昆明市區(qū)虎皮鸚鵡源大腸桿菌毒力基因及耐藥基因的流行病學(xué)特征

楊 娟，吳海濱，戴開(kāi)娜，魏學(xué)林，吳培福

(1．西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224;2．大寨鄉(xiāng)人民政府畜牧獸醫(yī)站，云南 金平 661511)

昆明市區(qū)虎皮鸚鵡源大腸桿菌毒力基因及耐藥基因的流行病學(xué)特征

楊 娟1，吳海濱1，戴開(kāi)娜2，魏學(xué)林1，吳培福1

(1．西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224;2．大寨鄉(xiāng)人民政府畜牧獸醫(yī)站，云南 金平 661511)

為研究大腸桿菌毒力基因和耐藥基因的流行病學(xué)特征對(duì)大腸桿菌病的防控，從昆明市花鳥(niǎo)市場(chǎng)采集虎皮鸚鵡糞樣，從中分離鑒定大腸桿菌，并對(duì)12種毒力基因及22種耐藥基因的攜帶情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果從虎皮鸚鵡糞樣中共分離鑒定出47株大腸桿菌;feo B、tra T、fim A基因攜帶率都為100%;不攜帶cva C基因。41．67%的毒力基因檢出率在50%以上。對(duì)耐藥基因而言，除氨基糖苷類藥物的aac(3)－Ia基因、β－內(nèi)酰胺類藥物的OXA、SHV基因未檢出外，其余耐藥基因均呈陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果可為虎皮鸚鵡大腸桿菌病的預(yù)防提供理論支持和實(shí)踐借鑒。

虎皮鸚鵡;大腸桿菌;毒力基因;耐藥基因

大腸桿菌病是一種全世界范圍內(nèi)流行的人獸共患病之一，具有廣泛傳播性和重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。大腸桿菌的致病性和耐藥性分別與其攜帶毒力基因和耐藥基因的種類、數(shù)目存在相關(guān)性［1，12］。虎皮鸚鵡作為觀賞鳥(niǎo)類，在全世界分布廣泛，同樣亦對(duì)致病性大腸桿菌敏感［2－4］，特別是幼齡鸚鵡感染性更高，但目前很少見(jiàn)到虎皮鸚鵡糞便大腸桿菌毒力基因及耐藥的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在分離鑒定虎皮鸚鵡糞便大腸桿菌的基礎(chǔ)上，對(duì)分離株毒力基因的流行病學(xué)特征及耐藥基因攜帶率進(jìn)行研究，可為大腸桿菌病的防控提供理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 虎皮鸚鵡(2016年6～7月采集于昆明市4個(gè)市區(qū)7個(gè)花鳥(niǎo)市場(chǎng)，共83個(gè)糞樣);LB固體培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母粉，均購(gòu)自昆明碩陽(yáng)科技有限公司。

1.2 大腸桿菌平板菌落計(jì)數(shù) 稱取0．1 g虎皮鸚鵡糞樣于 PE管中，用蛋白胨緩沖液進(jìn)行10－4～10－6倍稀釋，取20μL接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.3 大腸桿菌分離與鑒定 本研究用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基初步篩選大腸桿菌，后利用生化試驗(yàn)和PCR技術(shù)進(jìn)一步鑒定大腸桿菌。PCR鑒定(Uid和16S rRNA基因)所用引物參見(jiàn)文獻(xiàn)［5－6］。生化試驗(yàn)包括:糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)、甲基紅(M.R.)試驗(yàn)、V－P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)。

1.4 毒力基因及耐藥基因的擴(kuò)增 通過(guò)全菌裂解法提取大腸桿菌基因組DNA，并對(duì)12種毒力基因的流行情況和22個(gè)耐藥基因攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)。12種毒力基因包括:feo B、tra T、fim A、fyu A、irp－2、ro N、iuc C、tsh、iut A、iss、cva C和pap C，其擴(kuò)增引物及參數(shù)參考文獻(xiàn)［1］;22種耐藥基因包括:磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3);四環(huán)素類耐藥基因(tet A、tet B);氨基糖苷類耐藥基因［aac C2、aac C4、aad Al、aad A2、aac(3)－Ia、aac(3)－IIa、aph(3)－IIa］;氯霉素類耐藥基因(Catl、Cml A、Flor);β-內(nèi)酰胺類耐藥基因包括(CTX－M、SHV、OXA、TEM);喹諾酮類基因包括Qnr S;其他基因Gyra(QRDR)、Aac(6')-Ibcr。擴(kuò)增引物及參數(shù)參考文獻(xiàn)［7］。引物由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎皮鸚鵡糞便大腸桿菌活菌計(jì)數(shù) 從每個(gè)區(qū)花鳥(niǎo)市場(chǎng)采集虎皮鸚鵡糞樣，用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，得出:盤龍區(qū)、五華區(qū)、西山區(qū)、官渡區(qū)虎皮鸚鵡糞便中大腸桿菌平均數(shù)分別為: 1.61×108CFU/g、4.90×108CFU/g、2.03×106CFU/g、3．78×108CFU/g。從中可以看出，五華區(qū)虎皮鸚鵡糞便中大腸桿菌數(shù)最多，西山區(qū)最少。

2.2 大腸桿菌分離鑒定 本試驗(yàn)總共分離到71株細(xì)菌，最終鑒定出47株大腸桿菌，檢出率為66.20%。分離的大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上為黑色帶金屬光澤的菌落;革蘭染色均為陰性，生化鑒定為:能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能利用硝酸鹽，不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素和淀粉，不液化明膠，M.R.和吲哚呈陽(yáng)性，V－P試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)為陰性，均符合大腸桿菌的生化特性。大腸桿菌兩種基因的PCR鑒定均為陽(yáng)性，條帶大小與預(yù)計(jì)大小一致。

2.3 大腸桿菌毒力基因分布 本試驗(yàn)對(duì)47株大腸桿菌12個(gè)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。feo B、tra T及fim A基因檢出率都為100%;未檢出cva C基因。41．67%的毒力基因檢出率在50%以上。

表1 大腸桿菌相關(guān)毒力基因的分布

2.4 毒力基因數(shù)量分布情況 本試驗(yàn)中每株大腸桿菌同時(shí)攜帶不少于3種毒力基因，20株同時(shí)攜帶7～9種毒力基因。9株同時(shí)攜帶6種毒力基因，攜帶率最高(19．15%)(見(jiàn)表2)。

在HPI強(qiáng)毒力島標(biāo)志基因方面，fyu A+irp－2的檢出率為31．92%。3株同時(shí)攜帶 iss、irp－2、pap C、tsh 4種毒力基因。27株至少含有2種以下毒力基因:iut A、iss、tsh、iro N、irp－2。

表2 毒力基因數(shù)量分布情況

2.5 虎皮鸚鵡腸道大腸桿菌耐藥基因檢測(cè) 采用已建立的PCR方法，對(duì)47株E．coli分離株進(jìn)行22種耐藥基因的檢測(cè)(見(jiàn)表3)。Qnr S的檢出率最高(100%);aac(3)－Ia、OXA和SHV基因均未檢出。在耐磺胺類藥物的基因中，sul2基因的檢出率最高(80．85%);四環(huán)素類藥物以tet A基因的檢出率最高，為74．67%;氨基糖苷類以aad Al基因的檢出率最高，為63．83%;氯霉素類以Catl基因的檢出率最高，為97．87%;β－內(nèi)酰胺類以TEM基因的檢出率最高，為89．36%。

本試驗(yàn)中，分離株均攜帶5種以上耐藥基因，最大攜帶量為17，46株攜帶耐藥基因的量在8種以上，占全部菌株的97．87%。

表3 耐藥基因檢率

3 討論

3.1 大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)及鑒定 試驗(yàn)結(jié)果表明，昆明市五華區(qū)鸚鵡腸道糞便中大腸桿菌的菌落數(shù)最高，西山區(qū)最低，這可能與動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境、食物種類、衛(wèi)生狀況等因素有關(guān)。五華區(qū)花鳥(niǎo)市場(chǎng)屬于昆明市較大的花鳥(niǎo)市場(chǎng)，動(dòng)物種類多，客流量大，可能會(huì)促進(jìn)大腸桿菌的傳播。西山區(qū)動(dòng)物種類較少，偏向于花卉貿(mào)易，降低了大腸桿菌的傳播幾率。

本試驗(yàn)總共分離出71株細(xì)菌，最終鑒定出47株大腸桿菌。研究結(jié)合分離株的菌落特征、生化特征及PCR技術(shù)來(lái)鑒定大腸桿菌，因而，大腸桿菌的鑒定結(jié)果較可靠，滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

3.2 大腸桿菌毒力基因與耐藥基因的流行特征研究表明，大腸桿菌致病性與所其攜帶的毒力基因密切相關(guān)［8］，涉及的基因主要有 iut A、tsh、iro N、cva C、ast A、iss、irp2、pap C、iuc D、vat等。董向磊研究認(rèn)為，在iut A、iss、tsh、iro N、irp－2、cva C 6種毒力基因中，如果APEC分離株同時(shí)攜帶有2種以上毒力基因，則有89．74%的概率認(rèn)定該分離株具有致病性，誤差率為7．90%［1］。為此，本文研究了鸚鵡源大腸桿菌毒力基因的流行特征。以往研究［9－12］對(duì)APEC的毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)，認(rèn)為耶爾森菌強(qiáng)毒力島(HPI)攝鐵系統(tǒng)與致病性密切相關(guān)，是決定細(xì)菌的致病性重要的原因之一，irp2和fyu A是HPI的核心基因。本試驗(yàn)中毒力基因的檢出率均明顯低于以往的報(bào)道，說(shuō)明多數(shù)分離株的致病性可能較弱或沒(méi)有致病性。在以往試驗(yàn)中，研究菌株分離自發(fā)病禽類，而本試驗(yàn)糞樣來(lái)自于非發(fā)病禽，因而毒力基因檢出率偏低，但并不能說(shuō)明鸚鵡不攜帶致病性菌株，某些菌株攜帶毒力基因的種類較多(如4株分離株同時(shí)攜帶有 iut A、iss、tsh、iro N和irp－2基因)，具有一定的潛在致病性，因而，在鸚鵡大腸桿菌病的防治過(guò)程中不容忽視，特別是在環(huán)境復(fù)雜的花鳥(niǎo)市場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)衛(wèi)生管理。

隨著抗生素的應(yīng)用，大腸桿菌耐藥性日益嚴(yán)重，且其耐藥譜不斷增寬。大腸桿菌耐藥性與其耐藥基因的攜帶率有明顯的相關(guān)性，為此，耐藥基因的檢測(cè)對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐有重要的指導(dǎo)意義。在本試驗(yàn)中，分離株耐藥基因的攜帶率比張濟(jì)培［14］和張忠［7］的報(bào)道偏高，這可能與飼料中抗生素殘留和濫用抗生素有關(guān)。

綜上所述，昆明市區(qū)花鳥(niǎo)市場(chǎng)糞便大腸桿菌毒力基因攜帶率低，但耐藥基因的攜帶率較高。然而，虎皮鸚鵡是目前常見(jiàn)的寵物鳥(niǎo)之一，與人類接觸頻繁，大腸桿菌的毒力基因與耐藥基因很可能傳播到人類。本論文試驗(yàn)結(jié)果可為虎皮鸚鵡大腸桿菌病的預(yù)防提供理論支持和實(shí)踐借鑒。

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S852.61+2

B

0529-6005(2017)06-0100-03

2016-09-01

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(50097505);云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(51400605);西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(15108)

楊娟(1992-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫源疫病，E-mail:m18788189620@163．com

吳培福，E-mail:jed－wu2008@126．com