寧夏不同綿羊品種中綿羊肺炎支原體的調(diào)查

謝秀蘭，額爾和花，黎 帥，馬小明，黎玉瓊，李穎康

(1．寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002;2．寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

寧夏不同綿羊品種中綿羊肺炎支原體的調(diào)查

謝秀蘭1，額爾和花1，黎 帥2，馬小明1，黎玉瓊1，李穎康1

(1．寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002;2．寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

為了解綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)在不同品種綿羊中的感染情況，項(xiàng)目采集寧夏鹽池、平羅兩地的4個(gè)綿羊品種(灘羊、陶寒雜、杜寒雜和灘寒雜)的鼻拭子標(biāo)本403份，提取DNA并用綿羊肺炎支原體特異性PCR進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)不同品種、年齡段綿羊體內(nèi)綿羊肺炎支原體的檢出情況。結(jié)果表明，灘羊、陶寒雜、杜寒雜和灘寒雜的綿羊肺炎支原體的檢出率依次為52．0%、83．0%、75．5%和85．7%;灘羊在3月齡以下及8月齡以上的檢出率最低，分別為24．2%和34．4%，3月齡至8月齡的檢出率為94．3%;陶寒雜、灘寒雜在各年齡段的檢出率均在74．0%以上;杜寒雜3月齡以下的檢出率為56．3%，3月齡以上的檢出率在82．0%以上。結(jié)果表明，寧夏地區(qū)規(guī)?；曫B(yǎng)的綿羊中，綿羊肺炎支原體廣泛存在，較灘羊而言，其他雜交品種羊更易感染綿羊肺炎支原體。

寧夏地區(qū);灘羊;綿羊肺炎支原體;PCR

綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)引起綿羊和山羊的非典型性肺炎，該病呈急性或慢性經(jīng)過，病死率一般為15%～30%，有時(shí)高達(dá)60%～80%［1-2］。有研究表明，由綿羊肺炎支原體引起的肺炎在不同綿羊品種中的發(fā)病率不一［3-4］。寧夏地區(qū)主要飼養(yǎng)灘羊、小尾寒羊、蒙古羊、薩?？搜?、特克塞爾羊、杜泊羊及以上品種雜交產(chǎn)生的雜種羊，綿羊支原體性肺炎是該地區(qū)的高發(fā)病。為了進(jìn)一步分析綿羊肺炎支原體在寧夏不同綿羊品種中的感染情況，本試驗(yàn)應(yīng)用PCR方法對(duì)灘羊及雜交羊中綿羊肺炎支原體感染情況進(jìn)行了調(diào)查，旨在為進(jìn)一步分析該病原對(duì)宿主感染的差異，以及制定有效的防制措施提供有用的信息。

1 材料

1．1 樣本 隨機(jī)采集寧夏鹽池、平羅兩地的灘羊和雜交羊(灘寒雜、杜寒雜、陶寒雜)的鼻拭子標(biāo)本，每個(gè)群體分3個(gè)年齡段(3月齡以下，3－8月齡，大于8月齡)，采集33～35例，共403份。鼻拭子標(biāo)本浸入無菌生理鹽水中，4℃保存。

1．2 菌株 綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所逯忠新、儲(chǔ)岳峰老師惠贈(zèng)。

1．3 試劑與儀器 2×Taq PCR Master Mix、DL-2 000、Marker I、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所忠新、儲(chǔ)岳鋒贈(zèng)送。梯度 PCR儀(T100)，凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocXR+)，均購自美國Bio-rad公司。

2 方法

2．1 核酸提取 將鼻拭子標(biāo)本在生理鹽水中反復(fù)擠壓，吸取上清液用于DNA提取。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作步驟按說明書進(jìn)行，提取的基因組DNA溶于80μL TE溶液中，－20℃ 保存。

2．2 綿羊肺炎支原體的PCR檢測 參照文獻(xiàn)［5］，合成引物L(fēng)MF:5'-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3'; LMR:5'GACTTCATCCTGCACTCTGT-3'，該引物特異性擴(kuò)增綿羊肺炎支原體的16S rRNA 361 bp片段。反應(yīng)體系25μL:模板5μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 5．5μL。反應(yīng)條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，35 cycles;72℃10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。以綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98的基因組DNA為陽性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照，PCR檢測各綿羊群體。

3 結(jié)果

3．1 綿羊肺炎支原體的PCR檢測 PCR擴(kuò)增樣品中的綿羊肺炎支原體，可獲得與預(yù)期大小相符的361 bp片段，結(jié)果見圖1。

圖1 綿羊肺炎支原體的PCR檢測M1:Marker I;1:Y98 DNA;2～15:nasal swabs DNA;16:Negative control;M2:DL-2 000

3．2 不同綿羊群體肺炎支原體的檢出率 從寧夏鹽池縣、平羅縣兩地的規(guī)?；B(yǎng)殖場采集到灘羊、陶寒雜、杜寒雜和灘寒雜4個(gè)綿羊品種的鼻腔拭子403份。綿羊肺炎支原體在各綿羊群體鼻拭子中均有很高的檢出率(介于52.0% ～85.7%)，灘羊的檢出率最低(52.0%)，灘寒雜最高(85.7%)。從年齡段來看，灘羊在 ＜3個(gè)月齡和＞8個(gè)月齡兩個(gè)年齡段檢出率為 24.2%和34.4%，3～8月齡為94.3%。其他3個(gè)綿羊雜交種的檢出率在各年齡段都較高(56.3% ～100.0%)，但均以3～8月齡為最高(87.1% ～100.0%)，結(jié)果見表1。

表1 不同綿羊群體肺炎支原體的PCR檢測率

4 討論

綿羊肺炎支原體是引起綿羊和山羊支原體性肺炎的主要病原之一［6-8］。臨床上健康羊的上呼吸道也能分離出綿羊肺炎支原體［9］。據(jù)張莉等［10］對(duì)河北省的6個(gè)種羊場綿羊、山羊血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，綿羊肺炎支原體的自然病例的陽性檢出率為84.2%;冷青文等［11］研究表明，人工圈養(yǎng)盤羊鼻拭子中綿羊肺炎支原體陽性率為29%，野生盤羊的陽性率高達(dá)66.7%;黃秀君等［12］研究表明，四川攀枝花地區(qū)山羊的綿羊肺炎支原體陽性率為 46.0%;Rong G等［13］對(duì)海南山羊血清標(biāo)本檢測結(jié)果表明，綿羊肺炎支原體的陽性率為31.7%;Akwuobu C A等［14］對(duì)尼日利亞的綿羊和山羊鼻拭子中支原體的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病羊和健康羊只，支原體的分離率分別為16.2%和29.1%，綿羊肺炎支原體在健康羊和有呼吸道癥狀的羊群中都具有很高的檢出率。本項(xiàng)目中，綿羊肺炎支原體在4個(gè)綿羊品種中的檢出率在52.0%－85.7%(注:待檢羊只無明顯呼吸道癥狀)，高的檢出率未必意味著高的發(fā)病率和死亡率，羊只的高帶菌率給該病的防控帶來了困難。

綿羊肺炎支原體具有宿主易感性差異。郭晗等［15］研究顯示，青海地區(qū)綿羊陽性率為30．4%，明顯高于山羊(19．7%)，提示綿羊?qū)d羊肺炎支原體的易感性要高于山羊。黃秀君［12］、沈文等［16］調(diào)查表明，盤羊雜交羊在感染支原體后表現(xiàn)出了典型的肺炎癥狀，而巴什拜羊癥狀輕微，表現(xiàn)出抗性;陶岳等［17］研究顯示，湖羊的發(fā)病率是20．4%，死亡率為18．2%，病死率達(dá)89．3%，同群細(xì)毛羊發(fā)病較湖羊少，波爾山羊?qū)Ρ静∮幸欢ǖ牡挚沽?冷青文等［18］研究表明，巴什拜羊具有較為豐富的遺傳多樣性，HaeⅢBC為綿羊肺炎支原體抗性基因，HaeⅢDD為綿羊肺炎支原體的易感基因型;Pst IA和Pst IB、HaeⅢC分別是巴什拜羊綿羊肺炎支原體易感和抗性相關(guān)等位基因;何存利等［4］研究發(fā)現(xiàn)，寧夏羊場外來品種羊陽性率高于地方品種，1歲以上的羊只陽性率41．2%，明顯高于1歲以下羊只的17．4%，區(qū)外引進(jìn)優(yōu)良品種(母羊以小尾寒羊?yàn)橹?，公羊以陶塞特，薩福克等國外肉羊品種居多)，其抗病能力與本地羊相比明顯較弱。本試驗(yàn)中，灘羊綿羊肺炎支原體的檢出率為52．0%(其中3月齡以下和＞8月齡的檢出率僅有24．2%和34．3%)，明顯低于雜交羊的檢出率，結(jié)合何存利的研究結(jié)果，表明灘羊這一地方品種羊?qū)d羊肺炎支原體具有較高抵抗力，而其抗綿羊肺炎支原體的機(jī)制還有待于深入研究。

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The survey of Mycoplasma ovipneumoniae in different sheep breeds in Ningxia area

XIE Xiu-lan1，Eerhehua1，LI Shuai2，MA Xiao-ming1，LI Yu-qiong1，LI Ying-kang1
(1．Institute of Animal Science，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China;2．Xinhua College of Ningxia University，Yinchuan 750021，China)

To study the infection rate of Mycoplasma ovipneumoniae in different sheep breeds，403 nasal swabs of4 sheep breeds (Tan sheep，Dorset-Small Tailed Han hybrids，Dubo-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids)were collected from Yanchi and Pingluo counties in Ningxia area，DNA was extracted and gene of Mycoplasma ovipneumoniae was amplified by (PCR)，and positive rates of different sheep breeds and age stages were analyzed．The results showed that positive rates in Tan sheep，Dorset-Small Tailed Han hybrids，Dubo-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids were 52.0%，83.0%，75.5%and 83.0%，respectively．Tan sheep had the lowest positive rate at age stages of under 3 months and older than 8 months，which were 24.2%and 34.4%，respectively．Positive rate at age stages of3 to 8 months was 94.3%;positive rates for all age stages of Dorset-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids were above 74.0%．Positive rate of Dubo-Small Tailed Han hybrids under 3 months was 56.3%，and were above 82.0%at the age stages of more than 3 months．The results suggest that Mycoplasma ovipneumoniae pread in large scale sheep farms in Ningxia region and sheep hybrids was more susceptible to Mycoplasma ovipneumoniae than Tan sheep．

Ningxia area;Tan sheep;Mycoplasma ovipneumoniae;PCR

LI Ying-Kang

S85

A

0529-6005(2017)06-0011-03

2016-05-09

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ13127);中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助(SKLVEB2012KFKT004)

謝秀蘭(1980- )，女(回族)，副研究員，碩士，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究，E-mail:275896605@qq．com

李穎康，E-mail:1377730935@qq．com