結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增多重PCR體系的建立與評(píng)估

李自慧 潘麗萍 孫琦 呂翎娜 杜博平 張洪靜 孫照剛 張宗德

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·論著·

結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增多重PCR體系的建立與評(píng)估

李自慧 潘麗萍 孫琦 呂翎娜 杜博平 張洪靜 孫照剛 張宗德

目的 建立結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因多重PCR反應(yīng)體系，評(píng)估該體系以臨床分離株DNA和痰菌DNA為模板擴(kuò)增耐藥相關(guān)基因的成功率。方法 常規(guī)提取結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(47株)及涂陽(yáng)肺結(jié)核患者(21例)痰菌DNA。根據(jù)目前研究已發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因合成引物，建立2個(gè)多重PCR體系以擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序證實(shí)后，計(jì)算該體系用于兩種樣本的擴(kuò)增成功率。結(jié)果 針對(duì)臨床常用8種抗結(jié)核藥物，選取結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs、eis共8個(gè)耐藥相關(guān)基因設(shè)計(jì)合成引物。建立2個(gè)多重PCR體系擴(kuò)增8個(gè)耐藥基因，該體系擴(kuò)增47株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株DNA和21例菌陽(yáng)肺結(jié)核患者痰菌DNA的成功率分別為100.0%(47/47)和76.2%(16/21)。結(jié)論 本研究建立了高效擴(kuò)增8個(gè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的多重PCR體系，結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研發(fā)結(jié)核病耐藥分子診斷產(chǎn)品具有重要意義。

結(jié)核, 抗多種藥物性； 聚合酶鏈反應(yīng)； 基因測(cè)定； 核酸擴(kuò)增技術(shù)； 技術(shù)評(píng)估, 生物醫(yī)學(xué)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的傳染性疾病。近年來(lái)耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和傳播使得全球結(jié)核病的防控進(jìn)一步受到威脅。據(jù)估計(jì)全球約20%的結(jié)核分枝桿菌分離株至少耐一種主要的抗結(jié)核藥物[1]，更嚴(yán)重的是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)甚至全耐藥結(jié)核病(totally drug-resistant tuberculosis，TDR-TB)的出現(xiàn)和增多，使得患者病程延長(zhǎng)，死亡風(fēng)險(xiǎn)增高，一旦治療失敗會(huì)導(dǎo)致耐藥結(jié)核分枝桿菌的長(zhǎng)期傳染。我國(guó)不僅是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，耐藥結(jié)核病疫情也十分嚴(yán)峻。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)新發(fā)和復(fù)發(fā)結(jié)核病患者中MDR-TB分別占5.7%和25.6%，其中約8.0%為XDR-TB患者，均高于全球平均水平[2-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變(包括藥物作用靶標(biāo)基因、修飾或分解藥物的酶類(lèi)基因等)、藥物外排泵、藥代動(dòng)力學(xué)差異(包括藥物代謝快慢、不同病變組織藥物滲透力等)均有可能導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，其中耐藥基因突變是導(dǎo)致結(jié)核病耐藥的一個(gè)重要原因。例如：約95%的利福平耐藥菌株rpoB基因發(fā)生突變，50%～95%的異煙肼耐藥菌株katG基因發(fā)生突變[4]。近年來(lái)應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)也發(fā)現(xiàn)了大量可能與耐藥相關(guān)的基因位點(diǎn)[5-7]。在耐藥檢測(cè)方面，基于細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)需要2～3個(gè)月才能得到結(jié)果，而基于分子生物學(xué)技術(shù)的耐藥基因突變檢測(cè)技術(shù)可以快速檢出耐藥基因，指導(dǎo)臨床及時(shí)選擇有效藥物，盡早治療和控制耐藥結(jié)核病。

目前，可用的耐藥結(jié)核病分子檢測(cè)方法仍十分缺乏，世界衛(wèi)生組織推薦使用Xpert MTB/RIF檢測(cè)和線性探針檢測(cè)(line probe assay，LPA)技術(shù)。前者是由美國(guó)賽沛(Cepheid)公司研發(fā)、基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的技術(shù)，能快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)利福平耐藥，其主要缺點(diǎn)是費(fèi)用十分昂貴，無(wú)法普及推廣[8]。LPA主要基于PCR擴(kuò)增和反向雜交技術(shù)，其代表產(chǎn)品GenoType MTBDRplus可以檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥，GenoType MTBDRsl可以檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物及二線注射類(lèi)抗結(jié)核藥物耐藥，但目前總體價(jià)格昂貴，需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，敏感度也略欠缺[9-11]。PCR技術(shù)目前仍然是分子檢測(cè)的基礎(chǔ)，但單一PCR反應(yīng)每次只能擴(kuò)增1個(gè)基因，實(shí)際工作要完成多樣本的多個(gè)耐藥基因檢測(cè)，工作量巨大。多重PCR(multiplex PCR)通過(guò)在同一反應(yīng)體系里加入一對(duì)以上的引物，可以在同一反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)核酸片段的擴(kuò)增，在提高通量、保持高特異度和高敏感度的同時(shí)，能大大降低成本、節(jié)省樣本，更加簡(jiǎn)單、快速和高效。本研究擬針對(duì)目前比較明確的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，建立多重PCR反應(yīng)體系，并評(píng)估其擴(kuò)增臨床分離株DNA及痰菌DNA的成功率，為進(jìn)一步研發(fā)結(jié)核病耐藥基因檢測(cè)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1. 菌株及痰標(biāo)本來(lái)源：收集結(jié)核分枝桿菌臨床分離株47株，以及菌陽(yáng)肺結(jié)核患者痰樣本21例，所有樣本來(lái)源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院。

2. 臨床分離株DNA的提取：用TE緩沖液[pH=8.0，含三羥甲基氨基甲烷(Tris)-Cl 0.1 mol/L，乙二胺四乙酸(EDTA) 0.5 mol/L]重懸細(xì)菌，加入溶菌酶至5 mg/ml，37 ℃過(guò)夜振蕩消化，加入蛋白酶K至終濃度為1 mg/ml，加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為1%，37 ℃振蕩1 h。用DNA小量提取試劑盒(51304，Qiagen公司)按操作說(shuō)明提取菌株DNA，溶解于適量無(wú)菌去離子水，用NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo Scientific)進(jìn)行定量檢測(cè)后，貯存于-20 ℃。

3. 痰菌DNA的提?。涸谏锇踩裰袑?duì)痰標(biāo)本常規(guī)采用N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉液化，取500 μl液體離心收集沉淀，用TE緩沖液洗一遍，重懸后加入玻璃珠，室溫劇烈渦旋，然后95 ℃熱滅活20 min，離心取上清，加1/10體積氯化鈉和2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA，最后離心收集沉淀，用70%乙醇洗一遍，將DNA重新溶解于20 μl TE緩沖液，貯存于-20 ℃。

4. 耐藥相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)及合成：參考文獻(xiàn)[12]，同時(shí)采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成。

5. PCR擴(kuò)增及測(cè)序：PCR擴(kuò)增采用的水生棲熱菌(thermus aquaticus，Taq)酶購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(CW0654A)，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司(CD111-02)。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成PCR產(chǎn)物的雙向測(cè)序。

6. 主要儀器：生物安全柜(NU-425-300E，美國(guó)Nuaire公司)、基因擴(kuò)增儀(My Cycler，美國(guó)Bio-rad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR，美國(guó)Bio-rad公司)、核酸分析儀(Nanodrop2000，美國(guó)Thermo公司)。

結(jié) 果

1. 耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增所用引物序列：本研究選取目前發(fā)現(xiàn)的8個(gè)結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因序列，分別為rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs和eis，設(shè)計(jì)合成的引物序列見(jiàn)表1。

表1 結(jié)核分枝桿菌耐藥基因擴(kuò)增引物序列

注 F為上游引物；R為下游引物

2. 耐藥基因擴(kuò)增多重PCR體系的建立：本研究根據(jù)不同耐藥基因擴(kuò)增片段大小，嘗試不同組合和擴(kuò)增體系，最終通過(guò)優(yōu)化可以實(shí)現(xiàn)利用2個(gè)多重PCR體系擴(kuò)增8個(gè)耐藥基因，擴(kuò)增體系見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，8個(gè)條帶對(duì)應(yīng)基因大小與預(yù)期一致(圖1)。

3. 測(cè)序結(jié)果：將8個(gè)條帶切膠測(cè)序，測(cè)序序列與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv相應(yīng)基因逐一進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證明擴(kuò)增序列是預(yù)期的8個(gè)耐藥基因序列。以katG基因測(cè)序結(jié)果為例，比對(duì)結(jié)果證明擴(kuò)增條帶為katG基因，并且該菌株在第1355堿基位置由堿基T突變?yōu)镃(圖2)。

表2 結(jié)核分枝桿菌耐藥基因擴(kuò)增多重PCR體系

注 管A包含5對(duì)基因引物：embB、katG、rrs、rpoB和inhA；管B包含3對(duì)基因引物：eis、gyrA和rpsL。a：指管A中5條上游引物各0.8 μl；b：指管A中5條下游引物各0.8 μl；c：指管B中3條上游引物各0.8 μl；d：指管B中3條下游引物各0.8 μl

1～4為4個(gè)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株DNA樣本；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶從大至小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp。A圖為A管擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，5個(gè)條帶從大到小分別為embB、katG、rrs、rpoB和inhA；B圖為B管擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，3個(gè)條帶從大到小分別為eis、gyrA和rpsL圖1 PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

4. 多重PCR體系擴(kuò)增臨床分離株DNA的成功率：提取47株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株DNA，以菌株DNA為模板，采用已建立的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果47株的8個(gè)條帶全部成功擴(kuò)增(圖3)，擴(kuò)增成功率為100.0%。

5. 多重PCR體系擴(kuò)增痰菌DNA的成功率：提取21例痰涂片染色陽(yáng)性的患者痰菌DNA，以其為模板，采用已建立的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果有16例痰樣本提取的DNA 8個(gè)條帶全部成功擴(kuò)增(圖4)，擴(kuò)增成功率為76.2%。另外3例痰樣本提取的DNA僅擴(kuò)增出了部分條帶，2例痰樣本提取的DNA無(wú)任何條帶擴(kuò)增。

圖2 katG基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與基因序列比對(duì)結(jié)果

1～47為結(jié)核分枝桿菌臨床分離株DNA樣本；A代表A管，包含5對(duì)基因擴(kuò)增引物(embB、katG、rrs、rpoB和inhA)；B代表B管，包含3對(duì)基因擴(kuò)增引物(eis、gyrA和rpsL)； M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶從大至小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp；(-)為陰性對(duì)照?qǐng)D3 以臨床分離株DNA為模板的PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

1～21為痰樣本提取的DNA；A代表A管，包含5對(duì)基因擴(kuò)增引物(embB、katG、rrs、rpoB和inhA)；B代表B管，包含3對(duì)基因擴(kuò)增引物(eis、gyrA和rpsL)；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶從大至小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp；(-)為陰性對(duì)照?qǐng)D4 以痰菌DNA為模板的PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

討 論

本研究針對(duì)目前結(jié)核病治療最常用的一線口服抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺)、注射類(lèi)抗結(jié)核藥物(鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)和氟喹諾酮類(lèi)藥物，檢索文獻(xiàn)、選取較確切的8個(gè)耐藥基因，合成引物，擴(kuò)增包含常見(jiàn)突變位點(diǎn)的基因片段。其中rpoB基因涉及利福平耐藥，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段包含1123～1531區(qū)域內(nèi)突變位點(diǎn)；katG基因和inhA啟動(dòng)子區(qū)涉及異煙肼耐藥。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段包含katG基因438～1072區(qū)域和mabA-inhA啟動(dòng)子區(qū)常見(jiàn)突變位點(diǎn)，但inhA結(jié)構(gòu)基因本身突變涉及異煙肼耐藥所占比例較少[13-14]，本研究暫不考慮；embB基因涉及乙胺丁醇耐藥，擴(kuò)增片段包含852～1962區(qū)域內(nèi)突變位點(diǎn)；rpsL基因涉及鏈霉素耐藥，擴(kuò)增片段包含目前發(fā)現(xiàn)的全部突變位點(diǎn)。rrs基因涉及鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素耐藥，擴(kuò)增片段包含1158位點(diǎn)后的所有突變位點(diǎn)；eis基因涉及卡那霉素耐藥，擴(kuò)增片段包含該基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)突變位點(diǎn)；gyrA基因涉及氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥，擴(kuò)增片段包含-29～394區(qū)域內(nèi)突變位點(diǎn)。另外，pncA基因突變是吡嗪酰胺耐藥的主要機(jī)制(約85%吡嗪酰胺耐藥菌株存在pncA突變)，但其突變位點(diǎn)繁多且分散，幾乎涵蓋整個(gè)基因，有的表型耐藥和基因型耐藥存在不一致[4,15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，ahpC啟動(dòng)子區(qū)涉及異煙肼耐藥，但也有研究認(rèn)為其更像是因過(guò)氧化氫酶和(或)過(guò)氧化物酶活性缺失而引起的補(bǔ)償性突變，并不是引起異煙肼耐藥的原因[18]。本研究暫不納入這些基因。具體耐藥基因突變位點(diǎn)可參見(jiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站https://tbdreamdb.ki.se/Info/。

筆者采用2個(gè)多重PCR體系擴(kuò)增8個(gè)包含常見(jiàn)突變位點(diǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，以臨床分離株提取的DNA為模板時(shí)成功率為100.0%，以肺結(jié)核患者痰樣本提取的DNA為模板時(shí)成功率為76.2%。分析后者成功率低的原因，第一有可能是痰樣本提取的結(jié)核分枝桿菌DNA含量相對(duì)較少，以宿主DNA為主，對(duì)擴(kuò)增過(guò)程有干擾；更主要的原因可能是痰樣本含菌量不同，提取出的細(xì)菌DNA含量存在差異，含量低的樣本有可能擴(kuò)增陰性。盡管本研究提取的痰樣本均來(lái)自于痰涂片抗酸染色陽(yáng)性的患者，但可能因?yàn)樘狄吼こ怼⒓?xì)菌在痰液中分布不均，部分提取的痰液含菌量較少，使得擴(kuò)增未能成功。因此，采取措施提高痰菌量，如1例患者提取多個(gè)痰樣本DNA，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化痰樣本結(jié)核分枝桿菌DNA的提取方法，如優(yōu)化裂解液，增加研磨時(shí)間，以提高破菌效率、提高細(xì)菌DNA含量，均有可能會(huì)大大提高多重PCR擴(kuò)增的成功率。

另外，雖然多重PCR能夠同時(shí)擴(kuò)增目的基因的數(shù)量在理論上沒(méi)有限制，但實(shí)踐中常常因?yàn)槎鄬?duì)引物同時(shí)存在，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增效率不同、擴(kuò)增結(jié)果判讀困難等原因而受到限制。因而在設(shè)計(jì)引物時(shí)要綜合考慮引物的特異性、長(zhǎng)度、退火溫度等因素，并通過(guò)調(diào)整鎂離子濃度、引物濃度等優(yōu)化反應(yīng)體系，以最終獲得靶基因片段的有效擴(kuò)增[19]。本研究也曾嘗試將8對(duì)引物放在1個(gè)多重PCR體系擴(kuò)增，但干擾明顯，多數(shù)樣本無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)所有目的基因的有效擴(kuò)增，還需進(jìn)一步調(diào)整和優(yōu)化。

總之，本研究成功實(shí)現(xiàn)了利用2個(gè)多重PCR體系擴(kuò)增8個(gè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，擴(kuò)增基因包含常見(jiàn)的耐藥突變位點(diǎn)，研究結(jié)果可為進(jìn)一步應(yīng)用測(cè)序、芯片雜交等技術(shù)確定突變形式奠定基礎(chǔ)，這對(duì)研發(fā)相關(guān)診斷產(chǎn)品，快速預(yù)測(cè)耐藥類(lèi)型、正確選擇抗結(jié)核藥物進(jìn)行治療、控制耐藥結(jié)核病疫情具有重要意義。

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(本文編輯：薛愛(ài)華)

Establishment and evaluation of the multiplex PCR systems for amplifyingMycobacteriumtuberculosisgenes involved in drug resistance

LIZi-hui,PANLi-ping,SUNQi,LYüLing-na,DUBo-ping,ZHANGHong-jing,SUNZhao-gang,ZHANGZong-de.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,BeijingKeyLaboratoryforDrugResistantTuberculosisResearch,Beijing101149,China

ZHANGZong-de,Email:zzd417@163.com；SUNZhao-gang，Email：sunzg75@163.com

Objective To establish multiplex PCR systems for amplifyingMycobacteriumtuberculosisgenes involved in drug resistance and evaluate the success rates of amplification using DNA templates from clinical isolates and sputum samples of pulmonary tuberculosis patients. Methods DNA was routinely extracted from 47M.tuberculosisclinical isolates and 21 sputum samples of smear positive pulmonary tuberculosis patients. Primers for amplifying genes involved in drug resistance were designed and synthesized, and 2 multiplex PCR systems were established. The amplified fragments were confirmed by sequencing, and the success rates of amplification by multiplex PCR were analyzed. Results We selected 8 gene sequences includingrpoB,katG,inhA,embB,gyrA,rpsL,rrsandeis, which were involved in resistance to 8 commonly used anti-tuberculosis drugs. Two multiplex PCR systems were established to amplify 8 sequences, and the success rates of amplification were 100.0% (47/47) for DNA from 47 clinical isolates and 76.2% (16/21) for DNA from 21 sputum samples of smear positive pulmonary tuberculosis patients. Conclusion Two multiplex PCR systems are established for amplifying eightM.tuberculosisgene sequences involved in resistance to anti-tuberculosis drugs used in clinical practice. The result has important value for developing new genotypic tests to diagnose drug-resistant tuberculosis.

Tuberculosis, multidrug-resistant； Polymerase chain reaction； Genetic testing； Nucleic acid amplification techniques； Technology assessment, biomedical

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.002

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2015ZX10004801-003)；重大傳染病防治協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(PXM2016_014226_000052)；北京市自然科學(xué)基金(7164245)；北京市科技新星計(jì)劃(Z161100004916080)；北京市醫(yī)院管理局“青苗”計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)(QML20151501)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

張宗德，Email：zzd417@163.com；孫照剛，Email：sunzg75@163.com

2017-06-30)