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    耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

    2017-08-02 10:22:51王宇哲張可然黃鳳華張西鋒
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2017年6期
    關(guān)鍵詞:剛果紅葡聚糖菌種

    袁 帥 王宇哲 張可然 黃鳳華 張西鋒

    (武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

    耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

    袁 帥 王宇哲 張可然 黃鳳華 張西鋒

    (武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

    采用硒選擇培養(yǎng)基和剛果紅平板法對耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行初篩,通過透明圈的大小篩選了耐2500mg/L濃度Se的13株菌株,并對篩選菌株的產(chǎn)纖維素酶活力進(jìn)行了初步的檢測。

    纖維素酶 菌株

    1 前言

    纖維素是植物光合作用下產(chǎn)物,且是目前自然界中含量非常大的一類可再生資源,有機(jī)肥料等部分物質(zhì)可由其制備而成,但每年也會有大量秸稈等富含纖維素的生物體被焚燒造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi),因此,如何利用好自然界中的纖維素對人類未來的發(fā)展有著重要的意義。目前,肥料是農(nóng)作物的生長所離不開的物質(zhì),而有機(jī)肥料則需要通過秸稈等物質(zhì)內(nèi)部纖維素的分解來進(jìn)一步生產(chǎn),同時人們對健康生活的追求使富硒產(chǎn)品的需求量增加。但目前大部分土壤并不是富硒的環(huán)境,所以非富硒地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)開始對富硒有機(jī)肥料有所需求,通過在農(nóng)作物的生長過程中加入有機(jī)肥料的方式來達(dá)到農(nóng)作物含硒的目的。而富硒有機(jī)化肥的生產(chǎn)離不開可耐受高濃度硒的纖維素菌種或菌群,所以,篩選出耐受高濃度硒的纖維素菌種或菌群對富硒有機(jī)化肥的生產(chǎn)有著重要的意義。

    2 材料與方法

    2.1 材料

    2.1.1 土樣:湖北恩施富硒礦床土樣。

    2.1.2 其他實(shí)驗(yàn)材料:蛋白胨、酵母提取物、蒸餾水、氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、亞硒酸鈉等均為國產(chǎn)試劑。

    2.2 培養(yǎng)基

    2.2.1 富集培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基:

    富集培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5g/L,自然pH值。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基+Na2SeO3 150mg/L。

    2.2.2 梯度硒選擇培養(yǎng)基和富硒固體培養(yǎng)基:

    梯度硒選擇培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 1g/L,Na2SeO3(500、1000、1500、2000和2500)mg/L,自然pH值。富硒固體培養(yǎng)基:梯度硒選擇培養(yǎng)基+瓊脂粉15g/L。

    2.2.3 剛果紅篩選纖維素瓊脂培養(yǎng)基:

    KNO3(2g/L),KH2PO4(1g/L),MgSO4(0.5 g/L),NaCl(1g/L),Na2HPO4(1g/L),CMC-Na(20g/L),Na2SeO32500mg/L,瓊脂(15g/L),自然pH值。

    2.2 方法

    2.2.1 耐硒菌種的分離:

    收集湖北恩施富硒茶田土富硒土樣,將土樣放入燒杯中,加入無菌磷酸鹽緩沖液懸浮,在常溫、180r/min的環(huán)境下于搖床中振蕩30min,靜置,待沙礫和大顆粒沉降后收集懸浮液。取懸浮液的一部分經(jīng)5000r/min離心10min后,收集沉淀(沉淀用5ml無菌磷酸鹽緩沖液懸浮后放入4℃冰箱保存)。另一部分2ml的懸浮液加入富集培養(yǎng)基中擴(kuò)培,在37℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)2d,放入4℃冰箱保存。

    取上述擴(kuò)培液加入含150μg/ml Na2SeO3的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中,在37℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)2天。以5%接種量繼代培養(yǎng)4次后,接種到硒的濃度為Se(500、1000、1500、2000和2500mg/L)的梯度硒選擇培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)48h。在2500mg/L的梯度硒選擇培養(yǎng)基中存活的菌株即為耐硒的菌株。

    2.2.2 耐硒纖維素分解菌的分離:

    取耐硒菌液,經(jīng)蒸餾水稀釋后涂布在相對應(yīng)濃度Na2SeO3(2500mg/L)的剛果紅篩選纖維素瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,在培養(yǎng)結(jié)束后往培養(yǎng)皿中加入適量的剛果紅溶液,染色1h后棄去染液,加入適量1 mol/L的NaCl溶液,洗滌1h。根據(jù)菌落周圍透明圈直徑與菌落直徑的比值大小選擇菌株。對比值大的菌落進(jìn)一步分離并保存,在編號后用于后續(xù)纖維素酶活力強(qiáng)弱的研究測定。共篩選出了13株耐硒菌株。

    2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用文獻(xiàn)1的方法[1]。

    2.2.4 內(nèi)切型β-葡聚糖酶活力的測定

    內(nèi)切型β-葡聚糖酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[2]。

    3 結(jié)果

    3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    以吸光度為縱坐標(biāo),葡萄糖溶液含糖的毫摩爾數(shù)(酶活力)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:y=0.1597x-0.0807。

    圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    3.2 菌種的分離與篩選

    通過剛果紅染色使產(chǎn)纖維素酶的菌落周圍形成透明圈,如下圖所示。共篩選出13株耐硒2500mg/L的菌株。使用剛果紅平板篩選法可以更好地篩選出耐硒纖維素菌,可以非常直觀地看出平板上分布著各種大大小小的透明圈,一個透明圈就意味著存在這樣一個耐硒菌種。另外根據(jù)菌種周圍透明圈的大小可以判斷出它的酶產(chǎn)量,透明圈越大說明它的酶產(chǎn)量越多,透明圈成型越快說明它的產(chǎn)酶量越快。

    圖1 菌株在平板上形成的透明圈(箭頭所指)

    3.3 菌株纖維素酶活力的測定

    以液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株篩選的耐硒菌株,在12h和24h分別取樣,測定內(nèi)切型β-葡聚糖酶的活力。

    Table 1 12h內(nèi)切型β-葡聚糖酶的活力

    Table. 2 24h內(nèi)切型β-葡聚糖酶的活力

    4 結(jié)論

    纖維素是地球上最廉價和最豐富的可再生資源,可以轉(zhuǎn)化為飼料、能源、化工原料和食品等。但纖維素酶活力不高制約了纖維素的廣泛應(yīng)用。因此,選育產(chǎn)酶活力高、遺傳穩(wěn)定性好的菌株是解決纖維素有效利用的關(guān)鍵問題之一。硒是人體必需的微量元素。硒在提高人體免疫力和抗氧化方面具有非常好的功效,并具有抗腫瘤活性,對多種癌癥具有明顯的抑制作用。這就促進(jìn)了富硒食品的研究與開發(fā)。富硒有機(jī)肥的生產(chǎn)與應(yīng)用可以解決食品中有機(jī)硒的含量。本研究篩選了13株耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株,下一步將對各菌株進(jìn)行鑒定。篩選的菌株可用于富硒有機(jī)肥的生產(chǎn)與利用,促進(jìn)富硒有機(jī)肥事業(yè)的發(fā)展。

    [1] 蔡勇.堿性纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選及其基因的克隆與表達(dá)[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2005.

    [2] 管斌,謝來蘇,丁友防,等.纖維素酶酶活力測 定方法的校正[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1999,(4):20-26.

    武漢輕工大學(xué)大學(xué)生科研項(xiàng)目(xsky2016008)

    袁帥(1996-),男,本科生。

    張西鋒(1977-),男,博士,副教授。

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