當(dāng)歸多糖對(duì)雞抗氧化功能的影響

靳錄洋，徐小芳，谷新利

(1．新疆石河子工程技術(shù)學(xué)校，新疆 石河子 832000;2．石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

當(dāng)歸多糖對(duì)雞抗氧化功能的影響

靳錄洋1，徐小芳2，谷新利2

(1．新疆石河子工程技術(shù)學(xué)校，新疆 石河子 832000;2．石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

為了觀察不同濃度的當(dāng)歸多糖(ASP)對(duì)正常羅曼雛雞血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性及丙二醛(MDA)含量的影響。將80只1日齡健康羅曼雛雞隨機(jī)分為4組，每組20只。分別于1日齡皮下注射生理鹽水以及不同濃度的ASP(12．5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL)，0．2 mL/只，連續(xù)注射7 d，分別在第7、14、21、28、35、42天采血，測(cè)定血清中SOD、GSH－Px、CAT、GR的活性及MDA含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用ASP后，血清SOD、GSHPx、CAT、GR活性均表現(xiàn)顯著升高(P＜0．05)，MDA含量均表現(xiàn)顯著降低(P＜0．05)。結(jié)論是ASP可提高雞的抗氧化能力。

ASP;抗氧化;雞

正常情況下自由基的產(chǎn)生和消除保持著動(dòng)態(tài)平衡，任何增強(qiáng)氧化作用和(或)降低抗氧化能力的因素均可打破這一平衡，致氧自由基增加［1］。機(jī)體抗氧化作用增強(qiáng)，可以減少自由基對(duì)機(jī)體生物膜完整性的破壞，從而提高機(jī)體免疫力和抗病能力［2］。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)歸多糖具有調(diào)節(jié)免疫［3］、影響造血系統(tǒng)［4］、抗病毒［5］、抗腫瘤［6］和抗氧化［7］等多種功能。本試驗(yàn)從當(dāng)歸中提取當(dāng)歸多糖，以探討當(dāng)歸多糖在不同濃度、不同時(shí)間的抗氧化作用，為研究開發(fā)新藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥 當(dāng)歸購(gòu)自石河子市醫(yī)藥公司，粉碎，過40目篩，備用。

1.2 試劑 無水葡萄糖(天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠);苯酚(天津市化學(xué)試劑三廠);乙醇(天津市化學(xué)試劑二廠);濃硫酸(烏魯木齊化學(xué)試劑廠)，以上試劑均為AR級(jí)。血清中超氧化物歧化酶(批號(hào):20070123);谷胱甘肽過氧化物酶(批號(hào): 20070124);過氧化氫酶(批號(hào):20070127);谷胱甘肽還原酶(批號(hào):20070127);丙二醛(批號(hào):20070127)。

1.3 儀器 CQ－250型超聲波提取儀(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠);RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);BS2202S電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);SHB－B95A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);722S可見光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司);DK－S28型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);XW－80A旋渦混合器(寧波新芝生物科技股份有限公司); TDL－5臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);YXQ－LS－30S11立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.4 中藥多糖的提取 稱取當(dāng)歸200．0 g，粉碎，加入20倍蒸餾水，浸泡12 h后在超聲波提取儀中超聲提取30 min，過濾。濾渣中加入適量蒸餾水，再超聲提取30 min，過濾。濾渣中加入適量蒸餾水，再超聲提取30 min，過濾后合并3次濾液。將濾液離心4 800 r/min離心10 min，取上清液;上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃水浴蒸發(fā)濃縮;將水浴降溫至10℃，關(guān)抽氣泵，放冷凝水，儀器冷卻后關(guān)開關(guān);倒出濃縮物，用蒸餾水涮洗濃縮瓶，一起倒入大燒杯中;緩慢加入95%乙醇，并不停攪拌，防止出現(xiàn)片狀沉淀(約4～5倍乙醇)，放入冰箱內(nèi)4℃靜置過夜;次日再用95%乙醇二次醇沉，放入冰箱內(nèi)4℃靜置過夜;次日將沉淀抽濾，后放入真空干燥箱中干燥，稱重，得當(dāng)歸多糖29．775 g(多糖含量27．73%)。

1.5 中藥多糖含量測(cè)定

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取無水葡萄糖12．1 mg加蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中，配成0．121 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.5.2 5%苯酚溶液的配制 稱取苯酚5g加蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中，配成5%苯酚溶液，備用。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0．2、0．4、0．5、0．6、0．75 mL置于20 mL的干燥試管中，依次加蒸餾水使體積均為1．0 mL，另取1．0 mL蒸餾水作空白對(duì)照。向各管再分別加入5%苯酚溶液2．0 mL，搖勻，迅速滴加濃H2SO45．5 mL，充分搖勻，放入60℃水浴，30 min，在分光光度計(jì)上讀取波長(zhǎng)為490 nm的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)處理得回歸方程:A=0．008 6C+0．005 4(R2= 0.999 5)。

1.5.4 提取物的含量測(cè)定 精密稱取干燥至恒重的多糖12．1 mg，置于100 mL容量瓶中，加少量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，配成0．121 mg/mL多糖溶液，備用。精密吸取樣液1 mL，另取1．0 mL蒸餾水作空白對(duì)照。向各管再分別加入5%苯酚溶液2．0 mL，搖勻，迅速滴加濃H2SO45．5mL，充分搖勻，放入60℃水浴，30 min，在分光光度計(jì)上讀取波長(zhǎng)為490 nm的吸光度值。當(dāng)歸多糖的吸光度為0．294，將多糖的吸光度依次帶入回歸方程:A=0．008 6C+0.005 4得C，再用C/0．121，得當(dāng)歸多糖含量27.73%。

1.6 試驗(yàn)用雞及設(shè)計(jì) 試驗(yàn)中注射劑量均指經(jīng)過換算實(shí)際進(jìn)入雛雞體內(nèi)純多糖的含量。多糖注射前用蒸餾水溶解，配成溶液，115℃，30 min高壓滅菌，備用。

試驗(yàn)雞由石河子市養(yǎng)雞場(chǎng)提供，臨床檢查健康。80只1日齡健康羅曼雛雞隨機(jī)分為4組，每組20只。1日齡開始用藥。方案如下:

Ⅰ組: 皮下注射生理鹽水0．2 mL/只，連續(xù)注射7 d。

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組: 皮下注射ASP濃度分別為12．5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL，0．2 mL/只，連續(xù)注射7 d。

1.7 飼養(yǎng)管理 購(gòu)自新疆天康飼料廠的飼料常規(guī)飼養(yǎng)，4組雞的飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)條件、環(huán)境、飼料品質(zhì)及飼養(yǎng)管理均一致。

1.8 檢測(cè)項(xiàng)目及方法 血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、丙二醛測(cè)定均采用南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒。

各組雞分別在第7、14、21、28、35、42天采血(每組隨機(jī)抽取10只)，測(cè)定血清中SOD、GSH－Px、CAT、GR的活性及MDA含量(均按照其說明書進(jìn)行操作)。

1.9 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用SPSS13．0軟件統(tǒng)計(jì)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，顯著性分析采用方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASP對(duì)SOD活性的影響 表1表明，皮下注射ASP，多糖組都能不同程度的提高血清中SOD的活性，第7、14、21、28天都有不同程度的提高，之后逐漸降低。Ⅱ組與Ⅰ組相比，在第7天時(shí)差異不顯著，第21、35、42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第14、28天時(shí)差異極顯著(P＜0．01);Ⅲ組與Ⅰ組相比，在第7天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第14、21、28、35、42天時(shí)差異極顯著(P＜0．01);Ⅳ組與Ⅰ組相比，在第7天時(shí)差異不顯著，第14、28、35、42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第21天時(shí)差異極顯著(P＜0．01)。

表1 不同濃度的多糖對(duì)SOD活性的影響

2.2 ASP對(duì)MDA含量的影響 表2表明，皮下注射ASP，多糖組都能不同程度的降低血清中MDA的含量，第7、14、21、28天都有不同程度的降低，之后逐漸增大。Ⅱ組與Ⅰ組相比，在第21、28天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第7、14、35、42天時(shí)差異不顯著(P＞0．05);Ⅲ組與Ⅰ組相比，在第7、35、42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第14、21、28天時(shí)差異極顯著(P＜0．01);Ⅳ組與Ⅰ組相比，在第14、21、28天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第7、35、42天時(shí)差異不顯著(P＞0．05)。2.3 ASP對(duì)GSH－Px活性的影響 表3表明，皮下注射ASP，多糖組都能不同程度的提高血清中GSH－Px的活性，第7、14、21、28天都有不同程度的提高，之后逐漸降低。Ⅱ組與Ⅰ組相比，在第35、42天時(shí)差異不顯著(P＞0．05)，第7、14天時(shí)差異顯著(P＜0.05)，第21、28天時(shí)差異極顯著(P＜0.01);Ⅲ組與Ⅰ組相比，在第42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第7、14、21、28、35天時(shí)差異極顯著(P＜0．01);Ⅳ組與Ⅰ組相比，在第7、14、35、42天時(shí)差異不顯著(P＞0．05)，第21、28天時(shí)差異極顯著(P＜0．01)。

表2 不同濃度的多糖對(duì)MDA活性的影響

表3 不同濃度的多糖對(duì)GSH－Px活性的影響

2.4 ASP對(duì)CAT活性的影響 表4表明，皮下注射ASP，多糖組都能不同程度的提高血清中CAT的活性，第7、14、21、28天都有不同程度的提高，之后逐漸降低。Ⅱ、Ⅳ組與Ⅰ組相比，在第42天時(shí)差異不顯著(P＞0．05)，第7、14、35天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第21、28天時(shí)差異極顯著(P＜0．01);Ⅲ組與Ⅰ組相比，在第7、42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第14、21、28、35天時(shí)差異極顯著(P＜0．01)。

表4 不同濃度的多糖對(duì)CAT活性的影響

2.5 ASP對(duì)GR活性的影響 表5表明，皮下注射ASP，多糖組都能不同程度的提高血清中GR的活性，第7、14、21、28天都有不同程度的提高，之后逐漸降低。Ⅱ組與Ⅰ組相比，在第7、14、21、35、42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第28天時(shí)差異極顯著(P＜ 0．01);Ⅲ組與Ⅰ組相比，在第14、21、28、35、42天時(shí)差異極顯著(P＜0．01)，第7天時(shí)差異不顯著(P＞0．05);Ⅳ組與Ⅰ組相比，在第7天時(shí)差異不顯著(P＞0．05)，第14、35、42天時(shí)差異顯著(P＜0．05)，第21、28天時(shí)差異極顯著(P＜0．01)。

表5 不同濃度的多糖對(duì)GR活性的影響

3 討論

3.1 皮下注射不同濃度的ASP后，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清中SOD、GR、GSH－Px、CAT的活性均表現(xiàn)升高，在第28天時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下降，而MDA的含量均表現(xiàn)降低，在第28天時(shí)降到最低，之后逐漸升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ASP能明顯提高雞血清中SOD、GR、GSH－Px、CAT活性，并能明顯降低雞血清中MDA含量。劉少平［8］等研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。提示ASP具有抗氧化活性。

3.2 濃度之所以是一個(gè)重要因素，是因?yàn)榍宄杂苫俾适怯善錆舛群退俾食?shù)決定的?？寡趸瘎┑幕钚栽谏矬w內(nèi)和體外常常有很大區(qū)別，造成這種差別的重要原因之一是抗氧化劑和底物在生物膜中所處的微環(huán)境與體外不同。決定抗氧化能力的另一主要因素是抗氧化劑引發(fā)自由基產(chǎn)生。當(dāng)抗氧化劑清除自由基時(shí)，轉(zhuǎn)換成其他自由基，也可能會(huì)發(fā)生某些化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)決定了整個(gè)體系的抗氧化能力，有時(shí)高濃度的抗氧化劑還會(huì)起到促氧化作用［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，皮下注射不同濃度的ASP后，血清中SOD、CAT、GSH－Px、GR的活性以及MDA的含量表現(xiàn)均以濃度為25 mg/mL組最優(yōu)，而濃度為50 mg/mL組與12．5 mg/mL組相比其活性時(shí)高時(shí)低。提示ASP的抗氧化活性不是劑量越大越好，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

3.3 本試驗(yàn)結(jié)果表明，皮下注射不同濃度的ASP后，血清中SOD、GSH－Px、GR、CAT活性在第7、14、21、28天時(shí)逐漸升高，之后逐漸下降;血清中MDA含量在第7、14、21、28天時(shí)逐漸降低，之后逐漸升高。提示當(dāng)歸多糖體內(nèi)作用時(shí)間與其抗氧化活性具有一定相關(guān)性，但其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

3.4 皮下注射不同濃度的ASP后，在第42天時(shí)，血清中GSH－Px、CAT活性以及MDA含量與對(duì)照組相比，濃度為12．5 mg/mL、50 mg/mL組差異不顯著。提示在測(cè)定血清中GSH－Px、CAT活性以及MDA含量時(shí)，濃度為12．5 mg/mL、50 mg/mL組在第42天已經(jīng)恢復(fù)到正常值。

3.5 本試驗(yàn)結(jié)果表明，皮下注射不同濃度的ASP后，血清中SOD、GR的活性在第42天時(shí)，與對(duì)照組相比，濃度為12．5 mg/mL、50 mg/mL組差異顯著(P＜0．05)，濃度為25 mg/mL組差異極顯著(P＜0．01)，提示血清中SOD、GR活性的測(cè)定時(shí)間需要延長(zhǎng);血清中GSH－Px、CAT的活性以及MDA的含量在第42天時(shí)，與對(duì)照組相比，濃度為25 mg/mL組差異顯著(P＜0．05)，提示測(cè)定血清中GSHPx、CAT活性以及降低 MDA含量時(shí)，濃度為25 mg/mL組測(cè)定時(shí)間需要延長(zhǎng)。

4 結(jié)論

ASP能使血清中總超氧化物歧化酶(TSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)的活性明顯升高，使丙二醛(MDA)的含量明顯降低。提示ASP作為天然抗氧化劑，具有很好的研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用前景。

［1］ Grisham M B，Granger D N，lefer D J．Modulation of leukocyteendothelial interactions by reactive metabolites ofoxygen and nitrogen:relevance to ischemic heartdisease［J］．Free Radic Biol Med，1998，25(4－5):404-433．

［2］ 胡忠澤，金光明，王立克，楊久峰．茶多糖對(duì)肉仔雞免疫功能和抗氧化能力的影響［J］．茶葉科學(xué)，2005，25(1):61-64．

［3］ 凌小曼，丁虹，羅順德，等．當(dāng)歸多糖對(duì)血瘀證動(dòng)物免疫功能和抗氧化功能的影響［J］．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2002，22(10): 584-586．

［4］ 李靜，王亞平．當(dāng)歸多糖對(duì)骨髓巨噬細(xì)胞的影響及其與造血調(diào)控的關(guān)系［J］．中草藥，2005，36(1):69-72．

［5］ 胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等．10種中藥成分對(duì)CEF的增殖和抵抗NDV感染的影響［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35(3):301-305．

［6］ 駱傳環(huán)，崔玉芳，黃榮清，等．當(dāng)歸多糖的制備及抑瘤作用［J］．科學(xué)技術(shù)與工程，2003，3(6):551-552．

［7］ 李貴榮，呂昌銀，楊勝圓．當(dāng)歸多糖清除活性氧自由基作用的研究［J］．南華大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版)，2002，16(3):18-20．

［8］ 劉少平，董衛(wèi)國(guó)，吳東方．當(dāng)歸多糖對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中氧自由基的影響［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13(22):28-31．

［9］ 左玉，謝文磊，王會(huì)．生物抗氧化劑抗氧化作用的研究進(jìn)展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(1):62-67．

S853.72

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0529-6005(2017)06-0076-04

2016-12-15

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士基金(2007JC09)

靳錄洋(1979-)，男，講師，本科，主要從事臨床獸醫(yī)診療技術(shù)研究，E-mail:450562450@qq．com