• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV感染檢測

    2017-08-02 09:44:43彭艷伶李昊余瓊李建張斌沈思思任玉鵬
    四川畜牧獸醫(yī) 2017年7期
    關鍵詞:涼山州病原豬場

    彭艷伶,李昊,余瓊,李建,張斌,沈思思,任玉鵬*

    (1.四川省西昌市農(nóng)牧局,四川 西昌 615000;2.西昌學院動物科學院,四川 西昌 615013;3.西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都 610041)

    涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV感染檢測

    彭艷伶1,李昊2,余瓊1,李建1,張斌3,沈思思3,任玉鵬3*

    (1.四川省西昌市農(nóng)牧局,四川 西昌 615000;2.西昌學院動物科學院,四川 西昌 615013;3.西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都 610041)

    為了解四川省涼山州部分豬場3種豬腹瀉病毒的感染情況,本研究采用RT-PCR方法,分別對來自德昌、冕寧縣和寧南縣多個規(guī)模化豬場的60份豬腹瀉樣本進行病原檢測,包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬Delta冠狀病毒(PDCoV)和豬A群輪狀病毒(GARV)。結果顯示:3種病原的檢出率分別為PEDV 15%、PDCoV 33.33%、GARV 58.33%,其中冕寧縣PDCoV檢出率為65%,而GARV檢出率更高達70%;3種病毒混合感染的情況普遍存在,總體混合感染率分別為:德昌15%(3/20),冕寧60%(12/20),寧南5%(1/20),混合感染類型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性。

    豬流行性腹瀉病毒;豬Delta冠狀病毒;豬A群輪狀病毒;RT-PCR

    豬腹瀉病是生豬養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一,在所有引起腹瀉的病毒性因素中,豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬A群輪狀病毒(GARV)是目前臨床上較為常見的兩種病原[1]。近年還出現(xiàn)諸多新發(fā)病原從豬腹瀉病料中檢出,如豬Delta冠狀病毒(PDCoV)就是一個導致豬腹瀉的冠狀病毒科新成員,主要引起仔豬腹瀉、脫水等[2]。

    四川省涼山州當前豬腹瀉疫情較嚴重,但近年關于病原感染情況尚未見報道,這一定程度上制約了疫病防控措施的制定。故本研究采用RT-PCR方法對2016年8~9月份采自涼山州德昌、冕寧、寧南縣三個地方的60份豬腹瀉樣本進行病原學檢測,以期為本地區(qū)腹瀉病的防控提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    1.1.1 試劑 Taq聚合酶、DNA Marker II均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T Simple Vector、PrimeScriptTMRT-PCR Lit(RNA反轉錄試劑盒)均購自寶生物工程(大連)有限公司;質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

    1.1.2 儀器 PCR 儀(Veriti 96 Well Thermal Cycle,ABI公司),凝膠成像儀(Universal Hood II,BIO-RAD公司),電泳儀(DYY-5型,北京六一儀器廠)。

    1.2 引物 本試驗中用于RT-PCR法檢測 PEDV、PDCoV和GARV的引物均參照文獻[1,3]合成,所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。具體參數(shù)見表1。

    表1 PEDV、TGEV、PDCoV、GARV 擴增引物

    1.3 樣本采集與處理 本試驗待檢樣本于2016年8~9月采自四川省涼山州,其中德昌縣3個規(guī)?;B(yǎng)殖場20份、冕寧縣2個規(guī)?;i場20份、寧南縣2個規(guī)?;i場20份,共計60份腹瀉樣本。所有樣本均來源于30~60日齡保育豬。將樣本與無菌0.1mol/L PBS緩沖液按 1∶4(m/v)比例稀釋,振蕩混勻,靜置5min,以10000r/min離心10min,取上清液待檢。

    1.4 cDNA模板制備 參照寶生物公司RNAiso Plus(總RNA提取試劑)說明書,提取樣本總RNA。依次加入上述上清液200μL、RNAiso Plus 500μL、氯仿150μL,振蕩混勻后離心取上清;然后加入等體積異丙醇,離心棄上清;再加入 75%乙醇1 mL(經(jīng)DEPC處理),離心棄上清;樣品自然干燥后加入45μL無RNA酶去離子水,溶解沉淀,置-40℃保存。

    根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。反應體系:樣本總 RNA 4μL,5×Buffer 4μL,Random primer 1 μL,PrimeScript RTase 1 μL,dH2O 10 μL,總體系20μL。反轉錄程序:37℃ 15min,85℃ 15s,16℃ 1min。反轉錄產(chǎn)物置-40℃保存。

    1.5 目的基因的PCR擴增 分別用檢測PEDV、PDCoV和GARV的3對引物,對待檢樣本中的cDNA模板進行PCR擴增。反應體系為:2×PCR Master Mix 12.5μL,上、下游引物各 1.0 μL,cDNA 2.0 μL,dH2O 8.5μL,總體積 25μL。PCR 擴增條件為:95℃預變性5 min,95℃ 30 s,55℃ 30 s,72 ℃ 55 s,35 個循環(huán),72℃ 10min。取上述擴增產(chǎn)物各5μL在瓊脂糖凝膠板上以100V恒壓電泳45min,通過凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結果。對目的基因進行回收、連接和轉化,使其克隆至pMD19-T載體,并送樣到上海英駿生物技術有限公司測序,用Blast比對分析結果。對不同來源樣本中的3種病毒病原的檢出率進行統(tǒng)計分析。

    圖1 3種病原的RT-PCR擴增結果

    2 結果

    2.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及測序 將待檢樣本cDNA的PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體,并送樣到上海英駿生物技術有限公司測序,經(jīng)Blast比對分析,結果表明:與NCBI上已登錄的序列相比,PEDV擴增片段同源性為99%,PDCoV擴增片段同源性為95%,GARV擴增片段同源性為92%。

    2.2 不同豬群的感染情況 在涼山州德昌、冕寧及寧南3個地區(qū)中,豬群中PEDV、PDCoV和GARV檢出率均為100%(3/3),3種病原總體檢出率分別為:PEDV 15%,PDCoV 33.33%,GARV 58.33%,表明這3種病毒在本地區(qū)廣泛存在。PDCoV和GARV的總體檢出率均顯著高于PEDV,表明此二種病原是引起本次腹瀉疫情的主要病原(見表2)。

    表2 3種病原的檢出率

    3個地區(qū)不同病原的感染情況也有所差異(圖2)。來源于德昌縣和寧南縣5個豬場的腹瀉樣本中,3種病原感染情況相似,PEDV檢出率均為10%,PDCoV為15%,GARV為20%。冕寧縣2個豬場的腹瀉樣本中,PDCoV檢出率顯著高于其他兩個地區(qū),其檢出率為65%。此外,GARV在所有豬場中的檢出率均為3種病原中的最高,表明引起近期涼山地區(qū)豬只腹瀉的主要病原為GARV,同時新發(fā)病原PDCoV也廣泛存在于該地區(qū)各養(yǎng)殖場中。

    圖2 不同地區(qū)3種病原感染情況

    2.3 病原的混合感染情況 在所檢測的腹瀉樣本中,存在多種病原混合感染的情況(表3)。3個地區(qū)豬場總體混合感染率分別為:德昌15%(3/20),冕寧60%(12/20),寧南 5%(1/20)。其中冕寧縣部分樣本存在3種病原同時檢出的情況(混感率為10%),表明引起冕寧縣養(yǎng)殖場腹瀉的病毒性病因更為復雜多樣。此外,3種病原兩兩混合或3種病原同時檢出的情況均存在,但檢測數(shù)據(jù)表明,3個地區(qū)不同來源的樣本中,PDCoV和GARV混合感染率分別為德昌縣10%(2/20),冕寧縣 55%(11/20),寧南縣 5%(1/20),均顯著高于同群其他感染類型。該結果一定程度上反映出PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性。

    表3 3種病原的混合感染率

    3 結論與分析

    本試驗對采自四川德昌、冕寧縣及寧南縣的腹瀉樣本進行了PEDV、PDCoV和GARV檢測,結果3種病毒的總體檢出率分別為:PEDV 15%,PDCoV 33.33%,GARV 58.33%,提示這3種病毒在本地區(qū)均有感染。此外,不同豬場主導的病因不同,因此養(yǎng)殖場應根據(jù)自身實際情況制定具有針對性的疫病防控措施。GARV在3個地區(qū)的檢出率均顯著高于PDCoV和PEDV(P<0.01),說明當前引起涼山州部分豬場腹瀉疫情的主要病原為GARV。近年來國內(nèi)大部分研究表明,在規(guī)?;B(yǎng)殖場腹瀉病因中PEDV所占比例最高。如:霍金耀等[4]對2011~2012年華中地區(qū)190份腹瀉樣本進行檢測,發(fā)現(xiàn)PEDV陽性率高達62.11%,TGEV和 GARV陽性率分別為 0.53%和7.37%;常鐵城等[5]對2014年來自全國11個省市42個豬場的165份樣本進行檢測,發(fā)現(xiàn)PEDV群體陽性率為85.71%,單獨感染PEDV的豬場占總數(shù)的59.52%。但本次研究卻表明,當前涼山州規(guī)?;B(yǎng)殖場中GARV感染情況比較嚴重,個別地方檢出率高達70%。因此應進一步對GARV在本地區(qū)的流行規(guī)律進行系統(tǒng)調(diào)查,同時建立長期有效的監(jiān)控機制,加強針對該病原的疫苗免疫,避免引起更大規(guī)模的腹瀉疫情。

    作為豬腹瀉的新病原,PDCoV也逐漸受到關注。此前本實驗室已對2013年采自四川及重慶的222份臨床樣本進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn)PDCoV陽性檢出率為7%[3],表明這種新發(fā)病原已在本地區(qū)流行。本次來自涼山州的60份腹瀉樣本中,PDCoV總體檢出率為33.33%,冕寧縣的檢出率更高達65%。說明PDCoV也是引起該地區(qū)部分豬場腹瀉的重要病原。

    本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn),腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV 3種病原存在兩兩混合感染或3種病原同時感染的情況,而這可能是導致部分豬只病情加劇,迅速死亡的主要原因。檢測結果顯示:來源于3個不同地方的樣本中,PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性,同時也表明當前本地區(qū)腹瀉病因復雜多樣,應進一步加強上述兩種病原的實驗室檢測,做到早診斷、早治療。

    [1]曹恭貌,張斌,岳華,等.四川部分豬場PEDV、TGEV、GARV和PLV感染狀況調(diào)查[J].動物醫(yī)學進展,2016,37(1):118-122.

    [2] Lee S,Lee C.Complete genome characterization of Lorean porcine deltacoronavirus strain LOR/LNU14-04/2014[J].Genome Announc,2014,2(6):1114-1191.

    [3]任玉鵬,張斌,湯承,等.同時檢測PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步應用[J].中國獸醫(yī)科學,2016,46(6):756-762.

    [4]霍金耀,鄭逢梅,陳陸,等.豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、A群輪狀病毒和嵴病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].中國獸醫(yī)學報,2013,33(12):1792-1794.

    [5]常鐵成,陳建飛,馮力,等.2014年部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(4):335-338.

    Infection Dete Ction of PEDV,PDCoV and GARV in Pig Farms of Liangshan Prefecture

    Peng Yanlin1,Li Hao2,Zhang Bin3,et al.
    (1.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Xichang City,Sichuan Xichang 615000;2.Animal Science College of Xichang University,Sichuan Xichang 615013;3.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Sichuan Chengdu 610041,China)

    To investigate the infection of PEDV,PDCoV and GARV from different pig farms in 3 counties of Liangshan prefecture,this study detected three kinds of pathogens from a total of 60 feces samples by RT-PCR method.The results showed that the detection rates of these three kinds of pathogens were PEDV 15%,PDCoV 33.33%,GARV 58.33%,respectively.It indicated that PEDV,PDCoV and GARV were widespread in pig farms of Liangshan prefecture.Besides,the positive rate of PDCoV in Mianning county was 65%,which was significantly higher(P<0.01)than that of the others,and the detection rate of GARV in this area was 70%.Moreover,These three pathogens often presented mixed infection,and the mixed infection rates in different areas were Dechang 15%(3/20),Mianning 60%(12/20),Ningnan 5%(1/20),respectively.Within these mixed infection types,the mixed infection rate of PDCoV and GARVwas highest,it could be inferred that GARV and PDCoV might have synergistic pathogenicity.

    PEDV;PDCoV;GARV;RT-PCR

    S854.43

    B

    1001-8964(2017)07-0018-04

    2017-02-23

    “十三五”國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500705)

    彭艷伶(1968-),女,獸醫(yī)師,現(xiàn)從事動物防疫工作。

    *通訊作者:任玉鵬(1986-),男,實驗師,研究方向:動物傳染病病原學。

    猜你喜歡
    涼山州病原豬場
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    涼山州創(chuàng)新生物科技開發(fā)有限責任公司
    在現(xiàn)代豬場工作 一天要洗8次澡
    豬繁殖與呼吸綜合征病原流行病學調(diào)查
    豬場消毒那些
    豬場拆遷,豈可一拆了之!
    豬場還有哪些潛能可以挖掘?
    涼山州蠶種場簡介
    涼山州蠶種場簡介
    涼山州蠶種場簡介
    亚洲美女黄色视频免费看| 国内精品宾馆在线| 少妇精品久久久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 晚上一个人看的免费电影| 精品一品国产午夜福利视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩制服骚丝袜av| av卡一久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲无线观看免费| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女中出高潮动态图| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 日本av手机在线免费观看| 精品人妻熟女av久视频| 欧美高清成人免费视频www| 成人毛片a级毛片在线播放| 各种免费的搞黄视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 不卡视频在线观看欧美| 少妇丰满av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美丝袜亚洲另类| 五月开心婷婷网| 哪个播放器可以免费观看大片| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 桃花免费在线播放| 亚洲综合精品二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 九九在线视频观看精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国模一区二区三区四区视频| av在线老鸭窝| 亚洲第一区二区三区不卡| 少妇人妻久久综合中文| 春色校园在线视频观看| 一个人免费看片子| 中文天堂在线官网| 在线观看美女被高潮喷水网站| 韩国高清视频一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 久久久久久伊人网av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 三级经典国产精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美人与善性xxx| 一区二区三区精品91| 久久午夜综合久久蜜桃| 另类精品久久| 国产精品一区二区在线观看99| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女内射精品一级片tv| 午夜影院在线不卡| 天天操日日干夜夜撸| 黑人高潮一二区| av不卡在线播放| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 26uuu在线亚洲综合色| 久久97久久精品| 亚洲人成网站在线播| 五月开心婷婷网| 两个人的视频大全免费| 黑人高潮一二区| 国产免费视频播放在线视频| 久久久久精品性色| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产成人一区二区在线| 亚洲欧洲国产日韩| 久久国内精品自在自线图片| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品免费大片| 青春草国产在线视频| 色5月婷婷丁香| 国产熟女午夜一区二区三区 | 97在线人人人人妻| 边亲边吃奶的免费视频| 视频中文字幕在线观看| 99热这里只有精品一区| 日本-黄色视频高清免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 男人狂女人下面高潮的视频| 黑丝袜美女国产一区| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久国内精品自在自线图片| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日本与韩国留学比较| 天美传媒精品一区二区| 又爽又黄a免费视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一边亲一边摸免费视频| 青春草国产在线视频| 免费看光身美女| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 免费看不卡的av| 深夜a级毛片| 亚洲成人手机| 久久婷婷青草| 哪个播放器可以免费观看大片| 毛片一级片免费看久久久久| 成年女人在线观看亚洲视频| 街头女战士在线观看网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 成人特级av手机在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美另类一区| 老熟女久久久| 永久网站在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 永久网站在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品国产av在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 极品教师在线视频| 国产精品99久久久久久久久| 桃花免费在线播放| 免费在线观看成人毛片| 久久国产精品大桥未久av | 国产毛片在线视频| 99热网站在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 高清午夜精品一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 久久婷婷青草| av免费观看日本| 一级毛片我不卡| 一级毛片aaaaaa免费看小| 在线观看免费日韩欧美大片 | 在线 av 中文字幕| av线在线观看网站| 男的添女的下面高潮视频| 天堂8中文在线网| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品人妻偷拍中文字幕| 热re99久久国产66热| 午夜影院在线不卡| 成人亚洲欧美一区二区av| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲人成网站在线观看播放| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 日本黄大片高清| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产av新网站| av女优亚洲男人天堂| 色5月婷婷丁香| www.色视频.com| 精品人妻熟女av久视频| 色网站视频免费| 97超视频在线观看视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 老司机影院毛片| 国产男女内射视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产极品天堂在线| 午夜91福利影院| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产精品一区三区| 欧美3d第一页| 一级毛片久久久久久久久女| 成人漫画全彩无遮挡| 最近2019中文字幕mv第一页| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 伦理电影免费视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人精品一,二区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品视频女| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲内射少妇av| 青春草亚洲视频在线观看| 丝袜脚勾引网站| 亚洲三级黄色毛片| 22中文网久久字幕| 一级片'在线观看视频| 老司机亚洲免费影院| 国产高清三级在线| 亚洲电影在线观看av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 一区二区三区免费毛片| 亚洲图色成人| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产免费视频播放在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99国产精品免费福利视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成人漫画全彩无遮挡| 人妻系列 视频| kizo精华| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av二区三区四区| 日韩精品有码人妻一区| 久久6这里有精品| 妹子高潮喷水视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一本久久精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 日本欧美国产在线视频| 欧美日韩综合久久久久久| 9色porny在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久久久久大av| 在线观看www视频免费| 免费观看av网站的网址| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日本黄色片子视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产日韩一区二区| 一级毛片电影观看| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久视频综合| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产亚洲精品久久久com| 国产在线视频一区二区| 一级二级三级毛片免费看| 夜夜爽夜夜爽视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 青春草国产在线视频| 日本黄大片高清| 精品少妇内射三级| 少妇高潮的动态图| 视频中文字幕在线观看| 尾随美女入室| 久久久久人妻精品一区果冻| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲综合色惰| 99热这里只有精品一区| 国产精品福利在线免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产熟女欧美一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜福利,免费看| 久久久国产一区二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 色视频www国产| 成人毛片60女人毛片免费| 美女福利国产在线| 亚洲,欧美,日韩| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日本91视频免费播放| 久久精品国产自在天天线| 一级黄片播放器| 亚洲av日韩在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 青青草视频在线视频观看| 两个人免费观看高清视频 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 多毛熟女@视频| 免费黄频网站在线观看国产| 七月丁香在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品,欧美精品| 欧美日韩av久久| 熟女电影av网| 亚洲精品国产av成人精品| 三级经典国产精品| 美女福利国产在线| 女人久久www免费人成看片| 国产综合精华液| 亚洲人成网站在线观看播放| 一级毛片电影观看| 两个人免费观看高清视频 | 久久av网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 中文字幕久久专区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲美女视频黄频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 少妇人妻 视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 大陆偷拍与自拍| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲久久久国产精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 青春草视频在线免费观看| 十分钟在线观看高清视频www | 交换朋友夫妻互换小说| av播播在线观看一区| 欧美+日韩+精品| 亚洲欧美日韩东京热| 各种免费的搞黄视频| 99九九在线精品视频 | 欧美精品一区二区大全| 啦啦啦中文免费视频观看日本| videos熟女内射| 天天操日日干夜夜撸| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久久成人av| 午夜免费男女啪啪视频观看| 少妇人妻 视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产一区二区三区综合在线观看 | 全区人妻精品视频| 最近手机中文字幕大全| 免费观看在线日韩| 国内精品宾馆在线| 欧美精品一区二区大全| 51国产日韩欧美| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久人人爽人人片av| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品一区www在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲av日韩在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 久久国产精品大桥未久av | 久久午夜福利片| 亚洲国产精品成人久久小说| tube8黄色片| 亚洲三级黄色毛片| 日日啪夜夜撸| 国产精品嫩草影院av在线观看| h视频一区二区三区| 深夜a级毛片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产黄片美女视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久热精品热| 一区二区三区免费毛片| 久久av网站| 日韩大片免费观看网站| 国产精品蜜桃在线观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日本黄色片子视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 大码成人一级视频| 国产精品久久久久久精品古装| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费大片18禁| videos熟女内射| 国产成人精品无人区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 十八禁高潮呻吟视频 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 色5月婷婷丁香| 爱豆传媒免费全集在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品久久久久久久久av| 三上悠亚av全集在线观看 | 国产精品熟女久久久久浪| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 建设人人有责人人尽责人人享有的| .国产精品久久| 国产视频首页在线观看| 亚洲不卡免费看| 午夜日本视频在线| 精品久久久精品久久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲成人av在线免费| 亚洲国产精品一区三区| 国产色爽女视频免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 秋霞伦理黄片| 又大又黄又爽视频免费| 久久久久国产精品人妻一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩av不卡免费在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 秋霞伦理黄片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 秋霞在线观看毛片| 国产熟女欧美一区二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丝袜喷水一区| 精品国产乱码久久久久久小说| 最近的中文字幕免费完整| 欧美区成人在线视频| 亚洲色图综合在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品国产三级国产专区5o| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 嫩草影院新地址| 在线观看一区二区三区激情| 午夜av观看不卡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 永久网站在线| 成人无遮挡网站| 欧美日本中文国产一区发布| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 日本色播在线视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人免费观看mmmm| av视频免费观看在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 女性生殖器流出的白浆| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲,欧美,日韩| 精品少妇内射三级| 大话2 男鬼变身卡| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 两个人免费观看高清视频 | 高清午夜精品一区二区三区| 51国产日韩欧美| 日日啪夜夜撸| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩大片免费观看网站| 国产精品人妻久久久久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 边亲边吃奶的免费视频| 一级av片app| 亚洲综合色惰| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久 成人 亚洲| 日本免费在线观看一区| 韩国av在线不卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费av中文字幕在线| 亚洲欧美日韩东京热| 国产免费视频播放在线视频| 看免费成人av毛片| 大码成人一级视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 中文字幕久久专区| 一级a做视频免费观看| 午夜免费观看性视频| 日日撸夜夜添| 性色av一级| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美区成人在线视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久a久久爽久久v久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩亚洲高清精品| freevideosex欧美| 国产 精品1| 国产精品一区二区性色av| 亚洲综合精品二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 高清毛片免费看| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美日韩东京热| av不卡在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 国产乱人偷精品视频| 国产精品欧美亚洲77777| 黄色一级大片看看| 麻豆成人午夜福利视频| 一区在线观看完整版| 久久久久久久亚洲中文字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 一级黄片播放器| 精品一区二区免费观看| 97超碰精品成人国产| 99久久综合免费| 中文天堂在线官网| 亚洲人成网站在线播| 色哟哟·www| 成人免费观看视频高清| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲国产av新网站| 蜜桃在线观看..| 亚洲成人手机| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久久欧美国产精品| 久久午夜福利片| 国产黄色免费在线视频| av黄色大香蕉| 偷拍熟女少妇极品色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产69精品久久久久777片| 97超视频在线观看视频| 一个人看视频在线观看www免费| 99久久精品国产国产毛片| 中文欧美无线码| 亚洲av成人精品一区久久| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 特大巨黑吊av在线直播| 色哟哟·www| 亚洲经典国产精华液单| 久久人人爽人人片av| 女人精品久久久久毛片| 国产精品99久久久久久久久| 老司机影院成人| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 毛片一级片免费看久久久久| freevideosex欧美| 日本91视频免费播放| 视频中文字幕在线观看| 两个人的视频大全免费| 国产91av在线免费观看| 久久久精品94久久精品| 欧美区成人在线视频| 欧美3d第一页| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品.久久久| 51国产日韩欧美| 99热网站在线观看| 伦精品一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 少妇丰满av| 另类亚洲欧美激情| 亚洲综合精品二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久婷婷青草| 国产免费一区二区三区四区乱码| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲第一av免费看| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 国产黄片视频在线免费观看| 在线观看av片永久免费下载| 国产日韩欧美亚洲二区| 观看美女的网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一级黄片播放器| 国产真实伦视频高清在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本午夜av视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲怡红院男人天堂| 免费黄色在线免费观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 久久久久久久国产电影| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲精品色激情综合| 午夜免费观看性视频| 18禁在线播放成人免费| 国产在线免费精品| 亚洲精品国产av成人精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产真实伦视频高清在线观看| 高清毛片免费看| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲精品一二三| 成人影院久久| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品久久久久久久电影| 国产片特级美女逼逼视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲高清免费不卡视频|