沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性的試驗(yàn)

馬建偉，任慧英，鄒 玲，劉煥奇，單 虎，劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性的試驗(yàn)

馬建偉，任慧英，鄒 玲，劉煥奇，單 虎，劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

從商品肉鴨場(chǎng)采集鴨糞及墊料，以實(shí)驗(yàn)室保存的沙門菌為宿主菌，采用雙層平板法分離到1株烈性噬菌體。對(duì)分離到的噬菌體進(jìn)行純化、效價(jià)測(cè)定、裂解譜測(cè)定、形態(tài)觀察，并且進(jìn)行了最佳感染復(fù)數(shù)、溫度跟pH值穩(wěn)定性和一步生長(zhǎng)曲線的生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，該噬菌體形成的蝕斑均勻透亮，效價(jià)能達(dá)到109PFU/mL以上，并能裂解多株沙門菌菌株，為寬裂解譜噬菌體，透射電鏡顯示，該噬菌體為長(zhǎng)尾噬菌體;最佳感染復(fù)數(shù)為0.001;一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定表明，該噬菌體的潛伏期為15 min，暴發(fā)期為30 min，暴發(fā)量約為320;該噬菌體的溫度、pH值耐受性良好;紫外線照射60 min后效價(jià)降低3個(gè)梯度，由此可見該噬菌體分離株可作為潛在開發(fā)的生物消毒劑菌株。

沙門菌;噬菌體;蝕斑;最佳感染復(fù)數(shù);一步生長(zhǎng)曲線

沙門菌廣泛分布在自然界中，是一種對(duì)人和動(dòng)物有致病性的革蘭陰性桿菌。在獸醫(yī)臨床上沙門菌會(huì)引起雞、鴨、豬、羊等多種動(dòng)物患病，目前臨床上仍以抗生素治療為主，但抗生素的大量使用導(dǎo)致沙門菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)沙門菌也是一種重要的食源性致病菌［1－2］，是人類健康的一大威脅。

噬菌體是一種能夠特異侵染細(xì)菌并能將細(xì)菌裂解的病毒，噬菌體以自身特定的配體與細(xì)菌表面的特定受體結(jié)合，沙門菌噬菌體只侵染沙門菌，不會(huì)對(duì)正常菌群產(chǎn)生影響，并且不受細(xì)菌耐藥性的限制，在殺死宿主菌的同時(shí)能夠大量增殖，是一種天然而且安全的殺菌劑。在臨床上已經(jīng)有噬菌體應(yīng)用于治療細(xì)菌感染的報(bào)道，并且取得了不錯(cuò)的療效［3－4］。在Bruttin A等［5］研究報(bào)道中，使用T4噬菌體進(jìn)行大腸桿菌病的治療探究中，人和動(dòng)物都沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)。在抗生素濫用，細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重的今天，將噬菌體作為治療細(xì)菌感染的新方法越來(lái)越引起人們重視。本研究使用雙層平板法分離得到了1株沙門菌噬菌體，分析了該噬菌體的生物學(xué)特性，為今后應(yīng)用到沙門菌病治療及環(huán)境消毒中提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本次試驗(yàn)用沙門菌菌株由實(shí)驗(yàn)室從臨床病死鴨中分離鑒定并保存。糞便及墊料采集自山東沂南、淄博、濰坊等地商品肉鴨場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取鴨糞及墊料加入200 mL無(wú)菌

1.2.2 菌種的復(fù)蘇及菌懸液的制備 復(fù)蘇凍存的沙門菌，挑取生長(zhǎng)的單菌落于LB肉湯中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，制備菌懸液備用。

1.2.3 雙層平板法分離噬菌體 取3 mL 1.2.1中的母液與增殖好的沙門菌菌懸液各取200μL混合后，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取培養(yǎng)之后的增殖液10 000 r/min離心5 min后用0.22μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾。取200μL濾液與100μL菌懸液混合之后置于37℃溫箱中孵育5 min，將混合液加入融化之后冷卻至45℃左右的含0.7%瓊脂的LB上層瓊脂中混勻，將上層瓊脂倒入下層營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，待凝固后置于37℃溫箱中培養(yǎng)6～10 h，觀察有無(wú)噬菌斑生長(zhǎng)。1.2.4 噬菌體的純化 用無(wú)菌鑷子扣取單個(gè)噬菌斑置于盛有1 mL生理鹽水無(wú)菌EP管中，40℃水浴30 min，水浴結(jié)束后10 000 r/min離心5 min，將浸出液適當(dāng)稀釋后與相應(yīng)的宿主菌再次鋪雙層平板，再重復(fù)扣取單個(gè)噬菌斑進(jìn)行純化，直到得到大小和形態(tài)均一的蝕斑，純化7代。

1.2.5 噬菌體效價(jià)的測(cè)定 增殖采用液體增殖法。扣取單個(gè)噬菌斑制備單一噬菌體浸出液，取500μL浸出液跟200μL宿主菌懸液與LB肉湯混合之后37℃震蕩培養(yǎng)，取增殖液10 000 r/min離心5 min，離心后的增殖液適當(dāng)稀釋后取200μL稀釋液與100μL宿主菌鋪雙層平板測(cè)定效價(jià)。

1.2.6 噬菌體裂解譜的測(cè)定 采用點(diǎn)樣法［6］進(jìn)行裂解譜的測(cè)定。取100μL待測(cè)菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用無(wú)菌棉棒充分涂勻，待菌液充分吸收后，取2.5μL噬菌體增殖液點(diǎn)到涂好菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，待噬菌體增殖液充分吸收之后，將平板置于37℃溫箱中培養(yǎng)10 h。

1.2.7 噬菌體的形態(tài)觀察 取噬菌體增殖液15μL滴加到微孔銅網(wǎng)上，自然沉降15 min，用濾紙吸收多余的液體，滴加10μL 2%磷鎢酸染色5 min，用濾紙吸收多余的液體，自然干燥，之后透射電鏡觀察。

1.2.8 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定 首先增殖噬菌體跟宿主菌，測(cè)定噬菌體與宿主菌效價(jià)，按照感染復(fù)數(shù)為:0.001、0.01、0.1、1、10的比例各取200μL宿主菌跟噬菌體加入盛有5 mL LB肉湯的試管中，將試管置于37℃震蕩培養(yǎng)3 h，測(cè)定增殖液效價(jià)，每個(gè)感染復(fù)數(shù)做兩個(gè)重復(fù)。

1.2.9 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的繪制 按照最佳感染復(fù)數(shù)各取200μL噬菌體增殖液與宿主菌混合，13 000 r/min離心30 s，棄上清，再用500μL LB肉

其他模相合系數(shù)為0, 像s1,1,0, s2,2,1等. 我們發(fā)現(xiàn)該線性增長(zhǎng)率與重力加速度g和球界面初始半徑r0有關(guān): 隨著重力加速度的增大而增大, 隨著初始半徑的增大而減小. 而這些非零模耦合系數(shù)與g無(wú)關(guān), 只與初始半徑有關(guān): 隨著初始半徑的增大而減小.

湯洗滌2次并離心棄上清。用預(yù)熱的LB肉湯混懸沉淀(總體積5 mL)，置于搖床中培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0時(shí)刻及每隔15 min取出150μL，13 000 r/ min離心1 min測(cè)定效價(jià)，每個(gè)時(shí)間做兩個(gè)重復(fù)。

1.2.10 噬菌體溫度穩(wěn)定性試驗(yàn) 取150μL噬菌體增殖液于1.5 mL離心管中，置于40、50、60、70、80℃水浴中作用20、40、60 min，每個(gè)溫度梯度做兩個(gè)重復(fù)，作用結(jié)束后測(cè)定效價(jià)，繪制噬菌體效價(jià)在不同溫度下隨時(shí)間的變化曲線。

1.2.11 噬菌體pH值穩(wěn)定性試驗(yàn) 取900μL不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的LB肉湯與100μL噬菌體增殖液混合，混合之后置于溫箱中，作用1 h、2 h、3 h，作用結(jié)束之后立即測(cè)定效價(jià)，繪制噬菌體效價(jià)隨pH值變化的曲線。

1.2.12 噬菌體紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4 mL噬菌體增殖液于75 mm無(wú)菌平皿中，將平皿置于超凈臺(tái)距紫外燈(功率30 W)40 cm處，開紫外燈連續(xù)照射。每隔10 min取100μL噬菌體增殖液測(cè)定效價(jià)，連續(xù)測(cè)定60 min，繪制噬菌體效價(jià)隨紫外線照射時(shí)間變化曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離結(jié)果 分離到1株噬菌體，命名為BS3，純化7代之后，通過(guò)增殖測(cè)定效價(jià)，效價(jià)能達(dá)到109PFU/mL，該噬菌體在平板上噬菌斑形態(tài)見圖1。

圖1 噬菌體BS3噬菌斑

2.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定 噬菌體BS3對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的32株沙門菌可以裂解其中的18株，由此可知噬菌體BS3為寬裂解譜噬菌體。

2.3 噬菌體電鏡觀察 在透射電鏡下清晰看到噬菌體BS3由多面體的頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部組成，從平面圖上可以看到頭部為六邊形，頭部直徑約60 nm，尾部長(zhǎng)度約120 nm(圖2)。

2.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 噬菌體BS3感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 噬菌體BS3感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果

從表中可以看出，當(dāng)MOI=0.001時(shí)，噬菌體BS3增殖后測(cè)定得到的噬菌體效價(jià)最高，因此噬菌體BS3的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001。

2.5 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果 本次測(cè)定得到的噬菌體BS3的一步生長(zhǎng)曲線，見圖3。

圖3 噬菌體BS3一步生長(zhǎng)曲線

從噬菌體BS3的一步生長(zhǎng)曲線可以看出，噬菌體BS3潛伏期約為15 min，暴發(fā)期約為30 min，根據(jù)暴發(fā)量公式:暴發(fā)量=暴發(fā)末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度，計(jì)算所得暴發(fā)量約為72。

2.6 噬菌體溫度穩(wěn)定性試驗(yàn) 試驗(yàn)測(cè)定得到的BS3溫度穩(wěn)定性曲線，見圖4。

從噬菌體BS3效價(jià)隨溫度變化曲線上可以看出，噬菌體BS3在40℃下作用1 h之后可以保持原活性，在50℃跟60℃下作用20 min之后效價(jià)略有下降，但效價(jià)仍能達(dá)到108PFU/mL。在70℃作用20 min后效價(jià)下降較快，下降到106PFU/mL，作用1 h之后效價(jià)下降到僅為25 PFU/mL。在80℃左右20 min之后完全失活。

圖4 噬菌體BS3溫度穩(wěn)定性

2.7 噬菌體pH值穩(wěn)定性試驗(yàn) 試驗(yàn)測(cè)定得到的BS3的pH值穩(wěn)定性曲線，見圖5。

圖5 噬菌體BS3pH值穩(wěn)定性

從噬菌體pH值穩(wěn)定性曲線上可以看出，噬菌體BS3在pH值4～12范圍內(nèi)作用3 h后仍能保持原活性。在pH值2跟pH值13條件下作用1 h之后失活，在pH值3條件下作用1 h后效價(jià)略有下降，但仍能達(dá)到107PFU/mL，作用3 h效價(jià)下降較快，下降到104PFU/mL。

2.8 噬菌體紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn) 試驗(yàn)得到的噬菌體BS3紫外線穩(wěn)定性曲線見圖6。

圖6 噬菌體BS3紫外線穩(wěn)定性

從噬菌體BS3效價(jià)隨紫外線照射時(shí)間變化曲線上可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，噬菌體的效價(jià)不斷下降，照射60 min后效價(jià)為107PFU/mL，說(shuō)明該噬菌體分離株對(duì)紫外線耐受力較強(qiáng)。

3 討論

溫度和pH值的耐受力是衡量噬菌體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，本次分離到的噬菌體通過(guò)測(cè)定，在60℃下作用1 h，噬菌體BS3能保持108PFU/mL以上的活性，溫度耐受性比較強(qiáng)，在現(xiàn)實(shí)環(huán)境不會(huì)達(dá)到這么高的溫度，即便育雛期溫度也不過(guò)35℃，因此溫度基本不會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生影響。噬菌體BS3在pH值4～11范圍內(nèi)均能保持108PFU/mL以上的效價(jià)，而在實(shí)際生產(chǎn)中，pH值變化主要是在使用一些酸性或堿性消毒劑的時(shí)候發(fā)生的，但這種變化不會(huì)劇烈波動(dòng)，因此在應(yīng)用到環(huán)境消毒中時(shí)pH值對(duì)該噬菌體的活力影響不大。

不同地區(qū)分離到的沙門菌噬菌體的生物學(xué)特性不一致，尤其是在pH值耐受性、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線以及裂解譜等方面存在較大差異。如包紅朵等［7］分離的2株沙門菌噬菌體分別在pH值6～11和pH值6～9范圍內(nèi)穩(wěn)定，相比本研究分離的噬菌體，pH值耐受范圍窄;其測(cè)定的2株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1和0.01，潛伏期長(zhǎng)，暴發(fā)量小。朱育瑋［8］分離到的噬菌體在pH值4下作用60 min，存活率為15.1%，pH值耐受性較差。江艷華等［9］報(bào)道的最佳感染復(fù)數(shù)與本研究相同，均為0.001。

當(dāng)噬菌體室外應(yīng)用時(shí)，對(duì)紫外線的穩(wěn)定性是必須要考慮的一個(gè)因素。逯凱［10］分離到的大腸桿菌噬菌體，在紫外燈下照射14 min后完全失活。本研究分離到的噬菌體在紫外燈下照射60 min，仍保持有107PFU/mL效價(jià)，這可能主要與噬菌體本身的特性有關(guān)，此外，也會(huì)收到紫外波長(zhǎng)、照射時(shí)間、距離以及光復(fù)活酶等因素的影響?？傊?，該噬菌體的寬噬性及對(duì)溫度、pH值和紫外線的良好耐受性為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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［8］ 朱育瑋．沙門氏菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［D］．聊城:聊城大學(xué)，2015．

［9］ 江艷華，李風(fēng)鈴，王聯(lián)珠，等．一株沙門氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2015，42(3): 534-542．

［10］ 逯凱．多價(jià)噬菌體Bp7生物學(xué)特性及其尾絲蛋白gp37生物信息學(xué)分析［D］．青島:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013．

Study on the biological characteristics of an isolated virulent Salmonella Bacteriophage

MA Jian-wei，REN Hui-ying，ZOU Ling，LIU Huan-qi，SHAN Hu，LIU Wen-hua

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

With the preserved salmonella strains as host bacteria，salmonella bacteriophage was isolated by double plate method from duck feces and bedding from duck frams．Then the isolated bacteriophage was purified and tested for the titer，sis spectrum and morphology．The biological properties were identified by optimal multiplicity of infection(MOI)，pH and thermostability and one-step growth experiment．The plaques were symmetrical and bright，and the titer of this bacteriophage was more than 109PFU/mL．This bacteriophage not only caused bacteriolysis to hoststrain，butalso lysed another salmonella．The ultrastructure under TEM showed thatit was siphovirus．The MOI of BS3 was 0．001．One step growth showed that the latent period was 15min，the burst period was 30min and the burst size was 72．The stability to pH and temperature was excellent．The titer was decreased three gradients after ultraviolet ray irradiation for 60min．This bacteriophage can be used as a potential biological disinfectant．

Salmonella;Bacteriophage;Plaque;MOI;one-step growth curve

LIU Wen-hua

S852．61+2

A

0529-6005(2017)06-0024-04

2016-12-26

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系—牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-09-03);山東省高等學(xué)校優(yōu)勢(shì)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目

馬建偉(1991-)，男，碩士生，從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail:790968345@qq．com

劉文華，E-mail:wenhualiu2668@126．com