序驗證。

2.將質粒轉染到Hela細胞中：提前24 h用無抗生素DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium)+10%胎牛血清(FBS)鋪板六孔板Hela細胞，2 ml/孔。確保細胞密度達到80%～90%融合度；按照每種質粒做2個復孔，2個空白對照要求，每孔(下同)用500 μl 無血清培養(yǎng)基稀釋2 μg 表達質粒；500 μl 無血清培養(yǎng)基稀釋10 μl 脂質體2000；5 min后，將DNA溶液和脂質體溶液混合，室溫靜置20 min；從6孔板中吸出1 ml無血清培養(yǎng)基，然后滴加入1 ml質粒和脂質體混合物；6～10 h后，移除含有DNA-脂質體復合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED+10%FBS(從此刻開始算時間)，24 h 后進行熒光檢測。

3.雙熒光素表達系統(tǒng)檢測:根據Dual-Glo?luciferase assay system試劑盒要求，將檢測試劑配制好，按照如下步驟操作檢測熒光；從恒溫孵箱中取出培養(yǎng)有Hela細胞的六孔板。為獲取最佳結果，在進行第2步前將Dual-Glo?luciferase reagent(熒光素酶試劑)加入板中；將轉染后的Hela細胞消化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗打勻、混勻。分別取75 μl 加入到已經加入Dual-Glo?luciferase reagent的對應的白板孔中；靜置15 min，讓細胞充分裂解，然后在熒光發(fā)光儀中測量熒光值。

結 果

一、ALOX-12基因啟動子片段擴增

根據實驗需求，提取人類基因組DNA，使用ALOX-12基因啟動子引物對其進行PCR擴增，使用1%(W/V)瓊脂糖凝膠進行PCR產物鑒定，與預期結果相符(圖1)。

圖1 1～6為ALOX-12基因各引物組合的PCR擴增產物；最終選取3、4目的條帶約1700 bp進行切膠回收

二、ALOX-12基因啟動子片段與pGL3-Basic質粒的連接克隆

用 NcoⅠ和XhoⅠ內切酶對片段和載體進行酶切，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳?；厥?700 bp目的基因片段，并將其與酶切回收后的pGL3-Basic質粒進行連接后得到pGL3-rs3840880G質粒；菌液PCR和測序鑒定見圖2，3。

圖2 目的片段約1700 bp，菌液PCR鑒定TA克隆結果，將陽性克隆測序

圖3 陽性克隆測序圖譜，箭頭所指為rs3840880位點等位基因G

三、定點突變結果

使用StarMut Site-directed Mutagenesis Kit 基因定點突變試劑盒，將選取標本在rs3840880位點的G定點突變?yōu)镈放散型(DEL)。采用甲基化的質粒DNA為模板，使用人工合成含有目的突變堿基的引物進行擴增反應，然后用DpnI限制性內切酶消化不含突變的質粒模板，得到pGL3-rs3840880DEL質粒，轉化后篩選陽性克隆并測序驗證, 與預期結果相符(圖4)。

圖4 陽性克隆測序圖譜，箭頭所指為rs3840880位點定點突變結果為等位基因DEL

四、雙熒光素表達系統(tǒng)結果

使用Dual-Glo?luciferase assay system試劑盒，根據熒光信號強度檢測轉染后的Hela細胞中pGL3-Basic質粒表達的情況。將轉染有突變后基因的Hela細胞和轉染有未突變基因的Hela細胞與空白對照組的Hela細胞消化后，用PBS清洗打勻，分別取75 μl加入到已經加入Dual-Glo?luciferase reagent的對應的白板孔中混勻，15 min后螢火蟲熒光素酶催化相應底物產生熒光(R)。隨后加入海腎熒光素酶底物，檢測熒光值(F)，筆者取2次熒光比值(F/R)作為基因表達的參考(圖5)，以海腎熒光作為內參來校正細胞狀態(tài)、檢測環(huán)境等對結果測定的影響。由圖5看出，ALOX-12基因不同功能的SNP對啟動子活性的影響明顯不同，pGL3-Basic質粒F/R=0.129，pGL3-rs3840880DEL質粒F/R=0.194，pGL3-rs3840880DEL質粒F/R=0.274，采用單因素方差分析，F(xiàn)=25.09，P=0.001，差異有統(tǒng)計學意義。

圖5 Basic為轉染空載體的熒光檢測結果；Allel DEL與Allel G分別為轉染pGL3-rs3840880DEL和pGL3-rs3840880G質粒的熒光檢測結果

討 論

花生四烯酸是廣泛存在細胞膜磷脂雙分子層中的不飽和脂肪酸，當細胞受到不同生長因子、細胞因子等生理性或者病理性的刺激后，在磷脂酶A2的作用下花生四烯酸變?yōu)橛坞x狀態(tài)并在環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)、LOX的催化下生成相應的代謝產物。LOX家族的成員眾多并且催化AA為炎癥介質白細胞三烯(leukotriene，LTs)和HETE[7]。LOX基因亞型具有物種和組織特異性，除了在血小板內能直接催化AA產生12-HETE以外，ALOX-12還可以催化中性粒細胞代謝產生脂氧素[8]。結核保護性免疫的產生既受宿主因素的調節(jié)，反映在不同個體在發(fā)生結核分枝桿菌感染后的免疫應答反應明顯不同，而在不同人群中對卡介苗的免疫保護效果也明顯不同；同樣，保護性免疫也受感染的結核分枝桿菌的影響，反映在不同毒力的菌株和用不同的細菌量誘導產生的免疫應答反應不同。目前，與結核病密切相關基因的SNP的研究主要包括：模式識別受體類分子、干擾素家族及其相關基因、促炎細胞因子、抑炎細胞因子、趨化因子家族等五類，其中對于SNP趨化因子家族的研究與本研究有著密切的關系[9]。

本研究所針對的ALOX-12基因功能性SNPs位點rs3840880采用病例-對照策略發(fā)現(xiàn)。通過定點突變，筆者獲得了帶有rs3840880位點不同等位基因的熒光素表達載體，在前期統(tǒng)計學的基礎上研究功能性SNPs調控宿主的結核病易感機制。雙熒光素表達系統(tǒng)能反映出ALOX-12基因啟動子的表達情況，不但用熒光內參減少了細胞、操作環(huán)境變化對實驗結果的影響，而且使用熒光比值更清晰準確地對比出實驗結果的變化。本實驗所取得的成果將進一步地揭示結核病發(fā)生發(fā)展的精確分子和免疫機制，為結核病易感人群的預防干預決策及結核病基因型特異性個體化治療提供一定理論依據。但是，由于ALOX-12基因的組織特異性，并且結核病是受多種因素影響發(fā)病的一種感染性疾病，因此關于結核病更全面的發(fā)病研究與臨床治療方案有待進一步探索。

[1] 陳偉，夏愔愔，成詩明. 結核病疫情及對策. 中國防癆雜志，2012，34(9):611-613.

[2] Zumla A, Raviglione M, Hafner R, et al. Tuberculosis. N Engl J Med, 2013, 368(8):745-755.

[3] O’Garra A, Redford PS, McNab FW, et al. The immune response in tuberculosis. Annu Rev Immunol, 2013, 31:475-527.

[4] Yoshimoto T, Takahashi Y. Arachidonate 12-lipoxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2002, 68/69:245-262.

[5] Shen C, Wu XR, Wang BB, et al. ALOX5 is associated with tuberculosis in a subset of the pediatric population of North China. Genet Test Mol Biomarkers, 2013, 17(4):284-288.

[6] Tobin DM, Roca FJ, Oh SF, et al. Host genotype-specific therapies can optimize the inflammatory response to mycobacterial infections. Cell, 2012, 148(3):434-446.

[7] Xu R, Wang S, Li W, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ by a 12/15-lipoxygenase product of arachidonic acid: a possible neuroprotective effect in the brain after experimental intracerebral hemorrhage. J Neurosurg, 2016， 14:1-10. [Epub ahead of print].

[8] Pabst T, Kortz L, Fiedler GM, et al. The plasma lipidome in acute myeloid leukemia at diagnosis in relation to clinical disease features. BBA Clin, 2017, 7:105-114.

[9] Caws M, Thwaites G, Dunstan S, et al. The influence of host and bacterial genotype on the development of disseminated disease withMycobacteriumtuberculosis. PLoS Pathog, 2008, 4(3): e1000034.

(本文編輯：薛愛華)

Molecular mechanism of functional single nucleotide polymorphisms regulated tuberculosis susceptibility

ZHUXiu-yun,WANGWen-fei,ZHANGPei-ze,ZHANGJie-yun,QIUZhi-hui,WANGZhao-qin,ZHANGMing-xia,DENGGuo-fang.

LungDiseaseMedicalCenter,ThirdPeople’sHospitalofShenzhen,GuangdongKeyLaboratoryforEmergingInfectiousDisease,Shenzhen518112,China

DENGGuo-fang，Email：jxxk1035@yeah.net

Objective To construct different genotype dual luciferase expression plasmid expressed the rs3840880 loci of promoter region located in arachidonic acid lipoxidase-12 (ALOX-12) gene, and to analyze the effects of this single nucleotide polymorphisms (SNP) onALOX-12 gene promoter activity and gene expression, in order to elucidate the molecular mechanism of functional SNP regulated tuberculosis susceptibility. Methods The 1700 bp fragments contained rs2840880 loci of promoter region located inALOX-12 gene were amplified with human genome DNA extracted from whole blood samples by PCR. The pGL3-Basic-rs3840880 DEL plasmids was obtained from pGL3-Basic plasmid constructed with the PCR products and the original plasmid by site-directed mutagenesis and transfected into human cervical carcinoma cell line(Hela). The relative fluorescence values were detected by the dual luciferase assay system. Results The pGL3-Basic-DEL plasmid from pGL3-Basic-G plasmid containing the rs3840880 loci of promoter region located in theALOX-12 gene by site-directed mutagenesis was obtained and sequenced successfully. The relative fluorescence ratio (F/R) were detected after two plasmids were transfected into Hela cell line. The fluorescence ratio of allele G (F/R=0.194) was lower than that of allele DEL (F/R=0.274), pGL3-Basic (F/R=0.129) with significant difference statistically (F=25.09，P=0.001). Conclusion The expression differences of fluorescence reporter gene in the plasmids constructed with different alleles and transfected into Hela cell line are significant statistically. It shows that functional SNP of ALOX-12 gene affect really the activity of promoter and regulate tuberculosis susceptibility.

Arachidonate 12-lipoxygenase； Polymorphism, single nucleotide； Fluorophotometry； Tuberculosis； Gene expression regulation, bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.004

國家自然科學基金(81500004)；廣東省自然科學基金(2015A030313692)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20160427152106244, JCYJ20160427153348709, JCYJ20150402111430658);深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目(201501029)

518112 深圳市第三人民醫(yī)院肺病醫(yī)學中心 廣東省新發(fā)傳染病診治重點實驗室

鄧國防，Email：jxxk1035@yeah.net

2017-06-19)