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    涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV感染檢測

    2017-08-02 09:44:43彭艷伶李昊余瓊李建張斌沈思思任玉鵬
    四川畜牧獸醫(yī) 2017年7期
    關鍵詞:涼山州病原豬場

    彭艷伶,李昊,余瓊,李建,張斌,沈思思,任玉鵬*

    (1.四川省西昌市農(nóng)牧局,四川 西昌 615000;2.西昌學院動物科學院,四川 西昌 615013;3.西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都 610041)

    涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV感染檢測

    彭艷伶1,李昊2,余瓊1,李建1,張斌3,沈思思3,任玉鵬3*

    (1.四川省西昌市農(nóng)牧局,四川 西昌 615000;2.西昌學院動物科學院,四川 西昌 615013;3.西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都 610041)

    為了解四川省涼山州部分豬場3種豬腹瀉病毒的感染情況,本研究采用RT-PCR方法,分別對來自德昌、冕寧縣和寧南縣多個規(guī)模化豬場的60份豬腹瀉樣本進行病原檢測,包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬Delta冠狀病毒(PDCoV)和豬A群輪狀病毒(GARV)。結果顯示:3種病原的檢出率分別為PEDV 15%、PDCoV 33.33%、GARV 58.33%,其中冕寧縣PDCoV檢出率為65%,而GARV檢出率更高達70%;3種病毒混合感染的情況普遍存在,總體混合感染率分別為:德昌15%(3/20),冕寧60%(12/20),寧南5%(1/20),混合感染類型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性。

    豬流行性腹瀉病毒;豬Delta冠狀病毒;豬A群輪狀病毒;RT-PCR

    豬腹瀉病是生豬養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一,在所有引起腹瀉的病毒性因素中,豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬A群輪狀病毒(GARV)是目前臨床上較為常見的兩種病原[1]。近年還出現(xiàn)諸多新發(fā)病原從豬腹瀉病料中檢出,如豬Delta冠狀病毒(PDCoV)就是一個導致豬腹瀉的冠狀病毒科新成員,主要引起仔豬腹瀉、脫水等[2]。

    四川省涼山州當前豬腹瀉疫情較嚴重,但近年關于病原感染情況尚未見報道,這一定程度上制約了疫病防控措施的制定。故本研究采用RT-PCR方法對2016年8~9月份采自涼山州德昌、冕寧、寧南縣三個地方的60份豬腹瀉樣本進行病原學檢測,以期為本地區(qū)腹瀉病的防控提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    1.1.1 試劑 Taq聚合酶、DNA Marker II均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T Simple Vector、PrimeScriptTMRT-PCR Lit(RNA反轉錄試劑盒)均購自寶生物工程(大連)有限公司;質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

    1.1.2 儀器 PCR 儀(Veriti 96 Well Thermal Cycle,ABI公司),凝膠成像儀(Universal Hood II,BIO-RAD公司),電泳儀(DYY-5型,北京六一儀器廠)。

    1.2 引物 本試驗中用于RT-PCR法檢測 PEDV、PDCoV和GARV的引物均參照文獻[1,3]合成,所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。具體參數(shù)見表1。

    表1 PEDV、TGEV、PDCoV、GARV 擴增引物

    1.3 樣本采集與處理 本試驗待檢樣本于2016年8~9月采自四川省涼山州,其中德昌縣3個規(guī)?;B(yǎng)殖場20份、冕寧縣2個規(guī)?;i場20份、寧南縣2個規(guī)?;i場20份,共計60份腹瀉樣本。所有樣本均來源于30~60日齡保育豬。將樣本與無菌0.1mol/L PBS緩沖液按 1∶4(m/v)比例稀釋,振蕩混勻,靜置5min,以10000r/min離心10min,取上清液待檢。

    1.4 cDNA模板制備 參照寶生物公司RNAiso Plus(總RNA提取試劑)說明書,提取樣本總RNA。依次加入上述上清液200μL、RNAiso Plus 500μL、氯仿150μL,振蕩混勻后離心取上清;然后加入等體積異丙醇,離心棄上清;再加入 75%乙醇1 mL(經(jīng)DEPC處理),離心棄上清;樣品自然干燥后加入45μL無RNA酶去離子水,溶解沉淀,置-40℃保存。

    根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。反應體系:樣本總 RNA 4μL,5×Buffer 4μL,Random primer 1 μL,PrimeScript RTase 1 μL,dH2O 10 μL,總體系20μL。反轉錄程序:37℃ 15min,85℃ 15s,16℃ 1min。反轉錄產(chǎn)物置-40℃保存。

    1.5 目的基因的PCR擴增 分別用檢測PEDV、PDCoV和GARV的3對引物,對待檢樣本中的cDNA模板進行PCR擴增。反應體系為:2×PCR Master Mix 12.5μL,上、下游引物各 1.0 μL,cDNA 2.0 μL,dH2O 8.5μL,總體積 25μL。PCR 擴增條件為:95℃預變性5 min,95℃ 30 s,55℃ 30 s,72 ℃ 55 s,35 個循環(huán),72℃ 10min。取上述擴增產(chǎn)物各5μL在瓊脂糖凝膠板上以100V恒壓電泳45min,通過凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結果。對目的基因進行回收、連接和轉化,使其克隆至pMD19-T載體,并送樣到上海英駿生物技術有限公司測序,用Blast比對分析結果。對不同來源樣本中的3種病毒病原的檢出率進行統(tǒng)計分析。

    圖1 3種病原的RT-PCR擴增結果

    2 結果

    2.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及測序 將待檢樣本cDNA的PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體,并送樣到上海英駿生物技術有限公司測序,經(jīng)Blast比對分析,結果表明:與NCBI上已登錄的序列相比,PEDV擴增片段同源性為99%,PDCoV擴增片段同源性為95%,GARV擴增片段同源性為92%。

    2.2 不同豬群的感染情況 在涼山州德昌、冕寧及寧南3個地區(qū)中,豬群中PEDV、PDCoV和GARV檢出率均為100%(3/3),3種病原總體檢出率分別為:PEDV 15%,PDCoV 33.33%,GARV 58.33%,表明這3種病毒在本地區(qū)廣泛存在。PDCoV和GARV的總體檢出率均顯著高于PEDV,表明此二種病原是引起本次腹瀉疫情的主要病原(見表2)。

    表2 3種病原的檢出率

    3個地區(qū)不同病原的感染情況也有所差異(圖2)。來源于德昌縣和寧南縣5個豬場的腹瀉樣本中,3種病原感染情況相似,PEDV檢出率均為10%,PDCoV為15%,GARV為20%。冕寧縣2個豬場的腹瀉樣本中,PDCoV檢出率顯著高于其他兩個地區(qū),其檢出率為65%。此外,GARV在所有豬場中的檢出率均為3種病原中的最高,表明引起近期涼山地區(qū)豬只腹瀉的主要病原為GARV,同時新發(fā)病原PDCoV也廣泛存在于該地區(qū)各養(yǎng)殖場中。

    圖2 不同地區(qū)3種病原感染情況

    2.3 病原的混合感染情況 在所檢測的腹瀉樣本中,存在多種病原混合感染的情況(表3)。3個地區(qū)豬場總體混合感染率分別為:德昌15%(3/20),冕寧60%(12/20),寧南 5%(1/20)。其中冕寧縣部分樣本存在3種病原同時檢出的情況(混感率為10%),表明引起冕寧縣養(yǎng)殖場腹瀉的病毒性病因更為復雜多樣。此外,3種病原兩兩混合或3種病原同時檢出的情況均存在,但檢測數(shù)據(jù)表明,3個地區(qū)不同來源的樣本中,PDCoV和GARV混合感染率分別為德昌縣10%(2/20),冕寧縣 55%(11/20),寧南縣 5%(1/20),均顯著高于同群其他感染類型。該結果一定程度上反映出PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性。

    表3 3種病原的混合感染率

    3 結論與分析

    本試驗對采自四川德昌、冕寧縣及寧南縣的腹瀉樣本進行了PEDV、PDCoV和GARV檢測,結果3種病毒的總體檢出率分別為:PEDV 15%,PDCoV 33.33%,GARV 58.33%,提示這3種病毒在本地區(qū)均有感染。此外,不同豬場主導的病因不同,因此養(yǎng)殖場應根據(jù)自身實際情況制定具有針對性的疫病防控措施。GARV在3個地區(qū)的檢出率均顯著高于PDCoV和PEDV(P<0.01),說明當前引起涼山州部分豬場腹瀉疫情的主要病原為GARV。近年來國內(nèi)大部分研究表明,在規(guī)?;B(yǎng)殖場腹瀉病因中PEDV所占比例最高。如:霍金耀等[4]對2011~2012年華中地區(qū)190份腹瀉樣本進行檢測,發(fā)現(xiàn)PEDV陽性率高達62.11%,TGEV和 GARV陽性率分別為 0.53%和7.37%;常鐵城等[5]對2014年來自全國11個省市42個豬場的165份樣本進行檢測,發(fā)現(xiàn)PEDV群體陽性率為85.71%,單獨感染PEDV的豬場占總數(shù)的59.52%。但本次研究卻表明,當前涼山州規(guī)?;B(yǎng)殖場中GARV感染情況比較嚴重,個別地方檢出率高達70%。因此應進一步對GARV在本地區(qū)的流行規(guī)律進行系統(tǒng)調(diào)查,同時建立長期有效的監(jiān)控機制,加強針對該病原的疫苗免疫,避免引起更大規(guī)模的腹瀉疫情。

    作為豬腹瀉的新病原,PDCoV也逐漸受到關注。此前本實驗室已對2013年采自四川及重慶的222份臨床樣本進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn)PDCoV陽性檢出率為7%[3],表明這種新發(fā)病原已在本地區(qū)流行。本次來自涼山州的60份腹瀉樣本中,PDCoV總體檢出率為33.33%,冕寧縣的檢出率更高達65%。說明PDCoV也是引起該地區(qū)部分豬場腹瀉的重要病原。

    本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn),腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV 3種病原存在兩兩混合感染或3種病原同時感染的情況,而這可能是導致部分豬只病情加劇,迅速死亡的主要原因。檢測結果顯示:來源于3個不同地方的樣本中,PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性,同時也表明當前本地區(qū)腹瀉病因復雜多樣,應進一步加強上述兩種病原的實驗室檢測,做到早診斷、早治療。

    [1]曹恭貌,張斌,岳華,等.四川部分豬場PEDV、TGEV、GARV和PLV感染狀況調(diào)查[J].動物醫(yī)學進展,2016,37(1):118-122.

    [2] Lee S,Lee C.Complete genome characterization of Lorean porcine deltacoronavirus strain LOR/LNU14-04/2014[J].Genome Announc,2014,2(6):1114-1191.

    [3]任玉鵬,張斌,湯承,等.同時檢測PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步應用[J].中國獸醫(yī)科學,2016,46(6):756-762.

    [4]霍金耀,鄭逢梅,陳陸,等.豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、A群輪狀病毒和嵴病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].中國獸醫(yī)學報,2013,33(12):1792-1794.

    [5]常鐵成,陳建飛,馮力,等.2014年部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(4):335-338.

    Infection Dete Ction of PEDV,PDCoV and GARV in Pig Farms of Liangshan Prefecture

    Peng Yanlin1,Li Hao2,Zhang Bin3,et al.
    (1.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Xichang City,Sichuan Xichang 615000;2.Animal Science College of Xichang University,Sichuan Xichang 615013;3.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Sichuan Chengdu 610041,China)

    To investigate the infection of PEDV,PDCoV and GARV from different pig farms in 3 counties of Liangshan prefecture,this study detected three kinds of pathogens from a total of 60 feces samples by RT-PCR method.The results showed that the detection rates of these three kinds of pathogens were PEDV 15%,PDCoV 33.33%,GARV 58.33%,respectively.It indicated that PEDV,PDCoV and GARV were widespread in pig farms of Liangshan prefecture.Besides,the positive rate of PDCoV in Mianning county was 65%,which was significantly higher(P<0.01)than that of the others,and the detection rate of GARV in this area was 70%.Moreover,These three pathogens often presented mixed infection,and the mixed infection rates in different areas were Dechang 15%(3/20),Mianning 60%(12/20),Ningnan 5%(1/20),respectively.Within these mixed infection types,the mixed infection rate of PDCoV and GARVwas highest,it could be inferred that GARV and PDCoV might have synergistic pathogenicity.

    PEDV;PDCoV;GARV;RT-PCR

    S854.43

    B

    1001-8964(2017)07-0018-04

    2017-02-23

    “十三五”國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500705)

    彭艷伶(1968-),女,獸醫(yī)師,現(xiàn)從事動物防疫工作。

    *通訊作者:任玉鵬(1986-),男,實驗師,研究方向:動物傳染病病原學。

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