翡翠貽貝不同醇沉物體外抗氧化活性研究

劉淑集，羅欽欽，潘裕添，劉智禹，蘇永昌，林嬌芬，陳錦權(quán)

1(福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州，350002) 2(福建省水產(chǎn)研究所， 福建 廈門，361013)3(閩南師范大學(xué) 菌物工程技術(shù)研究中心，福建 漳州，363000)4(福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門，361013)

翡翠貽貝不同醇沉物體外抗氧化活性研究

劉淑集1,2，4，羅欽欽3，潘裕添3，劉智禹2，4，蘇永昌2，4，林嬌芬3，陳錦權(quán)1*

1(福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州，350002) 2(福建省水產(chǎn)研究所， 福建 廈門，361013)3(閩南師范大學(xué) 菌物工程技術(shù)研究中心，福建 漳州，363000)4(福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門，361013)

翡翠貽貝；分級(jí);醇沉；抗氧化

自由基，是人體生命過程中生化反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，種類非常多。但是過多的自由基會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生攻擊，且攻擊途徑是多方面的，會(huì)引起人體細(xì)胞、分子甚至器官受損，導(dǎo)致病變，從而產(chǎn)生各種各樣的疑難雜癥[1]。因此為了防止機(jī)體受到自由基損傷，各種抗氧化保健品的研究成為了人們的研究熱點(diǎn)[2]。然而由于很多工業(yè)上的抗氧化劑是人工合成，對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒性。因此，利用我國豐富的資源尋求天然的、對(duì)人體無毒害的抗氧化劑成為了當(dāng)下抗氧化科學(xué)研究領(lǐng)域的重要突破口。

迄今為止，人們對(duì)海洋生物資源的開發(fā)和糖類藥物的研究不斷增多，已有研究表明，貝類中的糖復(fù)合物是貝類體內(nèi)一種含量豐富的生物活性物質(zhì)，是創(chuàng)新型藥物和功能型保健食品的重要資源，具有良好的應(yīng)用前景。例如具有抗衰老作用的波紋巴非蛤多糖、文蛤多糖等；具有抗腫瘤作用的牡蠣多糖、珠母貝糖胺聚糖等；具有抗病毒作用的牡蠣糖胺聚糖、扇貝裙邊糖胺聚糖等[3]。翡翠貽貝(Pernaviridis)是海產(chǎn)雙殼貝類，俗稱海虹，廣泛分布在我國福建、浙江，山東，遼寧等沿海地帶，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富。蘇頌的《本草圖經(jīng)》記載，其有“補(bǔ)五臟，益陽事，消宿食”等功效，現(xiàn)代研究表明，貽貝中多種活性物質(zhì)具有抗菌、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等作用且安全無毒害[4]，因而在臨床的應(yīng)用中將會(huì)有越來越廣泛的前景。因此，本文通過采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級(jí)沉淀翡翠貽貝提取物，獲得不同醇沉物，并比較不同組分在體外化學(xué)體系中對(duì)清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基(·O2-)、羥自由基(·OH)、總抗氧化能力及抑制肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化作用(LPO)的影響，研究其抗氧化活性，旨在為翡翠貽貝功能性食品及天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

翡翠貽貝(Pernaviridis)：購自廈門市東渡水產(chǎn)品市場，活貝購回后立即取肉、勻漿、均質(zhì)、分裝，-18 ℃冷凍備用。

KM小鼠，SPF級(jí)，體重(20±2) g，雄性，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院(動(dòng)物中心)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2014-0002)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2) ℃，光照12 h/日，自由取食和飲水，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d。

基礎(chǔ)飼料，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院(動(dòng)物中心)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑

抗壞血酸、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、醋酸鹽緩沖液、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、FeSO4、水楊酸-無水乙醇、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸、FeCl3、磷酸鹽緩沖液、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、FeCl3、HCl、H2O2均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2102 PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS 124 S型電子分析天平，德國Sartorius公司；PRO 200型組織勻漿器，美國PRO Scientific公司；Centrifuge 5810 R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；50型膠體磨，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SPX-250 B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BCD-216 TX型電冰箱，青島海爾股份有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；LG-0.2型真空冷凍干燥機(jī)，上海沃迪科技有限公司；TC 101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 翡翠貽貝不同醇沉物的制備[4-5]及其成分分析

取于-18 ℃低溫貯藏的翡翠貽貝均質(zhì)勻漿液若干袋，稱其質(zhì)量m克，放入燒杯中，加入等質(zhì)量的水，于60 ℃恒溫水浴浸提1.5 h，離心取上清液，加入無水乙醇，使其終濃度為45%，-20 ℃靜置12 h，8 000 r/min離心10 min，沉淀即為45%乙醇提取物，命名為ME45，上清液繼續(xù)加入無水乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，分別得到ME60和ME80翡翠貽貝提取物。

將得到的3種翡翠貽貝醇沉物凍干備用。采用苯酚硫酸法測定總糖含量，凱氏定氮法測定總氮含量；GB 5009.3—2010直接干燥法測定水分含量；GB 5009.4—2010灼燒稱重法測定灰分含量；硫酸鋇比濁法測定硫酸根含量。

1.4.2 總抗氧化活力的測定——FRAP(ferric reducing antioxidant power)法[6-7]

FRAP工作液的配制：0.3 mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH 3.6) 25 mL、10 mmol/L的TPTZ溶液(用40 mmol/L HCl配制)2.5 mL、20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL。用前37 ℃預(yù)熱。

FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以0.01～0.1 mmol/L FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足到2.0 mL，加入FRAP工作液3.0 mL混勻，置于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min，測定OD593nm，重復(fù)3次，計(jì)算其平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在試管中加入2.0 mL一定濃度的樣品水溶液，后按上述方法測定翡翠貽貝不同醇沉物的的OD593nm值。抗氧化活性以相同吸光度值的FeSO4濃度表示。

1.4.3 對(duì)DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照SHANKAR[8]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。在試管中加入1.0 mL一定濃度的樣品水溶液，再加入4.0 mL DPPH 溶液(0.1 mmol/L，用無水乙醇配制)，充分混合均勻，室溫下靜置30 min，然后測定OD517 nm吸光值，記作A，用無水乙醇替代DPPH，測吸光值為A1，以蒸餾水代替樣品溶液，測吸光度為A0。以VC作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

(1)

式中：C1,樣品對(duì)DPPH自由基的清除率,%;A0,空白管的吸光值;A,加入樣品后的吸光值;A1,未加DPPH樣品溶液本底的吸光值。

1.4.4 對(duì)超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力的測定

·O2-清除能力的測定方法參照范秀萍[9]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。在試管中加入1.0 mL蒸餾水，3.5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.04)，0.5 mL 10 mmol/L鄰苯三酚溶液，立即迅速混勻，測定OD325nm，30 s后開始記錄數(shù)據(jù)A1，每過30 s記錄一次吸光值，直到3.5 min(A2)，用10 mmol/L的鹽酸代替鄰苯三酚作為空白對(duì)照，計(jì)算鄰苯三酚自氧化速率。吸取一定濃度的的樣品水溶液1.0 mL，按照上述方法，測定加入樣品后的OD325nm，并計(jì)算加樣后鄰苯三酚自氧化速率。測定VC作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

(2)

(3)

式中：A1,第30 s的吸光值；A2,第3.5 min的吸光值；S0，鄰苯三酚自氧化速率；S1，加樣后鄰苯三酚自氧化速率；C2，樣品對(duì)·O2-的清除率,%。

1.4.5 對(duì)羥自由基(·OH)清除能力的測定

清除羥自由基(·OH)能力測定參照MOHAMMADA[10]方法進(jìn)行改進(jìn)。在試管中加入一定濃度的樣品水溶液1.0 mL，然后加入9 mmol/L水楊酸-無水乙醇、8.8 mmol/L H2O2、和9 mmol/L FeSO4各0.5 mL，充分混勻，置于37 ℃恒溫水浴0.5 h，測定OD510nm吸光值，記為A，用蒸餾水代替H2O2，測定吸光值為A1，以蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光值為A0，以VC作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

(4)

式中：C3，樣品對(duì)·OH 的清除率,%;A，加樣后溶液的吸光值;A0，空白管的吸光值;A1，未加入的樣品溶液的吸光值。

1.4.6 體外抗肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的測定[11]

小白鼠禁食隔夜16 h 后處死，迅速取肝臟，用4 ℃生理鹽水清洗擦干，冰浴下勻漿，制成10%的肝組織液。在試管中加入一定濃度的樣品水溶液，然后加入1.0 mL的肝組織液液，充分混勻，置于37 ℃水浴3 h，后立即加入1.5 mL濃度為20%的三氯乙酸，混勻，3 500 r/min離心10 min。取3.0 mL上清液，加入1.5 mL 0.67%的TBA，置于90 ℃水浴15 min，后冷卻離心，測定上清液的OD532 nm。對(duì)照組用不加樣品水溶液，以生理鹽水代替；空白組不加樣品水溶液和肝臟組織液。計(jì)算肝組織脂質(zhì)過氧化(LPO)的抑制率。

(5)

式中：C4，LPO抑制率,%;A，對(duì)照組的吸光值，Ai，各樣品組的吸光值。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 翡翠貽貝不同醇沉物的成分分析

乙醇分級(jí)沉淀體系，與物質(zhì)的分子質(zhì)量及極性有關(guān)。低濃度的乙醇能沉淀出黏液質(zhì)、淀粉、高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，隨著乙醇濃度的升高，分子質(zhì)量較小的物質(zhì)逐漸沉淀出來，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%以上時(shí)，幾乎可以沉淀出所有的多糖、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等小分子[12]。通過加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀翡翠貽貝粗提物獲得ME45、ME60和ME80三種翡翠貽貝醇沉物。分別測定其總氮、總糖、硫酸根、水分、灰分等基本成分，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，3種醇沉物均含有蛋白質(zhì)、多糖、硫酸酯等物質(zhì)。ME45、ME60和ME80的蛋白質(zhì)與多糖之和分別為71.91%、73.79%和74.14%。蛋白質(zhì)與多糖含量之和以及所有測試項(xiàng)目之和均隨著乙醇濃度的升高而增加，說明通過由低到高的乙醇濃度的分級(jí)沉淀之后，醇沉物的純度也隨著提高。醇沉物ME80中的多糖含量最高，且硫酸根含量是前面2個(gè)組分的10倍，說明該組分中的多糖的硫酸化程度高，含有較多的多糖硫酸酯。同時(shí)，ME80的灰分含量最高，是由于高濃度的乙醇將無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)一并沉淀。

表1 翡翠貽貝不同醇沉物的成分分析 單位：%

2.2 體外抗氧化活性的檢測

2.2.1 總抗氧化活力的檢測

一般情況下，抗氧化劑通過自身還原作用給出電子達(dá)到清除自由基的目的[13]，因此其還原力越強(qiáng)，它的抗氧化能力也就越強(qiáng)。Fe3+-TPTZ在酸性條件下可被還原為Fe2+-TPTZ而呈藍(lán)色，在593nm處有最大吸光值。因此，根據(jù)吸光值的大小可判定總抗氧化能力的大小。

a：標(biāo)準(zhǔn)曲線；b：ME 80，ME60和ME45的總抗氧化能力圖1 翡翠貽貝不同醇沉物的總抗氧化能力的測定Fig.1 Total antioxidative capacity of differnet EtOH deposition fractions from P. viridis extract

從圖1-a標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可以看出，F(xiàn)eSO4濃度在0～0.1 mmol/mL內(nèi)與吸光值的線性關(guān)系良好，回歸方程式為y=9.831 5x+0.019 5，R2=0.996 6，這與江慎華、HUANG、董曉靜等研究一致[3, 12-13]。由圖1-b可以看出，ME45，ME60和ME80的總抗氧化能力基本與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到16 mg/mL后，3種樣品的總抗氧化能力已經(jīng)基本趨于平緩。通過總抗氧化能力的測定結(jié)果，可以看出ME60和ME80總抗氧化能力要優(yōu)于ME45，且存在最佳的濃度范圍。3種不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級(jí)醇沉的提取物均具有一定的總抗氧化活力，為其清除自由基或具備抗氧化作用奠定一定的基礎(chǔ)。

2.2.2 對(duì)DPPH自由基清除能力的檢測

由圖2-a可知，Vc在0.1～1.0mg/mL質(zhì)量濃度呈顯著的量效關(guān)系，當(dāng)Vc濃度達(dá)1.0mg/mL時(shí)清除率幾乎達(dá)到100%。由圖2-b可以看出，翡翠貽貝3種不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀物ME45、ME60和ME80對(duì)DPPH自由基均有清除作用，且隨著濃度的增加，清除率明顯提高，呈明顯的量效關(guān)系。在相同濃度下，ME60對(duì)DPPH自由基的清除率最大，其次是ME80，ME45最小。當(dāng)濃度為20 mg/mL時(shí)，ME80、ME60、ME45的清除率分別為60.23%，73.98%，34.78%，其擬合曲線方程式分別為y=9.789 3 Ln(x)-1.357 9，R2=0.897 0；y=22.731Ln(x)+0.024 6，R2=0.883 8；y=19.418Ln(x)-6.917 1，R2=0.890 4，根據(jù)曲線方程式計(jì)算IC50分別為16.55、9.01、34.17 mg/mL。因此，結(jié)果表明ME80、ME60對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用，ME60的樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于ME80(P<0.01)，ME45對(duì)DPPH自由基的清除能力較弱。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除DPPH自由基的能力圖2 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on DPPH

2.2.3 對(duì)超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力的檢測

翡翠貽貝3種不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀物ME45、ME60和ME80對(duì)·O2-的清除作用如圖3所示。Vc對(duì)·O2-的清除作用高于翡翠貽貝不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物。由圖3-b可以看出，ME45、ME60和ME80對(duì)·O2-均具有清除能力，且呈顯著的量效關(guān)系。當(dāng)濃度達(dá)16 mg/mL時(shí)，ME80對(duì)·O2-的清除率達(dá)到最大，為99.78%，ME60和ME45的清除率分別為70.03%、51.98%。ME80、ME60和ME45的清除率擬合曲線方程式分別為y=31.501Ln(x)+7.195 1，R2=0.978 6；y=31.850Ln(x)-20.022，R2=0.965 5；y=26.882Ln(x)-23.947，R2=0.898 7。根據(jù)曲線方程式計(jì)算ME80，ME60和ME45清除·O2-的IC50分別為3.89、9.01、15.66 mg/mL。因此表明，ME80、ME60和ME45對(duì)·O2-具有一定的清除作用，ME80對(duì)的清除能力優(yōu)于ME60和ME45(P<0.01)。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除·O2-的能力圖3 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對(duì)·O2-的清除能力Fig.3 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on·O2-

2.2.4 對(duì)羥自由基(·OH)清除能力的檢測

由圖4-a可以看出，Vc為0.05～0.3 mg/mL呈顯著的量效關(guān)系。當(dāng)Vc濃度達(dá)0.3mg/mL時(shí)清除率幾乎達(dá)到100%，說明Vc具有顯著的清除羥自由基能力。由圖4-b可以看出，翡翠貽貝3種不同體積分?jǐn)?shù)醇沉物ME45、ME60和ME80對(duì)·OH均有清除作用，且隨著濃度的增加，清除率明顯提高，顯著正相關(guān)。當(dāng)濃度大于3 mg/mL，ME80和ME45對(duì)·OH的清除率相差不大，增速減緩。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，ME80、ME60和ME45對(duì)·OH的清除率分別為98.37%、63.81%、98.53%，其擬合曲線方程式分別為y=41.517Ln(x)+33.660，R2=0.953 8；y=24.697Ln(x)+21.279，R2=0.933 5；y=25.128Ln(x)+58.481，R2=0.984 2。根據(jù)曲線方程式計(jì)算IC50分別為0.39、3.20、0.71 mg/mL。結(jié)果表明ME80、ME60和ME45對(duì)·OH具有一定的清除作用，ME45的清除能力優(yōu)于ME80和ME60(P<0.01)。

2.2.5 對(duì)肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的檢測

脂質(zhì)過氧化作用是指多不飽和脂肪酸和脂質(zhì)氧化變質(zhì)，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物從而對(duì)脂蛋白、細(xì)胞膜等其它含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害[11]。由圖5可知，Vc對(duì)體外抑制肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用高于翡翠貽貝不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀物。隨著翡翠貽貝不同醇沉物濃度的增加，對(duì)體外抗肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用越強(qiáng)，且呈明顯的正相關(guān)效應(yīng)。ME80的抑制作用明顯高于ME60和ME45，ME60和ME45的抑制作用相差不大。當(dāng)ME80濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，對(duì)LPO的清除率達(dá)85.75%，仍然有持續(xù)上升的趨勢；當(dāng)ME60濃度達(dá)18 mg/mL時(shí)，對(duì)LPO的清除率達(dá)到最大，為44.85%；ME45在濃度為16 mg/mL時(shí)對(duì)LPO的清除率達(dá)到最大，為36.25%。上述結(jié)果表明，翡翠貽貝不同醇沉物具有抑制肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用，ME80的抑制率優(yōu)于ME60和ME45(P<0.01)。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除·OH的能力圖4 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對(duì)·OH的清除能力Fig.4 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on·OH

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除LPO的能力圖5 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對(duì)LPO的清除能力Fig.5 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on LPO

3 結(jié)論

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Studies on antioxidative activitiesinvitroof the extracts by different EtOH precipitation fromPernaviridis

LIU Shu-ji1,2，4, LUO Qin-qin3, PAN Yu-tian3, LIU Zhi-yu2，4, SU Yong-chang2，4, LIN Jiao-fen3, CHEN Jin-quan1*

1(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University 350002, China)2(Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China)3(Engineering Technological Center of Mushroom Industry,Minnan Normal University, Zhangzhou 363000,China)4(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marin Organisms in Fujian Province, Xiamen 361013,China)

In this paper, three extracts named ME45, ME60 and ME80 were precipitated by 45%, 60% and 80% EtOH fromPernaviridisrespectively. Their antioxidant activities were compared by scavenging activities for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals, superoxidized radicals (·O2-), hydroxyl radicals (·OH), total antioxidant activities (TAC), and inhibitory effect on lipid peroxidation (LPO)invitro. The results showed that all precipitations had antioxidant activities and were dose-dependent. Different antioxidant activities were shown among different reaction systmes of three fractions. In TAC, ·O2-,and LPO reaction systems, the antioxidant activities order was: ME80>ME60>ME45. ME60 fraction had better scavenging effects than ME80 and ME45 for DPPH·. In the scavenging ·OH system, the order of removing ability was :ME45>ME80>ME60. In conclusion, ME80 fraction showed relatively strong antioxidant activities, a good potential as a natural antioxidant, and worth of further exploration and application.

P.viridis; extractives; ethanol fractional precipitation; antioxidant

博士研究生(陳錦權(quán)教授為通訊作者,E-mail: chenjq6613@gmail.com)。

福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1003-9)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(閩海洋高新[2014]20號(hào))

2015-03-18，改回日期：2015-12-30

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706031