靈芝多糖硫酸酯對記憶障礙模型小鼠學習記憶能力的影響

李亞巍，金 瑛，梁承武，昌 盛，朱文赫

(吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

靈芝多糖硫酸酯對記憶障礙模型小鼠學習記憶能力的影響

李亞巍，金 瑛，梁承武，昌 盛，朱文赫

(吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

為探討靈芝多糖硫酸酯(GLPS)對D－半乳糖致衰小鼠學習記憶能力的影響，本試驗對靈芝多糖(GLP)進行硫酸酯化修飾，將50只昆明系小鼠隨機分為5組:空白對照組、模型對照組、陽性對照組(吡拉西坦片50 mg/kg體重·d)、GLP給藥組(50 mg/kg體重·d)、GLPS給藥組(50 mg/kg體重·d)，建立D－半乳糖致衰小鼠模型。進行跳臺試驗，并檢測小鼠腦組織SOD活性和MDA含量的變化;免疫印跡檢測小鼠海馬組織Bcl-2和Caspase-3的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLP和GLPS組均能夠明顯延長小鼠跳臺潛伏期，減少5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯誤次數(shù)，且均可升高SOD活性、降低MDA含量，但GLPS組效果明顯優(yōu)于GLP組;免疫印跡結(jié)果表明，GLPS組能夠明顯降低Caspase-3的表達，增強Bcl-2蛋白的表達，而GLP組影響不明顯。說明GLPS可以顯著改善D－半乳糖致衰小鼠的學習記憶能力，其機制可能與增強Bcl-2的表達及抑制Caspase-3的表達，抑制海馬組織凋亡相關(guān)。

靈芝多糖;硫酸酯化;D-半乳糖;學習記憶障礙

靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide， GLP)，靈芝的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗衰老等作用，但天然多糖存在很多劣勢［1］。采取一定的方法對多糖結(jié)構(gòu)進行修飾獲得理想的活性多糖是解決該問題的有效途徑。目前改變多糖結(jié)構(gòu)效果較好的方法是硫酸酯化法，其修飾結(jié)果是將硫酸基團加到多糖糖基上，使其生物活性發(fā)生改變［2］。目前，國內(nèi)外對靈芝多糖硫酸酯(GLP sulfate，GLPS)的研究大多集中在抗癌方面，而其對學習記憶能力的影響研究的還很少。本研究采用D-半乳糖建立學習記憶障礙小鼠模型，觀察GLPS對學習記憶能力的改善作用。

1 材料與方法

1.1 GLPS的制備 靈芝購自吉林市中藥材市場，按照文獻［3］方法，制得GLPS。采用紅外光譜檢測硫酸酯化成功與否。

1.2 動物模型的建立［4］雄性昆明系小鼠50只，購自吉林大學醫(yī)學實驗動物中心，動物合格證號: SCXK-吉2008—0005。隨機分為5組:空白對照組、模型對照組、陽性對照組(吡拉西坦片50 mg/kg體重·d)，GLP給藥組(50 mg/kg體重· d)、GLPS給藥組(50 mg/kg體重·d)?？瞻捉M和模型組小鼠每天灌胃給予等體積的生理鹽水，其余各組分別給予相應劑量的藥液，給藥同時，除空白組外，其余各組小鼠每天頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg體重，連續(xù)6周。

1.3 跳臺試驗 末次給藥2 h后，將各組小鼠放入跳臺箱適應3 min后，開始試驗，將小鼠放于平臺上，同時通電，記錄各組小鼠5 min內(nèi)跳下平臺受電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))和首次跳下平臺的潛伏期。24 h后重復測試，以此作為學習記憶功能的觀察指標。

1.4 SOD活性、MDA含量的測定 分離小鼠海馬與皮層組織，制成腦組織勻漿液，離心，收集上清，檢測各組小鼠SOD活性和MDA含量。

1.5 免疫印跡試驗 分離小鼠海馬組織，胰酶消化，裂解，離心，收集上清。經(jīng)BCA法蛋白定量后，進行電泳，Bcl-2和Casepase-3抗體孵育過夜，ECL顯影，化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理 計量資料均以x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GLPS紅外光譜測定結(jié)果 根據(jù)圖譜(圖1)可以看出，硫酸酯化多糖光譜中保留了GLP的特征吸收峰，而且新出現(xiàn)的1 207 cm左右的S=O伸縮振動和813 cm左右的C-O-S伸縮振動的特征吸收峰，說明硫酸基團已經(jīng)以酯鍵形式連接到GLP分子上。

圖1 GLPS紅外光譜圖

2.2 GLPS對記憶障礙小鼠跳臺的影響 跳臺試驗是一種常見的測試小型動物學習記憶能力的行為學檢測方法。試驗結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠跳臺潛伏期明顯縮短，5 min內(nèi)錯誤次數(shù)明顯提高(P＜0.01);與模型組比較，GLP、GLPS組對于衰老小鼠記憶障礙均具有改善作用，小鼠跳臺潛伏期延長，5 min內(nèi)錯誤次數(shù)減少(P＜0.05);未經(jīng)硫酸化修飾的GLP雖然也對記憶障礙小鼠具有改善作用，但其效果明顯低于GLPS(P＜0.05)。提示 GLPS可以更好地改善D-半乳糖致衰小鼠的學習記憶能力。結(jié)果見表1。

2.3 GLPS對記憶障礙小鼠SOD和MDA的影響

AD的發(fā)病機制目前未完全闡明，“Aβ級聯(lián)學說”是較為公認的發(fā)病學說。該學說認為，AD發(fā)生發(fā)展過程中，患者腦組織中異常沉積的Aβ蛋白所引起的氧化應激損傷將損傷膽堿能神經(jīng)元細胞，造成學習記憶能力受損［5］。而SOD和MDA是反映機體氧化還原狀態(tài)的主要標志物。試驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，GLP組和GLPS組均能夠升高小鼠的SOD活性、降低MDA含量(P＜0.05)，且 GLP組改善效果明顯低于GLPS組(P＜0.05)。提示GLP、GLPS可以通過抗氧化改善小鼠學習記憶，且GLP效果更佳。結(jié)果見表2。

表1 GLPS對記憶障礙小鼠跳臺的影響

表2 GLPS對記憶障礙小鼠SOD和MDA的影響

2.4 GLPS對記憶障礙小鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 Bcl-2基因家族是最早發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)、也是最受重視的調(diào)控細胞凋亡的基因家族。它的過度表達可以有效抑制細胞凋亡;Caspases家族則是近年發(fā)現(xiàn)的在細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的執(zhí)行蛋白酶，Caspases家族中的Caspase-3是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用，它的激活標志著凋亡進入不可逆的階段。

免疫印跡結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠Caspase-3蛋白表達升高，Bcl-2表達降低。與模型組比較，GLPS給藥組可以明顯降低小鼠Caspase-3蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達，而GLP組對Bcl-2和Caspase-3蛋白表達影響卻不明顯。提示GLPS改善學習記憶障礙的作用機制可能與增強Bcl-2的表達及抑制Caspase-3的表達，抑制海馬組織凋亡相關(guān)。結(jié)果見圖2。

3 結(jié)論

本研究采用D-半乳糖致衰小鼠學習障礙模型，探討GLPS改善小鼠學習記憶障礙的能力及其機制。研究結(jié)果表明，GLPS改善小鼠學習記憶障礙的能力明顯優(yōu)于GLP，這可能與硫酸基團的引入有關(guān)，硫酸基因的引入會引起多糖理化性質(zhì)，特別是立體構(gòu)象的變化，導致GLP的空間結(jié)構(gòu)、電荷分布

圖2 Western Blot分析小鼠腦組織中蛋白表達變化1:對照組;2:模型組;3:陽性對照組;4:GLP組;5:GLPS組

以及溶解度等發(fā)生改變，從而提高了GLPS的生物活性。其改善學習記憶能力的機制可能與改善小鼠腦內(nèi)氧化應激水平，增強 Bcl-2的表達及抑制Caspase-3的表達，抑制海馬織凋亡相關(guān)，研究結(jié)果將為GLP的進一步研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

［1］ 于洪濤，吳茂玉，趙巖，等．靈芝多糖提取及生理活性的研究進展［J］．食品研究與開發(fā)，2011，32(5):159-162．

［2］ 張玨．靈芝多糖的硫酸化修飾及其衍生物抗腫瘤活性的初步研究［D］．無錫:江南大學，2005．

［3］ 張萍，李靜，呂興萍，等．赤靈芝多糖硫酸酯化初步研究［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41(1):211-213．

［4］ 布秀娟，劉暢，梁啟超．活血益智片對小鼠學習記憶障礙和血管性癡呆模型的影響［J］．遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012，14 (4):236-238．

［5］ AkiraS，TakedaK．Toll-like receptor signaling［J］．Nat Rev Immunol，2004，4(7):499-511．

Influence of Ganoderma Lucidum Polysaccharide Sulfate on Learing Memory Behavior in the Learning Disorder and Dysmnesia Model Mice

LI Ya-wei，JIN Ying，LIANG Cheng-wu，CHANG Sheng，ZHU Wen-he

(Department of pharmaceutical chemistry，Jilin medical college，Jilin 132013，China)

To study the effect of GLPS on the learning and memory abilities of D-galactose-induced senile mice，GLP was modified by sulfation to obtain GLPS．Fifty KM mice were randomly divided into 5 groups:blank control group，modelcontrol group，positive control group(laci staw 50mg/kg·d)，GLP group(50 mg/kg·d)and GLPS group(50 mg/kg·d)．We established the D-galactose-induced senile mice model and performed the step-down passive avoidance test．And all mice were beheaded to detect the effect of SOD and MDA．The expression of caspase-3 and Bcl-2 in the hippocampus of mice was detected by Western blotting．The results showed the GLP and GLPS group increased the incubation period platform，and decreased the mistaken reaction times in 5 min．We also found that GLP and GLPs group increased SOD activity，and decreased MDA content，but the effect of GLPS group was better than GLP group．The result of Western blotting showed that the GLPS group significantly reduced the expression of caspase-3，and increased the expression of Bcl-2 protein．These results showed that sulfation can significantly improve the effect of GLP on the learning and memory abilities of D-galactose-induced senile mice．The possible mechanism is that GLPS can depress the oxidative stress and inflammatory response induced by scopolamine through the affection of NF-kB signal transduction pathway．

GLP;Sulfation;D-galactose;Learning and memory impairment

ZHU Wen-he

R914.5

A

0529-6005(2017)06-0008-03

2016-11-17

國家自然科學基金(21102055);吉林市科技計劃項目(20156428);吉林省衛(wèi)計委青年科研課題(2015Q041)

李亞巍(1984-)，女，講師，博士，從事藥物化學研究工作，E-mail:lyw135@163.com

朱文赫，E-mail:jlmpczwh@163.com