大鼠腦β—淀粉樣蛋白表達(dá)及神經(jīng)行為學(xué)與高膽固醇水平的關(guān)系

梁倩++++++唐偉++++++劉文博++++++王威

[摘要] 目的 研究大鼠腦β-淀粉樣蛋白表達(dá)及神經(jīng)行為學(xué)與高膽固醇水平的關(guān)系，以明確辛伐他汀對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）防治有一定作用。 方法 將32只健康Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為普通組和高脂組，每組16只。飼養(yǎng)2周后，再將普通組隨機(jī)分為普通藥物組和普通安慰劑組，每組8只；將高脂組大鼠隨機(jī)分為高脂藥物組、高脂安慰劑組，每組8只。藥物組16只大鼠給予辛伐他汀灌胃，安慰劑組給同體積安慰劑（蒸餾水）灌胃。免疫組織化學(xué)法測(cè)定腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白（Aβ）蛋白的表達(dá)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。 結(jié)果 高脂藥物組大鼠前額皮層Aβ1-42的蛋白表達(dá)較高脂安慰劑組減少（P < 0.05）；高脂藥物組與普通安慰劑組、普通藥物組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與高脂安慰劑組比較，高脂藥物組大鼠逃避潛伏期縮短（P < 0.05），穿臺(tái)次數(shù)增多（P < 0.05）；高脂藥物組與普通安慰劑組、普通藥物組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 辛伐他汀對(duì)高膽固醇血癥大鼠前額皮層Aβ1-42的蛋白表達(dá)有一定影響，同時(shí)伴隨大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變。

[關(guān)鍵詞] 高膽固醇；辛伐他?。沪?淀粉樣蛋白；神經(jīng)行為學(xué)

[中圖分類號(hào)] R74 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（a）-0024-04

The relationship between the expression of brain amyloid beta protein along with neural behavior in rats with hypercholesterolemia level

LIANG Qian1 TANG Wei2 LIU Wenbo1 WANG Wei1

1.Department of Neurology， Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116001， China； 2.Department of Neurology， Affiliated Xinhua Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116021，China

[Abstract] Objective To research the relationship between the expression of brain amyloid beta （Aβ） protein along with neural behavior in rats with hypercholesterolemia level， in order to clarify the preventive effect of simvastatin on Alzheimer's disease. Methods The 32 Wistar rats were divided into normal group and high cholesterol group according to random number table， with 16 rats in each group. After two weeks， the rats in the normal group were randomly divided into normal drug group and normal placebo group， with 8 rats in each group； and the rats in the high cholesterol group were randomly divided into high fat drug group and high fat placebo group， with 8 rats in each group. And then simvastatin were filled into the stomach of the 16 drug group rats， the same volume placebo （distilled water） were filled into the stomach of placebo group. Immunohistochemical method was used to determine the expression of Aβ protein in brain， Morris water maze was used to test the cognitive and memory abilities in rats. Results Aβ1-42 protein expression of the prefrontal cortex in the high fat drug group was less than that of high fat placebo group （P < 0.05）； and there was no significant difference in the high fat drug group， normal placebo group and normal drug group （P > 0.05）. In the high fat drug group， the escape latency was decreased than that of high fat placebo group （P < 0.05）， times of crossing platform was increased （P < 0.05）； and there was no significant difference in the high fat drug group， normal placebo group and normal drug group （P > 0.05）. Conclusion Simvastatin has some effects on the expression of Aβ1-42 protein in prefrontal cortex of hypercholesterolemic rats， and accompanied by neurobehavioral changes in rats.

[Key words] High cholesterol； Simvastatin； Beta amyloid protein； Neural behavior

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知功能障礙，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，全世界至少有2000～3000萬(wàn)AD患者[1]。雖然近年來(lái)AD的研究取得較大的進(jìn)展，但AD的病因迄今未明，目前對(duì)AD的治療沒(méi)有明確有效的措施。AD的危險(xiǎn)因素除了遺傳，年齡增長(zhǎng)，載脂蛋白E基因型以外，糖尿病，高熱量的飲食，血脂異常及吸煙與AD的發(fā)生有一定關(guān)系[2]。AD的主要病理改變是老年斑的形成，神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及廣泛神經(jīng)元缺失。老年斑的核心是β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ），研究表明血脂代謝異?？捎绊慉β的表達(dá)[3-4]。目前研究已經(jīng)證實(shí)，AD的發(fā)生率與血清膽固醇水平明確相關(guān)，他汀除降脂作用外，還能減少Aβ的生成，減少載脂蛋白E分泌，促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)，防治癡呆[5-6]。

本研究采用他汀類藥物干預(yù)血脂水平，觀察治療后大鼠腦Aβ表達(dá)及神經(jīng)行為學(xué)變化，以研究他汀在改善認(rèn)知功能方面的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康Wistar大鼠32只，體重為150～170 g，SPF級(jí)，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK2015-0002。高膽固醇飼料（膽酸鈉0.3%、膽固醇1%、豬油10%和普通鼠飼料88.7%）由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，辛伐他?。ň┍厥嫘?0 mg/片）由浙江京新藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)分組

將32只Wistar大鼠（14周齡）按隨機(jī)數(shù)字表法分為高脂組，普通組，每組16只。高脂組給予高脂飼料喂養(yǎng)，普通組給予普通飼料喂養(yǎng)，兩組大鼠均喂養(yǎng)2周；再次分組，高脂組隨機(jī)分為高脂藥物組和高脂安慰劑組，每組8只，同樣將普通組也隨機(jī)分為普通藥物組和普通安慰劑組，每組8只。其中16只藥物組大鼠給予辛伐他汀灌胃，每天每公斤體重給予2 mg，16只安慰劑組大鼠給予同體積蒸餾水灌胃。8周后取尾血，測(cè)定血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，進(jìn)行神經(jīng)行為測(cè)試并取材。

1.3 空間學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練

定位航行實(shí)驗(yàn)：對(duì)大鼠學(xué)習(xí)能力檢測(cè)，每天訓(xùn)練兩次，上午1 min，下午1 min。將水迷宮的水池根據(jù)東南西北等分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第四象限，距離池壁20 cm，平臺(tái)直徑為6 cm、高25 cm，水位超過(guò)平臺(tái)1 cm。試驗(yàn)前，讓小鼠自由游泳熟悉迷宮環(huán)境。試驗(yàn)時(shí)，在第四象限放置平臺(tái)，其他三個(gè)象限作為大鼠的入水象限，將大鼠頭面向池壁，象限1/2弧度處放入水中，記錄1 min內(nèi)大鼠到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間，稱為逃避潛伏期，如果大鼠1 min內(nèi)沒(méi)有爬上平臺(tái)，測(cè)試人員可引導(dǎo)其上臺(tái)，上臺(tái)后大鼠需在平臺(tái)站立適應(yīng)10 s，1 min后進(jìn)行下一次訓(xùn)練，潛伏期記錄為1 min。一共訓(xùn)練5 d，將第5天的軌跡作為其學(xué)習(xí)成績(jī)。

空間探索實(shí)驗(yàn)：對(duì)大鼠記憶能力檢測(cè)，在第6天將平臺(tái)撤去，與訓(xùn)練時(shí)一樣將大鼠放入水中，讓其在水中待1 min，圖像采集大鼠的運(yùn)動(dòng)，記錄1 min內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡和穿越原有平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4 取材固定

Morris水迷宮試驗(yàn)后次日，使用4%水合氯醛（10 mL/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，打開胸腔暴露心臟，將穿刺針進(jìn)入左心室找至主動(dòng)脈，剪開右心耳，先灌注100 mL生理鹽水，之后緩慢灌注120 mL 4%多聚甲醛固定，直至大鼠四肢及尾部僵硬為灌流固定充分，然后斷頭取腦組織，將其投入到4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化標(biāo)本制備。

1.5 免疫組化檢測(cè)小鼠Aβ1-42表達(dá)水平

石蠟切片置60℃烤箱烘烤2 h；常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗2 min；微波修復(fù)抗原20 min；3% H2O2溶液阻斷過(guò)氧化物酶，10 min；PBS洗10 min×3次；滴加Aβ1-42（1∶100），4℃過(guò)夜；于冰箱中取出切片后室溫靜止20 min，PBS洗10 min×3次；加二抗，37℃孵育50 min，PBS洗10 min ×3次；DAB顯色2～3 min；復(fù)染、透明后封片，顯微鏡下觀察。Aβ1-42的免疫陽(yáng)性表現(xiàn)為神經(jīng)元的胞漿、神經(jīng)纖維處可見棕黃色顆粒樣著色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠血脂比較

高脂藥物組大鼠血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、膽固醇（CHO）水平較高脂安慰劑組大鼠明顯降低（P < 0.05），而高脂藥物組、普通安慰劑組和普通藥物組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 四組大鼠前額皮質(zhì)Aβ1-42的蛋白表達(dá)比較

與高脂安慰劑組比較，高脂藥物組蛋白表達(dá)減少（P < 0.05）；而高脂藥物組、普通安慰劑組和普通藥物組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)果見表2、圖1（封三）。

2.3 四組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與高脂安慰劑組比較，高脂藥物組大鼠逃避潛伏期縮短，穿臺(tái)次數(shù)增多（P < 0.05）；而高脂藥物組、普通安慰劑組和普通藥物組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)果見表3、圖2。

3 討論

AD是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，特點(diǎn)為持續(xù)進(jìn)行性的智能減退而無(wú)緩解，隨著我國(guó)人口的老齡化，AD儼然已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，因此，AD的治療日益引起人們的關(guān)注[7]。

目前通過(guò)流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)生和演變與日常生活行為有密切關(guān)系。良好的生活習(xí)慣，比如低鹽、低脂、低糖飲食，長(zhǎng)期規(guī)律的鍛煉，保持良好睡眠等，都可以延緩AD的進(jìn)程[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂、高熱量飲食的國(guó)家AD發(fā)病率較低脂、低熱量的國(guó)家高，原因認(rèn)為與高脂肪、高熱量可破壞神經(jīng)元樹突的完整性，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的增生，增加機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)，影響腦組織血液循環(huán)，引起認(rèn)知功能的下降[10-11]。細(xì)胞外老年斑的形成是AD的一個(gè)主要病理特征，而Aβ是老年斑的主要組成成分，Aβ由可溶狀態(tài)變?yōu)椴豢扇軤顟B(tài)，形成沉淀，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的連串反應(yīng)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，引起AD的發(fā)生發(fā)展[12]。研究發(fā)現(xiàn)血液中膽固醇每增加10%，腦中Aβ斑塊就會(huì)增加一倍[13]，而且研究還發(fā)現(xiàn)高水平的膽固醇可直接影響β淀粉樣蛋白前體的表達(dá)，導(dǎo)致β淀粉樣蛋白的大量生成和沉積，促進(jìn)AD的發(fā)生與發(fā)展，而改用普通飲食可以減少Aβ的生成[14-18]。這些促使設(shè)想能否通過(guò)改變患者的血脂負(fù)荷及構(gòu)成，或通過(guò)改變微血管的內(nèi)皮功能，降低膽固醇，從而減少Aβ的形成，延緩AD的發(fā)生和進(jìn)程。他汀類藥物在改善膽固醇代謝，降低血清中膽固醇含量在臨床中已經(jīng)取得令人滿意的效果[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)服用他汀類藥物的人AD發(fā)病率降低70%，這一結(jié)果為膽固醇代謝異常導(dǎo)致AD提供了一個(gè)非常有力的證據(jù)。進(jìn)一步研究他汀類藥物與AD的關(guān)系，將為AD的防治開辟了新的途徑。

記憶、學(xué)習(xí)能力減退是AD患者早期且比較突出的表現(xiàn)，對(duì)于大鼠相關(guān)能力的檢測(cè)方法目前常用的有Y迷宮、Morris水迷宮、物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)等[21]。Morris水迷宮是目前國(guó)際上使用頻繁、有效的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：高脂藥物組逃避潛伏期較高脂安慰劑組縮短，穿臺(tái)次數(shù)增多（P < 0.05），說(shuō)明辛伐他汀能夠改善高膽固醇血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。通過(guò)免疫組化檢測(cè)Aβ1-42 的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證辛伐他汀對(duì)Aβ1-42表達(dá)的影響進(jìn)一步驗(yàn)證其機(jī)制。結(jié)果提示高脂藥物組大鼠前額皮層Aβ1-42的蛋白表達(dá)較高脂安慰劑組的蛋白表達(dá)明顯減少（P < 0.05）；而高脂藥物組、普通安慰劑組和普通藥物組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。這一結(jié)果提示辛伐他汀改善高脂血癥大鼠學(xué)習(xí)能力與Aβ1-42的表達(dá)明顯相關(guān)，降低Aβ1-42可能是用他汀類藥物治療AD的機(jī)制。

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（收稿日期：2016-12-17 本文編輯：李岳澤）