蒙古犬線粒體DNA D-loooopp區(qū)序列全長(zhǎng)測(cè)定及其分類地位研究

程占軍 馬大君

繁育·飼養(yǎng)

蒙古犬線粒體DNA D-loooopp區(qū)序列全長(zhǎng)測(cè)定及其分類地位研究

程占軍 馬大君

作為人類最持久、可靠和忠誠(chéng)的伙伴，早在10000～15000年前，一些與狼分道揚(yáng)鑣的野犬已經(jīng)開始跟隨原始人類一起生活。蒙古犬和其它犬一樣具有體型強(qiáng)健、食肉性、兇猛性、服從性、敏捷性、嗅覺(jué)靈敏、聽(tīng)覺(jué)靈敏以及季節(jié)性繁殖和換毛等生物學(xué)特性。目前蒙古犬的中心地帶，應(yīng)以呼倫貝爾草原為核心地帶。據(jù)史料記載推測(cè)，蒙古民族，即早期的蒙古部（蒙兀室韋）在今內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾草原的呼倫湖和額爾古納河?xùn)|南的大興安嶺山林中繁衍生息時(shí)，現(xiàn)今呼倫貝爾草地牧羊犬的祖先，一個(gè)古老的山地犬種，已經(jīng)在蒙古部族的營(yíng)地里承擔(dān)狩獵大型獵物、護(hù)衛(wèi)營(yíng)地和馱運(yùn)物資等工作了。關(guān)于這個(gè)犬種，歷史上沒(méi)有留下任何記載，但為了適應(yīng)冬季極度高寒的嚴(yán)酷山地環(huán)境，并與大型野獸搏殺，相信那應(yīng)該是一種體大毛厚極有力量的兇猛犬種。公元9世紀(jì)中葉，蒙古部向西遷移，走出山林進(jìn)入呼倫貝爾草原，逐步完成由純粹的狩獵民族向半狩獵半游牧生活的過(guò)度，并最終成為真正意義上的游牧民族。蒙古游牧民族帶著他們的畜群逐水草而居，不定期地更換牧場(chǎng)。這個(gè)犬種逐漸對(duì)這種游牧生活進(jìn)行了適應(yīng)，在無(wú)邊界的牧場(chǎng)中，它們高聲吠叫，警告陌生人并向主人發(fā)出信號(hào)，護(hù)衛(wèi)營(yíng)地和放牧羊群，驅(qū)除覬覦羊只的野狼。由于從上世紀(jì)90年代初期開始，受東北朝鮮飲食文化的影響，在一些中心城市海拉爾、滿洲里和牙克石等地開始零星出現(xiàn)狗肉餐館，每天殺犬幾十頭，而一些小地方，也在十幾頭左右，致使蒙古犬的基礎(chǔ)群數(shù)量正在逐年下降。據(jù)估算，目前全國(guó)現(xiàn)存蒙古犬的總數(shù)約50000頭。

高等動(dòng)物線粒體DNA（mtDNA）由于具有含量豐富、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳方式單一、進(jìn)化速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為物種起源、分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育研究的重要分子標(biāo)記。近年來(lái)在近緣種間及種群內(nèi)群體間的分子進(jìn)化研究中，D-loop 區(qū)已被廣泛用于犬的起源與進(jìn)化、群體遺傳結(jié)構(gòu)、品種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的研究。筆者測(cè)定了蒙古犬線粒體DNA D-loop區(qū)的全序列， 從分子水平上探討了線粒體的起源和在犬科中的分類地位， 為線粒體種質(zhì)資源的保護(hù)、利用提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年健康的純種蒙古犬5頭， 來(lái)自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾草原。經(jīng)耳動(dòng)脈采血5mL，ACD抗凝，采用常規(guī)的酚/氯仿法提取血液基因組DNA，0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

選取家犬亞種中已經(jīng)測(cè)出線粒體DNA D-loop區(qū)全序列的、具有代表性的24個(gè)家犬品種和兩個(gè)灰狼、郊狼。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其線粒體DNA D-loop區(qū)全序列(表1)，與進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并選取與家犬亞種親緣關(guān)系較近的郊狼作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外類群。

（二）引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)家犬線粒體基因組的已知DNA 序列(序列號(hào): U96639) 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增蒙古犬和藏獒線粒體DNA的D-loop區(qū)，正向引物為：5′AGCTGAAATTCTTCTTAAACTATTCCCTG3′，反向引物為：5′GTGTGGCTTAGCAAGGTGTTATGAG 3′；測(cè)序引物為M13 通用引物，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15ul，其中100ng模板DNA、10×Buffer、2.5 mmol· L-1dNTP 1.5ul、2.5 mmol· L-1MgCl2 1ul、10 umol· L-1的引物各 0.35ul、Taq DNA聚合酶 0.15ul。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，30個(gè)循環(huán)（94℃變性45s，52℃退火50s，72℃延伸2min），72℃延伸7min。

（三）目的基因測(cè)序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)W5212 柱離心式膠回收試劑盒純化后作為測(cè)序反應(yīng)的模板。測(cè)序儀器為ABI3130，所用試劑盒(Kit)為: ABI PrismBigDyeTM Terminator Cycle Sequecing Ready ReactionKit (ABI，USA) 。測(cè)序反應(yīng)體系內(nèi)含模板40 ng(PCR 產(chǎn)物) 、BigDye Mix 2μL 、引物1μL (濃度為3.2μmol/L)，用滅菌的ddH2O 補(bǔ)足10μL。然后根據(jù)Kit 推薦的反應(yīng)條件進(jìn)行sequencePCR。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化(參照ABI，USA)，用ABI3130全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行正反鏈雙向測(cè)序。DNA序列通過(guò)ABI3130 測(cè)序收集軟件(2.0)和分析軟件(3.4.1) 確定。所有序列采用雙向測(cè)序，以便比對(duì)核實(shí)。

（四）數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)發(fā)生分析

用DNAStar5.02(DNASTAR Inc1，1996)軟件的SeqMan程序?qū)λ鶞y(cè)序列拼接，用MEG程序?qū)λ鶞y(cè)序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析、對(duì)位排列；用Mega4.1統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換與顛換的比值和遺傳距離；利用MEGA4.1軟件中的NJ鄰接法構(gòu)建NJ樹和最小進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選用Kimura 2-parameter模型，重復(fù)抽樣檢驗(yàn)1000次獲得自舉置信度。

二、結(jié)果

（一）基因片段序列及差異

設(shè)計(jì)的引物在蒙古犬基因組中得到了較好地?cái)U(kuò)增，通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)蒙古犬線粒體DNA D-loop區(qū)序列全長(zhǎng)為1278 bp對(duì)于5頭蒙古犬序列的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)T、C、A、G4種堿基的平均含量分別為29.1%、26.4%、27.3%、17.2%，A+T=56.39%，C+G=43.61%。堿基序列中A、T含量明顯高于G、C含量，說(shuō)明序列堿基存在明顯的偏向性。在密碼子的不同位點(diǎn)，堿基頻率有不同偏倚，密碼子第一位T、C、A、G的平均含量分別是40%、27.4%、17.6%、15%；密碼子第二位T、C、A、G的平均含量分別是13%、45.7%、36.3%、5.1%；密碼子第三位T、C、A、G的平均含量分別是20%、24.5%、26.5%、28.6%。與犬科其他物種的線粒體DNA D-loop區(qū)序列的堿基組成基本一致。

表1 本研究中所用實(shí)驗(yàn)樣本

DNA序列片段經(jīng)DNA Star 5.02軟件的SeqMan程序拼接，并反向重復(fù)測(cè)序進(jìn)行校正后，得到完整的犬D-Loop基因序列，不同品種間線粒體DNA D-loop區(qū)序列相差較大， 介于1240bp與1278bp 之間，蒙古犬的線粒體DNA D-loop區(qū)序列最長(zhǎng)，為1278bp左右，再用DNAstar進(jìn)行同源序列比對(duì)。由于同種個(gè)體之間的序列差異很小(0-0.003)，因此大多數(shù)物種選用1 例個(gè)體代表該物種來(lái)進(jìn)行分析。用Mega4.1進(jìn)行核酸序列分析轉(zhuǎn)換/顛換比率的平均值R=33.91，若轉(zhuǎn)換與顛換的比值（R）小于2.0時(shí)，認(rèn)為該基因序列發(fā)生的突變已經(jīng)達(dá)到飽和。

通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蒙古犬線粒體DNA D-loop 區(qū)中包括2個(gè)保守序列模塊即CSBⅠ和CSBⅡ， 而在2個(gè)保守序列模塊之間有1個(gè)短片段重復(fù)區(qū)，這個(gè)重復(fù)區(qū)是由一個(gè)包含10個(gè)核苷酸構(gòu)成的重復(fù)單元5′-GTACACGT(G/A)C-3′經(jīng)過(guò)31個(gè)重復(fù)形成的，類似于藏獒的30個(gè)重復(fù)。

（二）遺傳距離

利用Mega4.1進(jìn)行遺傳距離計(jì)算。從表2可以看出，蒙古犬與灰狼（DQ_480508）、貴賓犬、和圣伯納犬遺傳距離最近，均為0.003；蒙古犬與郊狼的遺傳距離較遠(yuǎn)（0.042~0.049）。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)線粒體DNA D-loop區(qū)全序列， 分別采用NJ法和ME法構(gòu)建了蒙古犬與24個(gè)家犬品種的系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NJ樹和ME樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致；其中郊狼與美國(guó)郊狼聚為一類；所有家犬品種自成一大類。在家犬品種內(nèi)， 迷你雪納瑞犬、西高地白、蘭伯格犬、愛(ài)爾蘭雪達(dá)犬、英國(guó)古代牧羊犬、美國(guó)可卡犬、愛(ài)爾蘭軟毛麥色、西伯利亞哈士奇犬和藏獒聚分第一分支；灰狼（DQ480508 NC_008093）、英國(guó)平毛尋回獵犬、中國(guó)蒙古犬、貴賓犬、喜樂(lè)蒂牧羊犬、圣伯納犬節(jié)點(diǎn)聚為第二分支；灰狼（DQ480503）與黑俄羅斯、瑞典獵鹿犬和德國(guó)牧羊犬等品種聚為第三分支。

三、討論

蒙古犬線粒體DNA D-loop區(qū)的重復(fù)序列與家犬、豬的重復(fù)序列非常相似，在10個(gè)核苷酸重復(fù)單元中的第9個(gè)堿基發(fā)生G/A替換。存在一段以10個(gè)堿基為單位的串連重復(fù)序列，一般認(rèn)為這是mtDNA異質(zhì)性的表現(xiàn)，直接影響犬線粒體DNA的長(zhǎng)度。線粒體DNA D-loop區(qū)中重復(fù)序列的可變性和重復(fù)單元數(shù)量的可變性所形成的異質(zhì)性是哺乳動(dòng)物線粒體DNA的典型特征。在犬科動(dòng)物的線粒體DNA中只有1個(gè)重復(fù)序列， 位于CSBⅠ和CSBⅡ之間；而在貓科動(dòng)物的線粒體DNA中有2個(gè)重復(fù)序列，即位于CSBⅠ與CSBⅡ之間的RS3和位于tRNA-pro與保守核心區(qū)之間的RS2；在兔科動(dòng)物的線粒體DNA中短片段重復(fù)序列位于CSBⅠ與CSBⅡ之間，而長(zhǎng)片段重復(fù)序列位于tRNAPhe和CSBⅢ之間。蒙古犬及16個(gè)家犬品種間線粒體DNA D-loop 區(qū)堿基的缺失/插入在重復(fù)序列和非重復(fù)序列中均有發(fā)生，驗(yàn)證了Kim等提出的“與其他一些哺乳動(dòng)物如海豹、馬、豬、驢、兔和貓等不同，犬線粒體DNA D-loop區(qū)中的重復(fù)序列并不是引起犬線粒體DNA序列長(zhǎng)度多態(tài)性的唯一原因”的觀點(diǎn)。蒙古犬及16個(gè)家犬品種間線粒體DNA D-loop區(qū)序都得養(yǎng)三五頭犬。蒙古犬有三大類：一類是牧羊犬，又稱蒙古獒，體格壯碩、聰敏機(jī)智、秉性忠誠(chéng)、勇敢兇猛異常；蒙元時(shí)期蒙古人還馴養(yǎng)著一種雄壯的勞役犬蒙古獒（俗稱四眼狗）專門用來(lái)套雪橇拉車；列的轉(zhuǎn)換/顛換比為33.91， 明顯大于轉(zhuǎn)換/顛換比的臨界值2.0，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏愛(ài)性，與其他哺乳動(dòng)物線粒體DNA序列的研究結(jié)果是一致的，同時(shí)也說(shuō)明蒙古犬及16個(gè)家犬品種間線粒體DNA D-loop區(qū)序列的突變沒(méi)有達(dá)到飽和狀態(tài)。

表2 各群體間的遺傳距離

將蒙古犬D-loop部分序列與已知序列構(gòu)建了進(jìn)化數(shù)，結(jié)果表明，不同地區(qū)的品種混合聚類，說(shuō)明歐亞大陸的家犬品種在歷史上曾發(fā)生過(guò)相當(dāng)程度的基因交流。本研究發(fā)現(xiàn)蒙古犬與灰狼（DQ480508 NC_008093）、英國(guó)平毛尋回獵犬、貴賓犬、喜樂(lè)蒂牧羊犬、圣伯納犬聚為一類， 其中與圣伯納犬聚在一起。據(jù)史料記載，蒙古人愛(ài)養(yǎng)犬，在草原上每家蒙古犬中還有一種玩賞狗，體形嬌小，形態(tài)可愛(ài)。蒙古犬和藏獒一樣強(qiáng)壯，直到70～80年代一位獸醫(yī)Sevenjav DT作了調(diào)查研究以后，才作出了蒙古犬身材形態(tài)的準(zhǔn)確描述。這說(shuō)明蒙古犬在品種形成過(guò)程中，其分類型可能與這幾類犬有關(guān)。從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系看，所有家犬都起源于灰狼，而與郊狼關(guān)系較遠(yuǎn)。Vila等認(rèn)為家犬是在不同的時(shí)間、地點(diǎn)分別起源；而Savolainen等認(rèn)為家犬全部起源于東亞，在亞洲向歐洲的擴(kuò)散過(guò)程中發(fā)生了變異或遺傳漂變，產(chǎn)生了多個(gè)類群。經(jīng)過(guò)多年的爭(zhēng)論和深入研究，目前已基本達(dá)成共識(shí)， 即世界范圍內(nèi)的所有家犬都起源于灰狼。

圖1 基于犬線粒體DNA D-loop 區(qū)序列采用NJ 法(A) 和ME法(B ) 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李 冰）