不同產地知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的HPLC分析

鐘鑫+霍蕾

摘 要： 目的：本文旨在通過測定不同產地知母藥材中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量，改進知母含量測定方法，提高含量回收率，從而準確的評價不同產地知母藥材的質量。方法：采用HPLC-ELSD和HPLC-DAD法測定了15個不同來源的知母樣品，色譜條件：測定知母皂苷BⅡ的色譜柱為Ultimate XB C18（4.6×250mm，5μm），流動相為乙腈：水（25∶75），流速為1.0ml/min，柱溫35℃，載氣流速3.0L/min，漂移管溫度110℃；測定芒果苷的色譜柱為Wondasil C18（4.6×200mm，5μm），流動相為乙腈：0.1%磷酸水溶液（16∶84），流速為1.0ml/min，檢測波長為258nm，柱溫35℃。結果：不同產地知母藥材中知母皂苷BⅡ和芒果苷含量有明顯差異。結論：山西產知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量均高于其他三省，河北易縣產區(qū)亦較高。

關鍵詞：知母 蒸發(fā)光散射 二極管陣列 知母皂苷 芒果苷

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2017）07-0177-02

一、研究的意義

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，主產于河北、安徽、山西、內蒙古等地。知母始載于《神農本草經》，具有清熱瀉火、生津潤燥、止渴除煩等功效，用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內熱消渴、腸燥便秘[1]等病證。知母的化學成分主要為甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、多糖類等，活性成分主要是甾體皂苷[2]，如知母皂苷BⅡ（timosaponinBⅡ）、芒果苷（mangiferin）等?，F代研究表明，知母具有抗菌、解熱、利膽、降血糖、降血脂等方面的藥理作用[3]。知母雖為單一品種，但分布較廣，各地產藥材之間品質差異較大。本文采用了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD法）及高效液相色譜–二極管陣列檢測法（HPLC-DAD法）比較了多個不同產地知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量[4]，為更好地控制知母藥材的質量提供了依據。

二、儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；DAD檢測器；Alltech 6000型蒸發(fā)光散射檢測器、CBL-Model9960D型超聲振蕩儀、Sartorius BSA 224S型電子天平；甲醇和乙腈（色譜級，安徽時聯特種溶劑股份有限公司），磷酸（分析級，維科特天津化工產品貿易有限公司），水為超純水。其余試劑均為分析純，芒果苷對照品（批號111607-201503，中國食品藥品檢定研究院）。知母皂苷BⅡ對照品（批號111839-201505，中國食品藥品檢定研究院）。知母藥材采集于山西、河北、吉林、安徽等地。

三、研究方法與結果

1.知母皂苷BⅡHPLC-ELSD含量測定

1.1色譜條件：色譜柱：Ultimate XB C18（4.6×250mm，5μm）；流動相：乙腈-水（25：75）；柱溫為35℃；ELSD漂移管溫度：110℃，載氣流速：3ml/min；對照品進樣量為5μl、10μl，供試品進樣量為8μl。

1.2對照品溶液的制備：取知母皂苷BⅡ對照品適量，精密稱定，加30%丙酮制成每1ml 含0.50mg的溶液，即得。

1.3供試品溶液的制備：取知母藥材粉末（過三號篩）約0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%丙酮25ml，稱定重量，超聲處理（功率400W，頻率40kHz）30min，取出，放冷，再稱定重量，用30%丙酮補足減失的重量，搖勻。濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4線性關系考察：精密吸取對照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl分別進樣，注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積的標準曲線為：Y=1.551x-5.604，r=0.9993，在0.5～12.5μg范圍內線性關系良好。

1.5 精密度試驗：精密吸取上述對照品溶液各10μl，連續(xù)進樣6次，測定知母皂苷BⅡ峰 面積，RSD為0.12%（n=6）。

1.6重現性試驗取同一批次的知母飲片粉末6份，精密稱定，按3.1.3項下方法制備供試品溶液，進樣10μl，測定知母皂苷BⅡ含量平均為7.56%，RSD為1.01%。

1.7穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液放置室溫，每次進樣10μl，分別在0、4、8、16、24、32h測定，峰面積的RSD為0.51%，表明樣品在32h內穩(wěn)定。

1.8加樣回收率考察：取知母藥材粉末0.15g，精密稱定，加入知母皂苷BⅡ對照品適量，混合均勻后按照供試品溶液的制備及含量測定方法同法操作，測定知母皂苷BⅡ的含量，結果為知母皂苷BⅡ平均回收率為99.09%，RSD為1.68%。

1.9不同產地知母樣品中知母皂苷BⅡ含量測定：按照上述條件、方法，別精密吸取對照品溶液5μl、10μl，供試品溶液8μl，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程計算，即得樣品中知母皂苷BⅡ的含量，含量結果見表1，色譜圖見圖1、圖2。

2.芒果苷HPLC-DAD含量測定

2.1色譜條件：色譜柱：Wondasil C18（4.6×200mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：84）；流速為1.0mL/min；檢測波長為258nm；柱溫為35℃；進樣量為10μl。

2.2對照品溶液的制備：取芒果苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備：取知母飲片粉末（過三號篩）約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，超聲處理（功率400W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻。濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關系考察：精密吸取對照品溶液適量置容量瓶中，用稀乙醇配制成含芒果苷濃度1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μg·ml-1的對照品溶液，依次取上述溶液各10μl注入液相色譜儀中，以芒果苷的濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，并進行線性回歸，結果芒果苷 的標準曲線為：Y=72897x-21322，r=0.9999，在1.0～40.0μg·ml-1范圍內線性關系良好。

2.5精密度試驗：精密吸取上述對照品溶液各10μl，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，RSD為0.94%（n=6）。

2.6重現性試驗：取同一批次的知母飲片粉末6份，精密稱定，按3.1.3項下方法分別制備供試品溶液，進樣10μl，測定芒果苷含量平均為1.25%，RSD為1.51%。

2.7穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液放置室溫，分別在0、4、8、16、24、32h進樣10μl測定樣品含量，峰面積的RSD為1.67%，表明樣品在32h內穩(wěn)定。

2.8加樣回收率考察：取一定量已知含量的樣品6份，加入含芒果苷的高、中、低三個濃度的對照品溶液適量，混合均勻后按照供試品溶液的制備及含量測定方法同法操作，結果為芒果苷平均回收率為99.48%，RSD為1.44%。

2.9不同產地知母樣品中芒果苷含量測定：按照上述條件、方法，測定樣品中芒果苷的含量，含量結果見表1，色譜圖見圖3和圖4。

四、討論

本法首先采用二極管陣列檢測器，對知母藥材進行全波長掃描，建立知母藥材全波長三維掃描圖譜，確定了知母藥材的最大吸收波長為（258nm）芒果苷，同時比較了多種比例的流動相包括乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液、乙腈-冰醋酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液的分離效果，結果以乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：84）的分離效果為優(yōu)，分離度較好，保留時間適中，無干擾雜峰。并采用蒸發(fā)光檢測器對知母中知母皂苷BⅡ進行了檢測；通過以知母皂苷BⅡ和芒果苷含量為指標比較不同產地的知母藥材質量。試驗結果表明，不同產地的知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量有顯著差別，以山西產地和河北易縣品質為最優(yōu)。因此本法為知母藥材的質量控制，為不同產地的知母藥材的收購及栽培等提供了有效依據。

參考文獻

[1]吉星，馮凡.知母中皂苷類成分研究進展[J].中草藥，2010，41（4）：附12-附15.

[2]韓兵，李春梅，李敏等.知母皂苷的降脂及抗動脈粥樣硬化作用[J].上海中醫(yī)藥雜志，2006，40（11）：68-70.

[3]羅潔，范旭航，崔思嬌等.知母的UPLC、指紋圖譜及聚類分析[J].中國現代應用藥學，2013，30（1）：28-31.