番木瓜水溶性多糖的提取、分離與結(jié)構(gòu)分析

番木瓜水溶性多糖的提取、分離與結(jié)構(gòu)分析

分別采用常規(guī)水提醇沉和復(fù)合酶法，從番木瓜中提取水溶性粗多糖。苯酚-硫酸法測定多糖含量分別為36.48%和53.82%。粗多糖經(jīng)脫蛋白，大孔吸附樹脂脫色，透析及DEAE-纖維素52型陰離子交換層析，得到番木瓜精多糖CPP1和CPP2。Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱層析和醋酸纖維素薄膜電泳初步表明CPP1和CPP2為純度較高的均一組分。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)典型多糖吸收峰。離子色譜分別測得CPP1、CPP2的主要單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。實驗結(jié)果表明，兩者均為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖，是首次從該植物中分離得到。

材料與儀器

主要材料與試劑

番木瓜（Carica papaya L.）：廣州天河區(qū)石牌菜市場銷售的夏威夷“Sunrise”品種番木瓜。

Sepharose 6B和各標(biāo)準(zhǔn)單糖：美國Pharmacia公司；AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；牛血清蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；DEAE-52（進(jìn)口分裝），考馬斯亮藍(lán)G-250，大茴香醛，果膠酶（酶活力單位≥50萬u/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶：廣東光華化學(xué)廠有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器與設(shè)備

ICS-2500型色譜儀：美國Dionex公司；Equinox 55型傅立葉變換紅外光譜儀：德國Bruker公司；D-1冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)實驗儀器有限公司；BS2-100自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；Spectrum Lab 53型紫外分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；JY 600電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

實驗方法

粗多糖的提取

復(fù)合酶法：在熱水浸提前，調(diào)整溫度至50℃，pH值至4.0，將1 g/L纖維素酶溶液和濾渣液以5:100的體積比混勻，保溫2h。再以相同比例加入1g/L果膠酶溶液，調(diào)整pH值至3.5，50℃保溫2h后，按常規(guī)法操作提取多糖。

多糖的純化

脫蛋白質(zhì)：將木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶配制成1g/L的酶溶液，粗多糖用少量蒸餾水溶解，將酶液及多糖液以體積比5:100混勻，55℃保溫2h。再按多糖水溶液體積1/3～1/4加入Seveg試劑（氯仿：正丁醇=4:1），混合振蕩20min，重復(fù)操作10次以上，直至除盡蛋白質(zhì)。

脫色素：預(yù)先用蒸餾水把AB-8型大孔吸附樹脂浸泡過夜。抽濾后，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HCl、5%的NaOH浸泡6h，使其充分溶脹。經(jīng)蒸餾水沖洗至中性后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇繼續(xù)浸泡6h，最后用蒸餾水洗至無乙醇味。稱取450g經(jīng)預(yù)處理的樹脂裝入層析柱（45mm×600mm），蒸餾水平衡24h。取120mL經(jīng)脫蛋白的多糖溶液進(jìn)行上柱，以蒸餾水洗脫，收集洗脫液置100mL錐形瓶中。經(jīng)TLC點(diǎn)板跟蹤檢測多糖洗脫進(jìn)程。

脫鹽：將脫色后的多糖溶液，置于半透膜透析袋（截留分子量14000Da）中，扎緊袋口后在大燒杯中室溫下用蒸餾水透析80h。透析過程中，用磁力攪拌器保證透析袋處于流動狀態(tài)，中間換水9次，以除去鹽類及低聚糖等小分子雜質(zhì)。將袋內(nèi)的多糖溶液真空濃縮，95%乙醇沉淀，真空干燥即得番木瓜純化多糖CPP。

多糖的分級：稱取100g DEAE-52纖維素，用蒸餾水浸泡過夜后抽濾，分別用0.5mol/L NaOH、0.5mol/ L HCl、0.5mol/L NaOH浸泡1 h，再用蒸餾水依次處理至中性。抽氣裝入層析柱（25mm×600mm），蒸餾水平衡24h。稱取0.7g番木瓜純化多糖CPP，溶于適量蒸餾水中，上柱，分別用0.0，0.2，0.4，0.6mol/L NaCl溶液洗脫。控制流速為1mL/min，自動部分收集器收集，10mL/管，各管取樣，以苯酚-硫酸法隔管跟蹤檢測，作洗脫曲線，合并同一洗脫峰的各管樣品。洗脫液經(jīng)過真空濃縮、透析、冷凍干燥、得白色番木瓜多糖洗脫組分CPP1和CPP2。

多糖純度的鑒定

凝膠色譜法：將Sepharose 6B經(jīng)蒸餾水溶脹處理后裝柱（20mm×300mm），用蒸餾水平衡24h。將番木瓜多糖洗脫組分CPP1和CPP2分別溶于0.1mol/L NaCl溶液中，上柱，檢查番木瓜多糖的純度。以0.1mol/L NaCl溶液洗脫，流速為1mL/min，自動部分收集器收集，每管收集5mL，用苯酚-硫酸法隔管跟蹤檢測多糖，作洗脫曲線。

結(jié)果與分析

粗多糖的提取 在相同條件下，常規(guī)水提醇沉法和復(fù)合酶法分別進(jìn)行3次平行實驗。復(fù)合酶法的番木瓜粗多糖平均得率為15.87%，苯酚-硫酸法測定其多糖含量為53.82%。而常規(guī)水提醇沉法提取粗多糖，得率僅為13.17%，多糖含量在36.48%左右。采用常規(guī)熱水提取法時，多糖很難從細(xì)胞壁中釋放出來，得率低。酶法提取與常規(guī)熱水浸提法相比，不僅使提取的條件更為溫和、更有針對性，效率更高，且番木瓜粗多糖的得率及含量均有顯著提高，初步證明是一種理想的提取方法。

粗多糖的純化 粗多糖經(jīng)脫蛋白、脫色、脫鹽后，外觀形態(tài)為大小均一的純白色細(xì)粉末顆粒。這表明AB-8大孔吸附樹脂對多糖色素吸附效果顯著。

多糖的分級 純化多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析，在用0.0～0.6mol/L NaCl溶液梯度洗脫下，共出現(xiàn)兩個顯著單一對稱峰，DEAE-52纖維素柱分離效果較好。對兩個主導(dǎo)洗脫組分進(jìn)行收集，并作進(jìn)一步的純度鑒定和結(jié)構(gòu)分析。兩個組分分別記為CPP1和CPP2，其中CPP1屬于中性多糖，CPP2為酸性多糖。

多糖純度的鑒定

Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱層析：將DEAE-52纖維素分離獲得的多糖CPP1和CPP2，加入至Sepharose 6B瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行洗脫，CPP1的洗脫曲線上一共出現(xiàn)了三個洗脫峰。兩個相對狹窄的小峰出現(xiàn)在第13至22號試管中。但兩個雜峰只占了很小的比例，表明多糖CPP1的純度較高，其分子達(dá)到了一定的均一程度。多糖CPP2的洗脫峰單一對稱，顯示樣品為均一多糖，即番木瓜多糖已被純化。

多糖的結(jié)構(gòu)分析

紅外全波長掃描：多糖CPP1和CPP2經(jīng)紅外光譜檢測，從紅外光譜圖可知，CPP1和CPP2都具有典型的多糖吸收峰，并且兩者結(jié)構(gòu)相似，其特征吸收峰及所對應(yīng)的功能基團(tuán)見表1。

圖1 CPP1和CPP2紅外吸光光譜

離子色譜法測定：經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)樣色譜圖對照，多糖水解液CPP1與CPP2都含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖等五種單糖。并且五種單糖在CPP1樣品中的摩爾比例很接近，為15.13：16.87：26.17：17.92：10.26。但在樣品CPP2中，葡萄糖是最主要成分，其含量達(dá)到88.25%。這一結(jié)果也與IR分析一致。因為在CPP2的IR圖譜中，在856 cm-1處的伸縮振動峰表明CPP2中含有α-D-吡喃葡萄糖。

另外除了單糖，一定含量的雙糖海藻糖也存在于CPP1與CPP2的兩個樣品中。這表明多糖的水解還沒有完全。海藻糖是由兩分子葡萄糖組成的二糖，因此番木瓜兩種多糖的實際葡萄糖含量會更高。

復(fù)合酶法與常規(guī)水提醇沉法相比，具有高提取率、高選擇性的特點(diǎn)。酶法的提取率和粗多糖含量分別為15.87%和53.82%。而常規(guī)方法的提取率和粗多糖含量僅為13.17%和36.48%。

番木瓜粗多糖經(jīng)脫蛋白、脫色、脫鹽和DEAE-52纖維素柱層析后，獲得番木瓜多糖CPP1和CPP2兩個組分。經(jīng)Sepharose 6B和醋酸纖維膜電泳試驗，初步證明番木瓜多糖CPP1和CPP2均為純度較高的單一組分。離子色譜測得CPP1和CPP2都是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成。實驗結(jié)果表明，兩者均為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖，是首次從該植物中分離得到。

□ 唐若宓 廣東省輕工業(yè)高級技工學(xué)校