Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片檢測(cè)方法的建立

朱余軍，饒 丹，叢 鋒，伍妙梨，袁 文，王 靜，練月曉，黃碧洪，徐鳳嬌，劉助紅，尹雪琴，黃 韌，張 鈺，陳梅麗，郭鵬舉

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663)

Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片檢測(cè)方法的建立

朱余軍，饒 丹，叢 鋒，伍妙梨，袁 文，王 靜，練月曉，黃碧洪，徐鳳嬌，劉助紅，尹雪琴，黃 韌，張 鈺，陳梅麗，郭鵬舉

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663)

為了建立一種快速、特異、靈敏的檢測(cè)I群禽腺病毒的液相基因芯片方法。根據(jù)Hexon基因序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物5'端加TAG序列，下游引物5'端加生物素，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與鏈霉素親和蛋白、磁珠37℃孵育30 min，通過(guò)Luminex200儀器分析。用所建立的液相基因芯片方法進(jìn)行特異性、靈敏度、重復(fù)性及病料樣品的檢測(cè)。結(jié)果該方法的特異性強(qiáng);檢測(cè)的敏感性可達(dá)1×102copies/μL;批內(nèi)批間的變異系數(shù)都在5%以下;檢測(cè)結(jié)果與SYBR Green I熒光PCR方法100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特異性好、靈敏高、重復(fù)性好，可用于 I群禽腺病毒的檢測(cè)。

Ⅰ群禽腺病毒(AAV);Hexon基因;液相基因芯片

禽腺病毒(AAV)是禽類一種常見(jiàn)的病毒，屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬。禽腺病毒根據(jù)其抗原性不同可分為3個(gè)群，進(jìn)一步利用RFLP技術(shù)把I群禽腺病毒劃分為A-E5個(gè)基因型，根據(jù)中和試驗(yàn)可將其分為12個(gè)血清型(FAdV-1-FAdV 8a，8b-11)，I群禽腺病毒具有相同的群抗原，該病毒主要表現(xiàn)為包涵體肝炎、嚴(yán)重性貧血、呼吸道癥狀、出血性腸炎和產(chǎn)蛋量下降［1－2］。該病給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失。液相芯片既可以檢測(cè)核酸又可以檢測(cè)蛋白質(zhì)，應(yīng)用范圍非常廣泛［3－4］。具有高通量大、靈敏度高、靈活等特點(diǎn)，使得該技術(shù)在基礎(chǔ)研究及檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本研究根據(jù)Hexon基因的保守序列設(shè)計(jì)了1對(duì)檢測(cè)I群禽腺病毒的特異性引物，系國(guó)內(nèi)外首次建立I群禽腺病毒的液相基因芯片檢測(cè)方法，為I群禽腺病毒的流行病調(diào)查、防治等提供一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 毒株 12個(gè)血清型的禽腺病毒由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)尹燕博教授惠贈(zèng);產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)、傳染性腔上囊病病毒(IBDV)、禽呼腸孤病毒(REO)、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)和馬立克病病毒(MDV)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Premix Ex TaqTMDNA聚合酶、pMD19-T克隆載體、DL-2000 DNA Marker、6×Loading Buffer，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;熒光編碼微球MagPlex-TAG022、鞘液，購(gòu)自 luminex公司;Streptavidin RPhycoerythrin(SAPE)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 主要儀器 luminex200儀器，檢測(cè)軟件為xPONENT 3.1版本，核酸擴(kuò)增儀，購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中Hexon基因的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物(AAV-F1、AAV-F2)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為191 bp(表1)，其中AAV-F1的5'端通過(guò)間隔臂(Spacer 18)添加有tag序列，tag序列能與微球MTAG-A022上所連的antitag序列反向互補(bǔ)，AAV-F2的5'端標(biāo)記生物素。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。均經(jīng)過(guò)HPLC純化，用雙蒸水溶解成10μmol/L儲(chǔ)存液備用。

表1 所用的引物及TAG序列

1.5 方法

1.5.1 病毒DNA的提取 按照病毒DNA提取試劑盒的操作步驟提取禽腺病毒DNA，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 Hexon質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 通過(guò)PCR擴(kuò)增Hexon基因片段，將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提備用。

1.5.3 PCR反應(yīng)體系的建立 PCR擴(kuò)增體系(25μL)如下:Premix Ex TaqTMDNA聚合酶(2×) 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，補(bǔ)水至25μL。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.5.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、熒光編碼微球和鏈霉素親和-藻紅蛋白雜交 雜交緩沖液將熒光微球稀釋至125個(gè)/μL;取20μL稀釋的熒光編碼微球，5μL PCR產(chǎn)物，75μL SAPE使用液于一PCR管中，37℃孵育30 min，在Luminex200儀器上讀取熒光中位數(shù)(MFI)值。

1.5.5 結(jié)果判定 最低檢測(cè)閾值(cutoff值)的確定:選取10只健康雞組織樣品(每個(gè)樣品平行重復(fù)3次)，分別讀取MFI值并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的MFI值設(shè)定其為cutoff值［5］。當(dāng)檢測(cè)樣品的MFI值大于cutoff值時(shí)，判斷該試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效且為陽(yáng)性樣本;否則，為陰性。

1.5.6 特異性試驗(yàn) 利用上述方法，對(duì)12個(gè)血清型的I群禽腺病毒、EDSV、IBDV、REO、IBV、MDV和空白對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.5.7 靈敏度試驗(yàn) 將已知濃度為1×1010copies/ μL的pMD19-T Hexon質(zhì)粒做10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度取2μL作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定本方法的敏感性。

1.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 選用1×107和1×105copies/ ul的作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.5.9 病料樣品的檢測(cè) 應(yīng)用上述液相基因芯片方法，對(duì)廣東省某雞場(chǎng)送檢的60份雞組織病料樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用SYBR Green I熒光PCR［6］法復(fù)檢。比較這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 分別以12個(gè)血清型的I群禽腺病毒DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，均能擴(kuò)出191 bp的條帶(圖1)。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 本試驗(yàn)的最低檢測(cè)閾值為250。應(yīng)用本試驗(yàn)建立的液相基因芯片方法進(jìn)行檢測(cè)，12個(gè)血清型的Ⅰ群禽腺病毒均為陽(yáng)性，而EDSV、IBDV、REO、IBV、MDV和空白對(duì)照均為陰性，表明所建立的液相基因芯片方法具有良好的特異性，與其他檢測(cè)對(duì)象無(wú)交叉反應(yīng)(圖2)。

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)10倍系列稀釋的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的液相基因芯片方法的靈敏度達(dá)1×102copies/μL(圖3)。

圖1 Ⅰ群禽腺病毒12個(gè)血清型PCR結(jié)果

圖2 液相基因芯片方法特異性檢測(cè)結(jié)果

圖3 液相基因芯片方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)重復(fù)性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表2)，批內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)在4%以下，批間試驗(yàn)的變異系數(shù)在5%以下，表明該方法的穩(wěn)定，結(jié)果可靠，具有可重復(fù)性。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 病料樣品的檢測(cè) 使用新建立的液相基因芯片方法從60份病料樣品中檢出陽(yáng)性樣本33份(陽(yáng)性率為55%)，液相基因芯片檢測(cè)結(jié)果與 SYBR Green I熒光PCR檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

3 討論

液相芯片檢測(cè)技術(shù)是一種特異、敏感、快速、高通量的檢測(cè)技術(shù)?；贚uminex xMAP系統(tǒng)的液相芯片技術(shù)是惟一得到美國(guó) FDA批準(zhǔn)的芯片類技術(shù)［6］。液相基因芯片檢測(cè)技術(shù)是將多重?zé)晒饷庖叻治?MFIA)和TAG技術(shù)結(jié)合起來(lái)，TAG技術(shù)使用Luminex專有的通用標(biāo)簽，通過(guò)標(biāo)簽序列與反標(biāo)簽序列的專一性互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行核酸試驗(yàn)優(yōu)化，產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和分子診斷化驗(yàn)。該技術(shù)避免了過(guò)去還需要將合成的寡核苷酸序列偶聯(lián)到微球上的復(fù)雜操作，有效地降低了成本和勞動(dòng)力，同時(shí)大大地縮短了檢測(cè)的時(shí)間。

I群禽腺病毒有12個(gè)血清型，各血清型毒株的Hexon基因較為保守。因此，針對(duì)Hexon基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，該方法敏感性高，可達(dá)1×102copies/μL;特異性強(qiáng)，對(duì)EDSV、IBDV、REO、IBV、MDV等均無(wú)交叉反應(yīng);該方法具有很好的重復(fù)性，批內(nèi)、批間試驗(yàn)的變異系數(shù)均在5%以下。本試驗(yàn)無(wú)需電泳，避免了電泳過(guò)程中的污染。應(yīng)用該方法對(duì)60份雞組織病料樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為55%，檢測(cè)結(jié)果與SYBR Green I熒光PCR法100%相符。本試驗(yàn)建立的I群禽腺病毒的液相基因芯片檢測(cè)方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

［1］ 殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)［M］．2版．北京:科學(xué)出版社，1997．

［2］ Domermuth C H，Weston C R，Cowen B S，et al．Incidence and distribution of avian adenovirus group II splenomegaly of chickens［J］．Avian Disease，1980，24(3):591-599．

［3］ Martins T B，Burlingame R，Von Muhlen C A，et al．Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens［J］．Clin Diagn Lab Immun，2004，11(6):1 054．

［4］ Lash G E，Scaife P J，Innes B A，et al．Comparison of three multiplex cytokine analysis systems:Luminex，SearchLightTM and FAST Quant［J］．J Immun Meth，2006，309:205-208．

［5］ Crowther J R．Validation of Diagnostic Tests for Infectious Diseases［M］．Volume 149 ofthe series Methods in Molecular Biology，The ELISA Guidebook，2001:301-345．

［6］ 謝明星，彭小莉，苗春柳，等．牛白細(xì)胞黏附缺陷病液相基因芯片檢測(cè)方法的建立［J］．繁殖育種，2013，17:48-52．

Development of a magnetic beads suspension array for the detection of aviadenovirus group I

ZHU Yu-jun，RAO Dan，CONG Feng，WU Miao-li，YUAN Wen，WANG Jing，LIAN Yue-xiao，HUANG Bi-hong，XU Feng-jiao，LIU Zhu-hong，YIN Xue-qin，HUANG Ren，ZHANG Yu，CHEN Mei-li，GUO Peng-ju

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangzhou 510663，China)

To develop a rapid，specific and sensitive magnetic beads suspension array for the detection of Aviadenovirus group I (AAV)．According to the hexon gene sequences，a pair of specific primers were designed for amplified Aviadenovirus group I．The forward primer was designed with a unique TAG sequence at5’end，and the reverse primer was biotin-labeled at5’end．After amplifying the PCR fragment，the product，Streptavidin R-Phycoerythrin and magnetic beads were incubated at37℃ for 30 min．The resuls were analyzed using luminex 200 instrument．The specificity，sensitivity，reproducibility and clinical samples for this assay were evaluated．The assay was specific for 12 serotypes of Aviadenovirus group I，and there was nonspecific reactions with other viruses．Sensitivity analysis showed that the limit of detection of the developed magnetic beads suspension array was 1×102copies/ul of plasmid DNA．From the coefficient of variation analysis，the intra-and inter-assay coefficient of variation was lower than 5．Compared to SYBR Green I real-time PCR，there had a same detection rate(55%)of60 clinical samples．These results show that the assay is specific，sensitive，repeatable and flexible，and can be utilized for the detection of Aviadenovirus group I．

Aviadenovirus group I;Hexon;magnetic beads suspension array

CHEN Mei-li

S855.3

A

0529-6005(2017)06-0050-03

2016-09-14

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A040403065);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B070701003);國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAI07B00)

朱余軍(1988)，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail:837895642@qq.com

陳梅麗，E-mail:chml@gdlami.com