不同成熟期楊梅果實微生物的多樣性*

羅曉輝， 朱心怡， 陳曉青， 鄭曉梅，羅詩怡， 沈芷琦， 陳文榮

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

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不同成熟期楊梅果實微生物的多樣性*

羅曉輝， 朱心怡， 陳曉青， 鄭曉梅，羅詩怡， 沈芷琦， 陳文榮

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

以不同發(fā)育期的楊梅果實(黑炭)為實驗材料，測定了楊梅果實在成熟及劣變過程中有關果實品質相關指標的變化規(guī)律；并利用變性梯度凝膠電泳分離菌群的技術，研究了楊梅果實從發(fā)育早期至成熟腐爛發(fā)霉期間微生物菌群的變化規(guī)律.結果顯示：楊梅果實軟化及劣變迅速；發(fā)育早期無可培養(yǎng)微生物侵染，當果實發(fā)育至轉色期時才檢測到微生物菌群；通過基因序列測序結果分析發(fā)現(xiàn)，楊梅果實發(fā)育過程中存在18種優(yōu)勢菌，細菌6種、真菌12種，其中熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)和曲霉屬(Aspergillus)一直存在至果實成熟時期.研究發(fā)現(xiàn)，楊梅果實的腐爛發(fā)霉主要由伯克氏菌屬(Burkholderia)、魏斯氏菌(Weissellacibaria)、腐皮殼屬(Diaporthe)和黑曲霉(Aspergillusniger)的快速繁殖引起.

楊梅；果實品質；病原微生物；變性梯度凝膠電泳

楊梅(MyricarubraSieb. et Zucc.)是楊梅科楊梅屬常綠植物，為我國著名的特產水果果樹，也是我國南方地區(qū)良好的經濟生態(tài)樹種[1].楊梅的栽培地主要分布在北緯18°～33°，即我國長江流域以南地區(qū)，主要為浙江、江西和廣東等13個省，其中栽培面積、產量和品質等均以浙江為最[2].楊梅除具有食用價值外，還具有園林觀賞價值及藥用價值[3].

楊梅果實的成熟集中在我國的初夏時節(jié)，此時氣候為高溫多濕，且楊梅果為聚合果，果肉多漿，采后果實劣變快而不易保藏[4-6].隨著果實的成熟，楊梅果實的軟化為病原微生物的侵染提供了條件[7]，從而導致果實迅速腐爛，喪失其商品價值.因此，研究楊梅果實發(fā)育過程中微生物菌群多樣性的變化規(guī)律，可為研發(fā)合適的生物保鮮劑提供理論基礎.

目前，研究報道楊梅果實病害主要由真菌引起，主要病原菌有桔青霉(PenicilliumcitrinumThom)、綠色木霉(TrichodermaviridePers. ex Fr.)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等[8-9].針對病原菌侵染的狀況，常用鑒定微生物菌種的方法主要是形態(tài)學方法，但自然生長條件下可培養(yǎng)的菌種僅占自然環(huán)境中總微生物的10%左右，微乎其微[10].近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，一些新的生物技術，如PCR技術、原位雜交、熒光定量和變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)等，亦被用于微生物的鑒定.其中，DGGE技術能夠較準確地反映出樣品中優(yōu)勢種群的動態(tài)變化規(guī)律[11].并且，隨著研究領域的不斷發(fā)展，Myers 等[12]大膽地對DGGE技術進行了創(chuàng)新，加入“GC夾板”和異源微生物DNA，從而使DGGE技術得到了進一步的完善.本實驗采用DGGE技術分離鑒定了不同成熟期楊梅果實中的微生物菌群，并采用質粒重組轉化、藍白斑篩選等技術手段，結合基因序列測定和序列比對，以達到菌種的鑒定，旨在為進一步研究楊梅果實病害及其生物防治提供依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

楊梅(M.rubraSieb. et Zucc.黑炭)分別于2014-06和2015-06中旬開始，在浙江省蘭溪市同一個果園中的同一棵樹上摘取不同發(fā)育時期和腐爛期的楊梅果實作為實驗材料(見圖1),其中A，B，C，D和E分別表示發(fā)育期、轉色前期、轉色后期、成熟期和腐爛期的楊梅果實.

圖1 不同發(fā)育時期的楊梅

1.2 果實品質相關指標測定

1.2.1 硬度

用硬度計(GY-3型)測定果實的硬度，每個果實在赤道兩端各測一次，每個階段隨機選取10個果實，求平均值.

1.2.2 可溶性固形物和可滴定酸含量

每個階段取50 g果實榨汁后過濾，果汁用來測定可溶性固形物和可滴定酸的含量.用毛細滴管吸取楊梅汁液，滴入可溶性固形物測定儀中，讀數(shù)并記錄.可滴定酸含量測定采用酸堿滴定法，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定25 mL果汁，結果以檸檬酸的質量分數(shù)表示.

1.2.3 花青素含量

采用pH示差法[13]測定.

1.3 楊梅果肉中微生物的提取及鑒定

1.3.1 微生物DNA的提取及測定

取各階段的楊梅果實5顆放入無菌聚乙烯(PE)袋中，加入30 mL 1×PBS滅菌緩沖液，放置旋轉儀中低速旋轉1.25 h，轉移上清液至50 mL滅菌離心管中靜置0.5 h，轉移上清液至2 mL離心管中，13 000 r/min離心，去上清，留沉淀.

取上述沉淀0.25 g，通過MO試劑公司的PowerFoodTMMicrobial DNA Isolation Kit試劑盒提取微生物DNA.將提取所得楊梅果實中微生物的總DNA進行濃度測定，測定時取1 μL樣液進行測定，剩余部分放置在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3.2 總DNA的PCR擴增

本實驗為得到足夠量的楊梅果實中微生物菌群的有效DNA，采用2次重復PCR擴增的方法對提取所得總DNA進行擴增，擴增目的DNA為細菌16S及真菌ITS的部分核糖體核苷酸序列.

細菌所用引物為534：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′和341-GC：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′.PCR反應體系為25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物534 0.5 μL，引物341-GC 0.5 μL，Ex Tag酶0.125 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足.PCR反應程序采用降落PCR，條件為：94 ℃ 4 min，20×(94 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min),每個循環(huán)降溫0.5 ℃，5×(94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min，16 ℃保存.

真菌所用引物為28S1r：5′-TATGCTTAAGTTCAGCGGGTA-3′和5.8Sf-GC：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGTGAATCATCGATTCTTTGAAC-3′.PCR反應體系為25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物28S1r 0.5 μL，引物5.8Sf-GC 0.5 μL，Ex Tag酶0.125 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足.PCR反應程序采用降落PCR，條件為：94 ℃ 4 min，20×(94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min)每個循環(huán)降溫0.5 ℃，5×(94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min，10 ℃保存.

1.3.3 電泳

取PCR擴增產物各5 μL，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.3.4 二次PCR

以第一次PCR產物為模板，反應體系為50 μL，即第一次體系的2倍.

細菌PCR反應程序為94 ℃ 4 min，4×(94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)每個循環(huán)降溫0.5 ℃,72 ℃ 10 min，16 ℃保存.

真菌PCR反應體系為95 ℃ 4 min，4×(95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min)每個循環(huán)降溫0.5 ℃，72 ℃ 10 min，16 ℃保存.

1.4 變性梯度凝膠電泳分析

經大量的預實驗不斷地調整變性梯度凝膠電泳的濃度范圍，最終，細菌16S V3 DGGE選用35%～70%的梯度，而真菌ITS DGGE選用40%～65%的梯度，作為正式實驗的濃度梯度.二次PCR產物15 μL和上樣緩沖液(3×)7.5 μL，加樣前混合.電泳條件：50 V，14 h，電泳液溫度為60 ℃，染色20 min.

1.5 DGGE條帶的序列分析

在紫外線照射下，將電泳條帶回收用蒸餾水浸沒，水浴1 h后用不帶GC夾的引物(細菌：534和341；真菌：5.8Sf和28S1r)進行降落PCR擴增，將PCR產物純化后與PMD-18-T載體連接，克隆成功后送上海生工生物工程股份有限公司測序.

2 結果與分析

2.1 各時期楊梅果實的硬度及可溶性固形物、可滴定酸和花青素的含量變化

果實硬度及可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)的含量是衡量楊梅果實品質的重要標準.從圖2可知：楊梅在成熟過程中果實硬度呈逐漸降低的趨勢(見圖2中(a))；而可滴定酸含量雖然也呈下降趨勢，但在成熟期前已經降到最低點(見圖2中(b))；花青素含量隨果實發(fā)育和成熟進程而迅速增加，并在成熟后有一上升過程，之后隨著品質劣變而顯著下降(見圖2中(c))；可溶性固形物含量亦隨著果實成熟進程而不斷增加，并在果實成熟后保持較高的含量(見圖2中(d)).根據以上分析可以得知，楊梅果實在成熟期時果實品質和營養(yǎng)成分都達到最佳，隨后進入腐爛期時開始降低.

不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著圖2 不同發(fā)育期楊梅果實的硬度及可溶性固形物、可滴定酸和花青素含量的變化

2.2 基因組DNA的提取及PCR擴增

取上述各階段楊梅微生物基因組DNA進行濃度稀釋至15 ng/μL，分別進行16S V3 降落PCR和 ITS降落PCR擴增.取PCR產物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖3所示：擴增產物與目的片段的長度相似，細菌在230 bp左右，真菌在300 bp左右.各時期條帶亮度有差異，且真菌出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這可能是由于樣品DNA濃度較低、PCR反應特異性較差導致的，但不影響變性梯度凝膠電泳的進一步操作.

2.3 變性梯度凝膠電泳與分析

16S V3和ITS變性梯度凝膠電泳結果見圖4.

2015Y與2014Y分別表示2015年和2014年的樣品；圖中1—15表示割膠回收條帶圖4 變性梯度凝膠電泳圖

DGGE電泳后割膠條帶進行測序比對，并用BLAST在GenBank中搜索相近序列，經序列比對后楊梅微生物菌群如表1和表2所示.

2015Y與2014Y分別表示2015年和2014年的樣品圖3 降落PCR電泳圖

條帶編號菌種相似度/%序列號閾值1Pseudomonasfluorescens熒光假單胞菌99KC920987.13552Methylobacteriumradiotolerans甲基桿菌98KC902793.12893Burkholderia伯克氏菌屬98JF958162.13354Prinsepia扁桃木屬100KC571835.13155Rhizobialesbacterium根瘤菌目菌100JQ617869.13116Weissellacibaria魏斯氏菌100KF023199.13117P.fluorescens熒光假單胞菌100KC920987.1357

表2 ITS PCR-DGGE后割膠條帶的分析結果

由表1和表2可知，楊梅果實在其生長發(fā)育初期至成熟腐爛發(fā)霉過程中，其優(yōu)勢菌總共有18種，其中細菌6種，真菌12種.根據圖4(a)可知,楊梅果實在發(fā)育至轉色前期(B)時出現(xiàn)了4種細菌優(yōu)勢菌群，分別為熒光假單胞菌(P.fluorescens)、甲基桿菌(M.radiotolerans)、根瘤菌目菌(R.bacterium)和扁桃木屬(Prinsepia)，并且在果實發(fā)育至成熟的過程中菌群種類變化不明顯.然而，當果實發(fā)育至腐爛發(fā)霉時，楊梅果實的菌群發(fā)生了明顯的變化，如：熒光假單胞菌(P.fluorescens)幾乎消失；伯克氏菌屬(Burkholderia)和魏斯氏菌(W.cibaria)則明顯增強.

同時，在果實發(fā)育過程中，楊梅果實的真菌菌群也有類似的結果.由表2可知，楊梅果實發(fā)育至轉色期時出現(xiàn)了10種優(yōu)勢真菌菌種，分別為擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、梗孢屬(Dissoconium)、出芽短梗霉菌(A.pullulans)、灰葡萄孢霉(B.fuckeliana)、青霉屬(Penicillium)、煙草赤星病菌(A.alternate)、黑附球菌(E.nigrum)和曲霉屬(Aspergillus).由圖4(b)可以明顯地看出，當果實發(fā)育至腐爛發(fā)霉時，楊梅果實中的真菌種類及其數(shù)量發(fā)生了明顯的變化，如：早期的擲孢酵母屬和梗孢屬菌群弱化；而腐皮殼屬(Diaporthe)和黑曲霉(Aspergillusniger)則增強.實驗中基因測序比對結果的相似度均在98%以上，說明結果比較可靠.

綜合以上結果：楊梅果實在果實發(fā)育早期無優(yōu)勢菌群出現(xiàn)，直至轉色期時才出現(xiàn)優(yōu)勢菌群，且這些優(yōu)勢菌一直伴隨著楊梅果實發(fā)育至完全成熟的階段；而在果實發(fā)育至腐爛發(fā)霉的過程中，楊梅果實中的微生物菌群發(fā)生了較大的變化，主要是前期的部分菌群弱化，如擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，而加速果實腐爛的菌群加強，如腐皮殼屬(Diaporthe)和黑曲霉(A.niger)，加速了楊梅果實的腐爛變質.

3 討 論

隨著微生物研究領域的不斷延伸，內生菌的分離培養(yǎng)越來越得到研究者的關注.石晶盈等[14]采用平板培養(yǎng)法成功地篩選培養(yǎng)出番木瓜的內生菌群，并利用分離菌成功地抑制了木瓜炭疽病的發(fā)生.自Fischer首次提出利用變性梯度凝膠電泳分離微生物菌群以來，DGGE技術廣泛應用于環(huán)境土壤微生物的分離鑒定，如王君等[15]對高溫功能微生物的分離、農田土壤微生物群落結構的鑒定等，而利用DGGE分離楊梅果實內生菌尚未見相關報道.

根據PCR-DGGE圖譜可知，不同階段的條帶分布相似，但粗細及亮度有所差異，表明楊梅果實各發(fā)育期菌群結構相似，但數(shù)量略有不同.條帶粗亮說明該菌群數(shù)量多，為優(yōu)勢菌群.DGGE技術與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳分離菌群的方法相比，變性梯度凝膠電泳能夠很好地把不同分子量的DNA電泳分離，可精確至一個堿基的變化；同時，通過DGGE割膠回收電泳后的條帶，回收率高，對DNA的損傷小.這為提取果肉中微量的微生物DNA提供了有力的技術手段.由16S V3 DGGE和ITS DGGE圖可以得出，楊梅果實在其生長發(fā)育早期果實內部及其表面無附著菌落，可能是：由于果實生長分裂早期細胞代謝旺盛，抵抗外界菌群侵染的能力強，使菌群無法在其上生長；同時，早期果實的生長主要以4月為主，楊梅果實的生長環(huán)境相對于6月的高溫高濕季節(jié)，環(huán)境中的微生物代謝緩慢，不易入侵至楊梅幼果，最終使楊梅果實在早期發(fā)育過程中無有害菌附著.

目前，楊梅的微生物種群研究相對較少.戚行江等[16]采用培養(yǎng)基培養(yǎng)成功地分離出了20種真菌，其中主要的致病菌有酵母類、青霉菌、芽枝霉、曲霉菌和鐮孢霉.文獻[17]對云南楊梅的微生物研究報道了6類新的微生物種類：微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、托姆青霉(P．thomii)、灰葡萄孢(Botrytiscinema)、尖鐮孢(Fusariumoxysporium)、鏈格孢(Alternariaalternata)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani).上述結果與本研究結果相比，楊梅果實腐敗變質的菌種有部分相同，如酵母類、曲霉等.然而，本實驗中發(fā)現(xiàn)了新的菌種，如伯克氏菌屬(Burkholderia)、魏斯氏菌(W.cibaria).這很可能與楊梅的生長環(huán)境有關.楊梅果實上的微生物由外界的寄生菌及其自身內部的菌種共同組成，因此，針對不同地區(qū)的楊梅果實采取不同的保鮮劑防范措施是十分必要的.

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(責任編輯 薛 榮)

The microbial diversity in different maturity stages of Chinese bayberry

LUO Xiaohui, ZHU Xinyi, CHEN Xiaoqing, ZHENG Xiaomei,LUO Shiyi, SHEN Zhiqi, CHEN Wenrong

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

The Chinese bayberry sampled at different ripening and deterioration stages were subjected to the assay of fruit quality related indicators. Meanwhile, the Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) technology was applied to separate and identify microbial DNA in the fruits. The results showed that the fruit softened and deteriorated quickly. In the early stages of fruit development, no cultivable bacteria infection was observed. The cultivable microbe emerged in turn color period, and a total of 18 dominant microbe was detected during the whole fruit ripening process, which included 6 bacteria species and 12 fungi species. Among them,Pseudomonasfluorescens,Methylobacteriumradiotolerans,Sporobolomyces,AureobasidiumpullulansandAspergillusexisted ever since early stage to mature period. Meanwhile, the results also showed the dominant bacteria resulted in bayberry fruit rotting wereBurkholderia,Weissellacibaria,DiaportheandAspergillusniger, and their rapid propagations led to fruits decay.

Chinese bayberry; fruit quality; pathogenic microorganisms; DGGE

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.01.013

2016-03-28；

2016-05-20

浙江省科技計劃公益技術研究項目(2013C32074)；浙江省重大科技專項(2013C02004)

羅曉輝(1990-),男,安徽合肥人,碩士研究生.研究方向：生物化學與分子生物學.

陳文榮.E-mail： cwr@zjnu.cn

S667.6

A

1001-5051(2017)01-0085-06