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    山羊痘病毒P32基因的克隆與序列分析

    2017-08-02 10:22:51豪白雅琴陳伯祥陳冬梅楊明郭慧琳袁
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2017年6期

    唐 豪白雅琴陳伯祥陳冬梅楊 明郭慧琳袁 勇

    (1.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046;2.甘肅省畜牧產(chǎn)業(yè)管理局,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;4.甘肅省農(nóng)牧廳機(jī)關(guān)后勤服務(wù)中心,甘肅蘭州 730000)

    山羊痘病毒P32基因的克隆與序列分析

    唐 豪1白雅琴2*陳伯祥3陳冬梅4楊 明3郭慧琳1袁 勇2

    (1.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046;2.甘肅省畜牧產(chǎn)業(yè)管理局,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;4.甘肅省農(nóng)牧廳機(jī)關(guān)后勤服務(wù)中心,甘肅蘭州 730000)

    山羊痘是由山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病,病羊以發(fā)熱、全身起痘、呼吸道和消化道損傷以及淋巴結(jié)腫大為特征。該病的暴發(fā)和流行不僅對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失,還可嚴(yán)重影響國際貿(mào)易,因此被OIE列為必須報(bào)告的疫病,也列為我國動物疫病一類。近年隨著山羊痘疫情在世界各地尤其東亞地區(qū)的暴發(fā)流行,國內(nèi)外學(xué)者加大了對山羊痘病毒編碼蛋白的研究力度,以期研制出更為敏感特異的新型診斷試劑和安全高效的新型疫苗。

    山羊痘基因組大小為143~147 kb,P32基因位于GTPV基因組的64~65kb處。P32具有抗原特異性,P32是含有一個(gè)抗原決定簇,由319~324個(gè)氨基酸組成的囊膜蛋白,羧基端有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,對細(xì)胞有毒害作用。山羊痘病毒P32的結(jié)構(gòu)蛋白,具有免疫原性,免疫羊等動物后可產(chǎn)生具有保護(hù)性的抗體。目前,我國缺乏高效準(zhǔn)確的山羊痘病毒的檢測方法或試劑盒,使該病難以控制。為此,我們開展了山羊痘病毒P32基因的克隆與序列分析,為下一步建立敏感、快速、準(zhǔn)確簡單易行的GTPV檢測方法和P32蛋白的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 毒株

    山羊痘毒株(GTPV-Shan-1)由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存,并在原代綿羊睪丸細(xì)胞中培養(yǎng)。

    1.1.2 主要試劑與載體

    T4 DNA連接酶、PCR試劑、TaKaPa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0試劑盒、pMD18 - T載體購自寶生生物工程(大連)有限公司,SE.DNA kit(OMEGA bio-tek)購自O(shè)MEGA 公司;大腸桿菌DH5α菌種購自Solarbio。

    1.2 方法

    1.2.1 P32基因的PCR擴(kuò)增

    根據(jù)Genbank中收錄的GTPV基因序列,遵循引物設(shè)計(jì)原則,應(yīng)用在線軟件分析P32,設(shè)計(jì)一對引物用于擴(kuò)增P32基因,上游引物P1 5’-AACTAATTATCAAAAATGGCAG-3’;下游引物P2:5’-TGGATGGGATACATAGTAAGAA-3’,預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小846bp。引物由寶生生物工程(大連)有限公司合成。

    取200μl病毒細(xì)胞培養(yǎng)物,用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA,然后取5μl病毒基因組DNA為模板,加入4μl dNTP混合物,5μl 10×PCR buffer、上下游引物各1μl、0.25μl EX Taq酶,最后補(bǔ)水至50μl。PCR反應(yīng)條件:94℃5min;94℃50s;55℃50s,72℃60s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min,4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。

    1.2.2 連接及轉(zhuǎn)化

    按照TaKaPa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0的說明書操作,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,與pMD18-T載體相連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。在涂有氨芐西林的LB瓊脂平板上,挑選單個(gè)菌落接入含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中,提取質(zhì)粒DNA樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測后將重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序。

    1.2.3 序列分析

    應(yīng)用DNAStar、BLAST(NCB I)軟件與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比較,分析不同來源山羊痘病毒株P(guān)32 基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴(kuò)增及初步鑒定

    采用P1 /P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從山羊痘病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物的核酸樣本中擴(kuò)增出1 條約846 bp大小的DNA帶,而正常細(xì)胞顯現(xiàn)陰性反應(yīng),與預(yù)期大小相符合(圖1)。

    表1 P32基因核苷酸序列的同源性比對

    圖1 P32基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

    圖3.2 P32重組質(zhì)粒擴(kuò)增鑒定

    2.2 PCR產(chǎn)物克隆與重組質(zhì)粒鑒定

    從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物,與pMD18-T載體相連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑選抗Amp+菌落進(jìn)行搖振培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖電泳,得到兩條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。

    2.3 P32基因核苷酸序列測定及同源性分析

    將鑒定的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序,山羊痘病毒(GTPV-Shan-1)的P32基因?yàn)?032bp。將此P32基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外不同來源山羊痘病毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果見表1和圖1。

    圖1 P32基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

    結(jié)果表明,山羊痘病毒株S-1株的P32 基因序列與山羊痘毒FZ株和G20-LKV株核苷酸序列的同源性分別達(dá)到99.3%和99.2%。與國內(nèi)外不同來源的山羊痘病毒分離株相比較,P32基因核苷酸序列的同源性達(dá)到97.8%以上。同源性分析結(jié)果表明,山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性。

    3 討論與分析

    2002年,Tulman等對山羊痘病毒的全基因組序列測定工作完成,P32 基因定位于病毒基因組的64~65 kb處,全長969個(gè)核苷酸,編碼323個(gè)氨基酸;羊痘病毒的P32 基因具有高度保守性,世界各地不同分離株的P32 基因核苷酸序列同源性達(dá)到97%。

    本試驗(yàn)對山羊痘shan-1株進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化并測序,其核苷酸序列與國內(nèi)分離病毒FZ 株和G20-LKV株的P32基因的同源性達(dá)到99.2%以上,與印度、哈薩克斯坦分離株的同源性達(dá)到97.8%~99.1%,顯示了山羊痘病毒P32基因的高度保守性。從P32基因的核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,山羊痘S-1株與這為進(jìn)一步研究山羊痘病毒P32基因表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)活性、結(jié)構(gòu)與功能奠定了良好的工作基礎(chǔ)。

    [1] Heine H G,StevensM P,F(xiàn)oord A J.A cap ripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32,the homolog of the vaccine virus H3L gene[J].J ImmunMethods,1999,(227):187-196.

    [2] 康文玉,徐自忠,花群義,等.羊痘病毒P32蛋白編碼基因的克隆及表達(dá)[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2006,36(6):454-459.

    [3] HosamaniM,Mondal B,Tembhurne P A,et al.Differentiation of sheep pox and goat poxviruses by sequence analysis and PCR-RFLP of P32 gene[J].Virus Genes,2004,29(1):73-80.

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    甘肅省科技支撐計(jì)劃-農(nóng)業(yè)類,項(xiàng)目編號:1104NKCL097

    唐豪(1983-),男,大學(xué)學(xué)歷,助理獸醫(yī)師,主要從事動物疫病的防控技術(shù)的研究與推廣工作。

    白雅琴(1969-),女,大學(xué)學(xué)歷,高級畜牧師,主要從事家畜的改良與新品種的推廣工作。

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