鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性試驗

蘇振霞，肖 輝，李 燦

(1．淮海工學院海洋學院，江蘇 連云港 222005;2．江蘇高校海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005;3．江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性試驗

蘇振霞1，2，肖 輝3，李 燦1

(1．淮海工學院海洋學院，江蘇 連云港 222005;2．江蘇高校海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005;3．江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

為探討水產養(yǎng)殖中氟喹諾酮類藥物殘留對水生生物的毒性效應，本試驗研究了鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性作用。試驗設置5個藥物濃度組和1個試驗對照組。結果顯示，各藥物濃度組對蛋白核小球藻的生長均有抑制作用，并且隨藥物處理濃度的增大，藻細胞的生長逐漸降低。葉綠素a、b含量隨著鹽酸恩諾沙星處理濃度的增大而下降。蛋白核小球藻在經過不同濃度的恩諾沙星處理96 h后，各組蛋白質含量均遠遠低于對照組，并且蛋白質含量隨著恩諾沙星濃度的升高逐漸減少。超氧化物歧化酶(SOD)活力和膜脂過氧化產物MDA則隨著恩諾沙星藥品濃度的升高而升高。表明鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻的脅迫引起其可溶性蛋白質含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力和膜脂過氧化產物MDA含量的變化。

鹽酸恩諾沙星;蛋白核小球藻;致毒效應

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)于20世紀90年代應用于水產業(yè)，由于該類藥物具有抗菌譜廣、口服給藥生物利用度高、不易產生耐藥性、殘留低、排泄快、毒副作用小等特點，已被廣泛應用于水生動物細菌性疾病的治療［1］。鹽酸恩諾沙星是合成的第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，1996年10月4日獲FDA批準，是動物專用的氟喹諾酮類藥物，也是最常用的抗菌藥物［2－4］。

蛋白核小球藻是淡水單細胞藻類中的主要天然餌料，是一種低等植物，在適當?shù)臏囟?、光照和營養(yǎng)條件下繁殖十分迅速。屬于綠藻門，色球藻目，小球藻屬［5］。不僅為水生動物提供豐富餌料，而且還可以降低水體中的氮和磷濃度，調節(jié)和優(yōu)化水體中浮游生物的群體結構，改善水體環(huán)境［6］。

我國目前對漁用藥物引起的生態(tài)環(huán)境問題還沒有引起足夠的重視，對漁用藥物的使用缺乏系統(tǒng)而深入的藥理學和毒理學試驗，因此養(yǎng)殖生產中普遍存在濫用藥物的現(xiàn)象。目前關于各種漁用藥物對水生生物的生態(tài)效應以及對水生生態(tài)環(huán)境的潛在影響尚未有明確清晰的認識和評價［7］。關于恩諾沙星的研究主要集中在其對病原菌的藥效學及藥物動力學的研究方面［8－10］，因此，本文以蛋白核小球藻作為試驗生物，就恩諾沙星對其毒性進行了探討。

1 材料與方法

1.1 供試藻種 蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB9。

1.2 供試藥品 鹽酸恩諾沙星，純度99%，浙江朗博藥業(yè)有限公司生產。SE培養(yǎng)液采用中國科學院水生生物研究所配方。

1.3 試驗方法

1.3.1 藻種的馴化 在無菌條件下，蛋白核小球藻在SE培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并進一步擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度25℃，光暗比12 h∶12 h，光強為2 000 Lx，靜止培養(yǎng)，每天定時人工搖動3次。鏡檢細胞正常，進入對數(shù)生長期時進行試驗。

1.3.2 預備試驗 取10 mL離心管，加入一定量的鹽酸恩諾沙星的系列質量濃度標準液和一定量的藻液，找出使水藻死亡的最低質量濃度和不產生死亡的最高質量濃度，以確定毒性試驗需要的質量濃度系列。

1.3.3 毒性試驗 從預試驗得到的濃度之間取5個濃度梯度，同時設空白對照組。在200 mL錐形瓶中加入藻液、鹽酸恩諾沙星系列標準液，在進行蛋白核小球藻的毒性試驗時，毒性試驗的藥物質量濃度系列為0、15.625、31.25、50、62.5、125 mg/L，每個質量濃度設3個平行樣，混勻后恒溫25℃培養(yǎng)，12 h光暗循環(huán)，光強2 000 Lx，每天定時振蕩3次。蛋白核小球藻細胞初始細胞濃度為2.5×106個/ mL。從試驗的條件和準確性出發(fā)，采用建立650 nm吸光度與藻細胞濃度的關系式的方法來確定藻細胞濃度。在0、24、48、72、96 h時于各瓶中取一定量藻液測定光密度，比較其與空白對照組細胞生長之間的差別。

1.3.4 光合色素含量的測定 用分光光度法測定藻色素含量。培養(yǎng)96 h，取10 mL藻液，4 000 r/min離心10 min，去上清，加入5 mL 90%丙酮，搖勻，在4℃冰箱中避光抽提24 h，再4 000 r/min離心10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以90%丙酮為對照，測量663、646 nm波長處抽提液的吸光值。葉綠素含量計算公式如下［11－12］:

C－a=12．21 OD663－2．81 OD646

C－b=20．13 OD646－5．03 OD663

式中:C-a為葉綠素a;C-b為葉綠素b。以μg/ mL表示。

1.3.5 蛋白質含量的測定 培養(yǎng)96 h后，取出10 mL藻液，4 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀物加入5 mL磷酸鹽緩沖液，搖勻，在4℃冰箱中避光抽提24 h，再4 000 r/min離心10 min，然后，超聲波破碎儀破碎10 min。再次4 000 r/min離心10 min。然

1.3.6 SOD含量的測定 蛋白核小球藻培養(yǎng)96 h后，取出10 mL藻液，離心，超聲波破碎儀破碎。利用超氧化物歧化酶試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，按照規(guī)定加入各個樣品，混勻，放置10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以無菌水為對照，測量550 nm波長處抽提液的吸光值。

SOD含量計算公式如下:

總SOD活力(U/mg·prot)后準確取樣品液，按照試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)上考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒操作說明書加入各個試劑，混勻，靜置10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以無菌水為對照，測量595 nm波長處抽提液的吸光值。

蛋白含量公式如下:

1.3.7 MDA含量的測定 蛋白小球藻培養(yǎng)96 h后，取出10 mL藻液，離心，超聲波破碎儀破碎10 min，按照試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測量MDA的步驟，將樣品處理好后，用保鮮膜扎緊試管，每個管扎一個孔95℃水浴加熱40 min，流水冷卻。離心10 min后，取上清液以無菌水作對照，1 cm光徑532 nm測量吸光值。

MDA含量的計算公式如下:

2 結果與分析

2.1 鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻生長的影響

1 鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻的生長效應動力學曲線

不同濃度鹽酸恩諾沙星處理后，蛋白核小球藻的生長曲線發(fā)生改變，結果如圖1所示，隨著鹽酸恩諾沙星處理時間延長，各濃度組的藻細胞生長速度減慢。低濃度的鹽酸恩諾沙星對藻細胞生長影響不大，甚至在較低濃度較短時間內呈現(xiàn)一定的“興奮效應”。添加藥物的試驗組在24 h后就表現(xiàn)出藥物抑制效應，但不同濃度的鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻產生不同程度的抑制效應，體現(xiàn)出良好的劑量-效應關系。在整個藥物處理過程中，高濃度組(≥50μg/mL)的藻生長受嚴重抑制，增長速度減緩，至96 h時與對照相比僅占對照組的68%，62%，43%。

2.2 鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻光合色素含量的影響 隨著培養(yǎng)時間的延長，各暴露組藻液與對照組相比，顏色明顯變淺，且鹽酸恩諾沙星濃度越高，藻液顏色越淺。暴露96 h后，各試驗組葉綠素a、葉綠素b含量如圖2所示。蛋白核小球藻的葉綠素a、葉綠素b含量均隨鹽酸恩諾沙星濃度的增加而下降。當鹽酸恩諾沙星濃度為15．625μg/ mL時，與對照組相比，葉綠素含量顯著減少，表明鹽酸恩諾沙星在低濃度時即對葉綠素有顯著抑制作用。其后隨著鹽酸恩諾沙星濃度的升高，葉綠素含量逐漸下降，其對藻細胞產生不可逆轉的影響。

圖2 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻光合色素含量的影響

2.3 鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻可溶性蛋白含量的影響 蛋白質是細胞代謝過程中的催化劑，是細胞重要的結構和功能物質，蛋白質的含量可以反映出細胞活力的高低。蛋白核小球藻在經過不同濃度的恩諾沙星處理96 h后，各組蛋白質含量均遠遠低于對照組，各個處理組間，隨著恩諾沙星濃度的升高蛋白質含量逐漸減少。尤其恩諾沙星濃度為62.5 μg/mL，蛋白質含量極速遞減，在濃度為125μg/mL時候，小球藻中的蛋白含量最低。

圖3 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻蛋白質含量的影響

2.4 鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻SOD的影響從圖4可以看出，隨著恩諾沙星藥品濃度的升高，小球藻經藥品處理96 h后，SOD活力隨著藥品濃度的升高而升高，當濃度到125μg/mL時，SOD活力極速上升。主要的原因是植物體在逆境脅迫下［13］，會發(fā)生大量活性氧的積累，對細胞造成危害。SOD是清除生物體內活性氧的關鍵酶，因而SOD活性的變化可以反映出生物體的受迫害程度。隨著藥品濃度的增加，其對藻體產生脅迫的程度加大，SOD活性增強，同時也激發(fā)藻體合成更多的SOD來清除過剩的活性氧。

圖4 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對SOD含量的影響

在藥物濃度最高時，SOD活力是其對照組的8倍，可見植物體因為產生了大量的活性氧從而產生了大量的SOD，由此推斷，生物體受破壞程度隨著恩諾沙星濃度增加而加重，在濃度為125μg/mL時達到最大。

2.5 鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻MDA的影響

膜脂過氧化的產物有二烯軛合物、丙二醛(MDA)、乙烷、脂類過氧化物等，其中丙二醛是膜脂過氧化的最重要的分解產物之一。植物在逆境脅迫下，由于其體內活性氧的積累，可能發(fā)生膜脂過氧化作用［13－14］。因而，測定MDA可以了解膜脂過氧化的程度，可以間接測定出膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，隨著恩諾沙星濃度的增加，蛋白核小球藻MDA含量先逐漸緩慢的升高，在藥品濃度達到62.5μg/mL時迅速上升，到濃度125μg/mL時MDA含量達到最大，與對照組差異顯著，為對照組的近3倍。由此可以表明，鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻的脅迫引起其膜脂過氧化產物MDA含量的增加，從而說明隨著恩諾沙星濃度增加脂質過氧化強度和膜系統(tǒng)受傷害程度也加深，在藥品濃度為125μg/mL時候，其受傷害程度達到最大。

圖5 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對MDA含量的影響

3 小結

本試驗主要研究了恩諾沙星對小球藻的急劇毒性，從分析小球藻的生長狀況、光合色素含量、蛋白含量、SOD含量、MDA含量這幾方面研究分析了恩諾沙星對小球藻的毒性作用。結果顯示，隨著藥品濃度的增加，小球藻內可溶性蛋白的含量逐漸減少，說明細胞活力隨藥品濃度加大而減少;而SOD、MDA與藥品濃度之間呈現(xiàn)負相關，說明隨著藥品濃度的加大，生物體活性氧增多，受破害程度加重; MDA與藥品濃度的負相關表明，隨著恩諾沙星濃度增加脂質過氧化強度和膜系統(tǒng)受傷害程度也加深。

本試驗僅對鹽酸恩諾沙星對蛋白核小球藻的急性毒性進行了研究，且在室內模擬條件下進行，無法反映出完整生態(tài)環(huán)境對藻生長的影響，抗生素對藻的毒性效應受到多種環(huán)境因子制約并與藻的種類有關，抗生素對藻類的脅迫作用是一個十分復雜的生理生化過程。本文僅是鹽酸恩諾沙星對藻類毒性效應的初步研究，對于抗生素脅迫下更復雜的生理生化過程還有待進一步探討。本試驗的研究成果可以為恩諾殺星在水產養(yǎng)殖中實際應用提供一定的參考。

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Toxic Effects of Enrofloxacin hydrochloride on Chlorella pyrenoidosa

SU Zhen-xia1，2，XIAO Hui3，LI Can1

(1．Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;2．Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology，Lianyungang 222005，China;3．Jiangsu Marine Resources Development Research Insititute，Lianyungang 222005，China)

In order to study the toxic effects of fluoroquinolones on the fresh algae，Chlorella pyrenoidosa was exposed to Enrofloxacin hydrochloride of five concentrations(15．625，31．25，50，62．5，125 mg·L－1)and a control．Results showed that，Enrofloxacin hydrochloride had inhibition effect on the growth of Chlorella pyrenoidosa compared with the control．With the increase of concentrations，the growth of algae cells gradually decreased correspondingly．Enrofloxacin hydrochloride had the same effects on the contents of the chlorophyll-a，chlorophyll-b，that is，the contents of the photosynthetic pigments decreased．The activity of Superoxide dismutase(SOD)and Malondialdehyde(MDA)were increased and protein content reduced with increased concentration of Enrofloxacin．

Enrofloxacin hydrochloride;Chlorella pyrenoidosa;Toxic effects

8

A

0529-6005(2017)06-0096-04

2016-12-02

江蘇省優(yōu)勢學科建設工程資助項目;江蘇省海資院開放課題(JSIMR201314，JSIMR201423);淮海工學院自然科學基金(Z2014006)

蘇振霞(1978-)，女，講師，博士，主要從事水產藥物生態(tài)毒理學研究，E-mail:qyxx79@126．com