副豬嗜血桿菌菌體蛋白的提取及蛋白質(zhì)雙向電泳方法建立

謝宇舟，李 軍，馮世文，彭 昊，潘 艷，禤雄標(biāo)，陳澤祥，許力干，楊 威

(1．廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001;2．廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

副豬嗜血桿菌菌體蛋白的提取及蛋白質(zhì)雙向電泳方法建立

謝宇舟1，2，李 軍1，2，馮世文1，2，彭 昊1，2，潘 艷1，2，禤雄標(biāo)1，2，陳澤祥1，2，許力干1，2，楊 威1，2

(1．廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001;2．廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

為了建立副豬嗜血桿菌菌體蛋白的雙向電泳方法，獲得背景清晰、蛋白分辨率高的雙向電泳圖，對(duì)細(xì)菌裂解方法、蛋白上樣量、IPG膠條選擇等關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，采用超聲(9．9 s/停頓9．9 s，200 W)冰浴破碎細(xì)菌，5 min后，裂解液溶解沉淀，4℃過(guò)夜裂解提取菌體蛋白，以0．6 mg菌體蛋白上在pH值3～10非線性IPG膠條上進(jìn)行電泳，最后考馬斯亮藍(lán)G250染色，獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，效果最好，隨機(jī)挑取14個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，證實(shí)均為副豬嗜血桿菌菌體蛋白。

副豬嗜血桿菌;雙向電泳;菌體蛋白;蛋白質(zhì)組學(xué)

副豬嗜血桿菌(HPS)屬巴斯德菌科嗜血桿菌屬成員，是革拉澤病(Glasser's disease)的病原。HPS通常定植在健康仔豬的鼻腔、扁桃體和氣管前段等上呼吸道部位，與宿主呈共棲狀態(tài)。當(dāng)仔豬感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬圓環(huán)病毒2型等免疫抑制病或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HPS可以突破宿主的免疫屏障保護(hù)，引起斷奶仔豬發(fā)生纖維素性漿膜炎、腦膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，病死率較高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成一定的威脅［1］。

HPS分為15個(gè)血清型，此外，還有約20%的菌株未能定型，HPS血清型的多樣性是造成其臨床癥狀差異的主要原因［2］。

蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳 (Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2－DE)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的平臺(tái)，它通過(guò)等電聚焦電泳和SDSPAGE分離將細(xì)菌強(qiáng)、弱毒力菌株的各種菌體蛋白在二維平面上分離后，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)兩者的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，找出毒力相關(guān)的蛋白，為闡明其致病機(jī)制提供線索［3］。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)HPS菌體蛋白提取、蛋白上樣量以及第一向等電聚焦電泳pH值范圍的選擇進(jìn)行比較，建立一套HPS菌體蛋白制樣及蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，為篩選HPS毒力相關(guān)蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HPS血清4型菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;馬血清，購(gòu)自Hylone公司。IPG膠條(pH值3～10、pH值3～10 NL和pH值4～7)、IPG覆蓋液、IPG緩沖液、2～D Clean－Up kit蛋白質(zhì)純化試劑盒，購(gòu)自GE公司。裂解液為自配，成份為7mol/L尿素，2mol/ L硫脲，4%w/v CHAPS，1%DTT，1mmol/L PMSF。雙向電泳系統(tǒng):一相Ettan IPGphor 3型，二相Ettan Dalt 6型為GE公司產(chǎn)品。光密度掃描儀(型號(hào)GS800)、圖像分析系統(tǒng)為Amer sham Bio sciences公司產(chǎn)品;基質(zhì)輔助激光解離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(型號(hào)4800 Plus MALDI TOF/TOF Analysis)為AB公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌裂解 將在TSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h的HPS單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃搖床200 r/ min培養(yǎng)36 h;13 000 r/min(4℃)離心10 min收集菌體，PBS洗滌3次，棄去上清;采用以下3種方法裂解菌體:(1)菌體蛋白在裂解液中，4℃過(guò)夜裂解; (2)超聲波細(xì)胞破碎儀在冰浴中以200 W的功率破碎細(xì)菌，超聲9.9 s，停頓9.9 s，超聲5 min后，4℃裂解4 h;(3)超聲波細(xì)胞破碎儀在冰浴中以200 W的功率破碎細(xì)菌，超聲9．9 s，停頓9．9 s，超聲5 min后，置于裂解液中，4℃中過(guò)夜12 h處理。

1.2.2 菌體蛋白粗提 將獲得的細(xì)菌粗蛋白混合液，13 000 r/min(4℃)離心10 min，取上清，用6倍體積含0.07%DTT、10%TCA的丙酮溶液沉淀30 min;1 3000 r/min(4℃)離心20 min，棄上清;沉淀物用含0.07%DTT的丙酮溶液重新懸浮10 min，13 000 r/min(4℃)離心10 min，棄上清，重復(fù)2次;裂解液復(fù)溶，13 000 r/min(4℃)離心10 min，上清即為粗提的菌體蛋白。

1.2.3 菌體蛋白的純化 應(yīng)用2－D Clean－Up kit蛋白質(zhì)純化試劑盒純化粗提的菌體蛋白，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。純化后的菌體蛋白立即使用或－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白質(zhì)定量 用Bradford法測(cè)定所提取的菌體蛋白濃度［4］。

1.2.5 2－DE的優(yōu)化 分別取0.3 mg、0.6 mg和1.0 mg的純化菌體蛋白進(jìn)行上樣，以確定最佳的蛋白上樣量。分別采用pH值3～10、pH值3～10 NL和pH值4～7的IPG膠條進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，以判斷HPS菌體蛋白的總體分布情況。樣品首先加載于兩性電解質(zhì)溶液(含8 mol/L尿素，2%w/v CHAPS，0.0078%DTT，0.01%IPG Buffer)中水化，第一向等電聚焦電泳結(jié)束后，IPG膠條首先在平衡緩沖液Ⅰ(含6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris–HCl pH值8.8，20%v/v甘油，2%w/v SDS，1%DTT)中平衡15 min后，再在平衡緩沖液Ⅱ(含50 mmol/L Tris–HCl，6 mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，4% IAA)中平衡15 min。平衡結(jié)束后，IPG膠條放置于濃度為12.5%的SDS－PAGE凝膠上，覆蓋含有0.002%溴酚藍(lán)的0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，進(jìn)行第二向SDS－PAGE電泳，電泳程序首先為600 V，400 mA，2 W/膠，電泳0.5 h后，按 600 V，400 mA，20 W/膠進(jìn)行，至溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部時(shí)結(jié)束電泳。

1.2.6 染色、采集與分析 用考馬斯亮藍(lán)G－250考染法進(jìn)行凝膠染色，最后在含有10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液進(jìn)行脫色［5］。染色結(jié)束后，通過(guò)Image Scanner掃描儀掃描采集圖像，用Image MasterTM2D Platinum7．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 隨機(jī)挑取14個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，將其從凝膠上切取，進(jìn)行脫色、脫水、干燥、酶解［6］，最后將樣品提取肽段后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，獲得PMF圖譜，檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)獲取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌裂解方法的確定 以在冰浴中以200 W的功率破碎細(xì)菌，超聲9.9 s，停頓9.9 s，超聲5 min后，置4℃過(guò)夜12 h的方法獲得的菌體蛋白濃度最高，為40μg/μL。而前2種方法的效果較差，蛋白質(zhì)未能得到充分裂解，獲得的蛋白質(zhì)濃度較低為24～33μg/μL。

2.2 蛋白質(zhì)上樣量的確定 2～DE后，以0.3 mg純化菌體蛋白上樣，檢出的低豐度蛋白較少;以1.0 mg純化菌體蛋白上樣，高豐度蛋白掩蓋部分低豐度蛋白;而以0.6 mg純化菌體蛋白上樣，蛋白分布均勻，無(wú)拖尾，檢出率最高。

2.3 IPG膠條的確定 pH值3～10線性膠條有成片模糊現(xiàn)象(圖1 A);pH值4～7膠條中約有5～10%的蛋白質(zhì)點(diǎn)丟失(圖1 C)。相對(duì)于pH值3～10線性和pH值4～7線性膠條而言，pH值3～10非線性膠條獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)不容易產(chǎn)生成片的模糊現(xiàn)象，能夠盡量多的完整呈現(xiàn)(圖1 B)。

圖1 2－DE圖譜

使用Image MasterTM2D Platinum 7．0分析軟件對(duì)pH值3～10非線性膠條的2－DE進(jìn)行初步分析，可以分辨出600±50個(gè)清晰可辨的蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些蛋白質(zhì)點(diǎn)在酸性和中性區(qū)域的中高分子量區(qū)域較為集中而堿性低分子量區(qū)域則出現(xiàn)較少;選擇蛋白質(zhì)點(diǎn)分布較為密集的區(qū)域進(jìn)行軟件偵測(cè)，結(jié)果所有的蛋白質(zhì)點(diǎn)均能被有效識(shí)別，并且沒(méi)有出現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)相互覆蓋的現(xiàn)象;對(duì)所選區(qū)域蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行3D模擬，峰圖顯示，每一個(gè)峰代表一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，峰與峰之間相互獨(dú)立，峰高錯(cuò)落有致，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)點(diǎn)已經(jīng)被有效的分離。

2.4 質(zhì)譜鑒定 隨機(jī)選取14個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)PMF圖譜，采用Mascot軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并與NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)所得的14個(gè)蛋白質(zhì)均為HPS菌體蛋白(表1)。

表1 蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

3 討論

提取純度高的蛋白是2－DE成功的基礎(chǔ)，本研究使用的細(xì)菌裂解液中含有尿素、硫脲、CHAPS和DTT，有助于提高細(xì)菌蛋白的溶解度，防止蛋白聚集。PMSF作為一種蛋白酶抑制劑，可以防止蛋白的降解。應(yīng)用超聲破碎的方法可破壞細(xì)菌的核酸，防止核酸混雜在蛋白中堵塞IPG膠條孔徑，造成蛋白在膠條酸性端聚集，影響2－DE圖譜的質(zhì)量。在3種裂解方法的比較中，采用超聲冰浴破碎細(xì)菌，裂解液溶解沉淀，4℃過(guò)夜12 h裂解的方法獲得的蛋白最多，因此，選擇此方法作為裂解細(xì)菌，提取蛋白的最佳方法。同時(shí)，還應(yīng)用2－D Clean－Up kit蛋白質(zhì)純化試劑盒純化粗提的菌體蛋白，去除提取過(guò)程中出現(xiàn)的糖類(lèi)、鹽分和脂類(lèi)等有可能對(duì)聚焦產(chǎn)生影響的物質(zhì)。

樣品蛋白上樣量的多少是決定2－DE成功的另一個(gè)因素，蛋白上樣量太大，會(huì)造成部分蛋白在等電聚焦電泳中沉淀，2－DE圖譜出現(xiàn)重疊或拖尾，影響數(shù)據(jù)的分析。蛋白上樣量過(guò)少，會(huì)影響低豐度表達(dá)的蛋白的檢出。2－DE圖譜顯示，以0.6 mg純化菌體蛋白上樣，所獲得的結(jié)果最好，蛋白分布均勻，無(wú)拖尾，檢出率最高。

IPG膠條的pH值范圍、線性或非線性分布也影響了蛋白在2－DE中的分布。2－DE圖譜顯示，pH值3～10線性膠條的蛋白發(fā)生聚集，影響了分辨率;pH值4～7線性膠條則擴(kuò)大了蛋白的分布，造成部分蛋白丟失;而pH值3～10非線性膠條的pH值在膠條上呈對(duì)數(shù)性分布，擴(kuò)大了膠條上的3～10 pH值的分布，獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，效果最好。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)2－DE方法中的細(xì)菌裂解方法、蛋白上樣量大小和IPG膠條的選擇等幾個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行了優(yōu)化，成功建立了一個(gè)適合HPS蛋白組學(xué)研究的2－DE方法，獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)能被有效識(shí)別，沒(méi)有出現(xiàn)蛋白相互覆蓋的現(xiàn)象，隨機(jī)挑取14個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，證實(shí)均為HPS菌體蛋白，為下一步開(kāi)展HPS不同血清型菌株的比較蛋白組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Oliveira S，Pijoan C．Haemophilus parasuis:new trends in diagnosis，epidemiology and control［J］．Vet Microbiol，2004，68:71-75．

［2］ Kielstein P，Rapp－Gabrielson V J．Designation of15 serovars of-Haemophilus parasuis on the basis ofimmunodiffusion using heatstable antigen extracts［J］．J Clin Microbiol，1992，30(4): 862-865．

［3］ Grg A，Obermaier C，Boguth G，et al．Very alkaline immobilized pH gradients for two－dimensionalelectrophoresis ofribosomaland nuclear proteins［J］．Electrophoresis，1997，18(3‐4):328-337．

［4］ Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］．Anal biochem，1976，72(1):248-254．

［5］ 理查德J．辛普森．蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:180-182．

［6］ 謝宇舟，密克，李軍，等．豬源大腸桿菌O157:H7菌體蛋白雙向電泳方法的建立［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48(10): 31-33．

Establishment of two－dimensional electrophoresis assay for proteome analysis of Haemophilus parasuis

XIE Yu-zhou1，2，LI Jun1，2，F(xiàn)ENG Shi-wen1，2，PENG Hao1，2，PAN Yan1，2，XUAN Xiong-biao1，2，CHEN Ze-xiang1，2，XU Li-gan1，2，YANG Wei1，2

(1．Guangxi Veterinary Research Institute，Nanning 530001，China; 2．Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology，Nanning 530001，China)

To establish a two－dimensional electrophoresis(2－DE)assay for proteome analysis of Haemophilus parasuis and to get an electrophoretogram with a clear background，high protein point resolution and good repeatability，2－DE program was optimized，and various sample preparation methods，different loading quantities and IPG strip selection were studied．Samples were ultra－sounded with ice bath in 5 minute(9．9 s/every 9．9 s)followed by deposited at4℃ at24 hours．0．6 mg total protein was loaded onto pH3－10 nolinear IPG strip for 2－DE followed by staining with Coomassie Brilliant Blue G–250 nitrate．14 proteins were randomly chosen to identify by mass spectrum，and detection rate was 100%．

Haemophilus parasuis;two-dimensional electrophoresis;bacterial protein;proteomes

s:CHEN Ze-xiang;XU Li-gan

S852.65+1

A

0529-6005(2017)06-0046-04

2016-02-24

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻0993009－1);廣西基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(桂科專(zhuān)項(xiàng)13－2);廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)項(xiàng)(13-051-27-A-4)

謝宇舟(1984-)，女(壯族)，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物病原學(xué)研究，E-mail:Rain_1113@163．com

李軍(1971-)，男，副研究員，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控與病原分子生物學(xué)，E-mail:jlee9981@163．com

注:李軍與謝宇舟對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

陳澤祥，E-mail:xjszexiang@163.com;許力干，E-mail:xuligan@163.com