發(fā)酵液中水溶性熱凝膠提取工藝的優(yōu)化

丁含，梁贏，朱莉，高敏杰，林莉，詹曉北*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

發(fā)酵液中水溶性熱凝膠提取工藝的優(yōu)化

丁含1，梁贏1，朱莉2，高敏杰1，林莉1，詹曉北1*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

為提取純化發(fā)酵液中水溶性熱凝膠，首先采用單因素結(jié)合響應(yīng)面分析方法優(yōu)化Sevag法去除發(fā)酵液中的蛋白，在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合實驗設(shè)計(Central Composite Design)實驗原理，設(shè)計3因素5水平的響應(yīng)面分析實驗，最終得到最優(yōu)去蛋白工藝：氯仿與正丁醇體積比為3.5的Sevag試劑，按發(fā)酵上清液與Sevag試劑體積比3.75的比例加入上述試劑，振蕩混勻后靜置33 min，重復(fù)上述操作5次；此條件下蛋白去除率為85.73%，水溶性熱凝膠回收率為90.29%。對去蛋白后的處理液進(jìn)行有機(jī)溶劑法的最佳提取工藝優(yōu)化，優(yōu)化得到乙醇為最佳提取試劑，加入乙醇至終濃度為90%，混勻后靜置4 h，最后得到水溶性熱凝膠的提取率為40.12%，純度為89.10%。

水溶性熱凝膠；脫蛋白；單因素優(yōu)化；響應(yīng)面分析；多糖提取

熱凝膠是一種水不溶性、由β-1,3-糖苷鍵將葡萄糖殘基連接而成的無分支微生物胞外多糖[1]。1996 年，熱凝膠被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)作為食品添加劑，同時大量實驗也證明了熱凝膠的安全性[2]，其在食品、醫(yī)藥及生命科學(xué)領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。有研究表明，隨著熱凝膠分子量降低，其與細(xì)胞表面作用的機(jī)會更大[3]，因此，熱凝膠的分子量與其生物活性密切相關(guān)。同時熱凝膠分子量的降低也會提高其在水中的溶解度，溶解度的增加也拓寬其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

近年來的研究也越來越重視β-葡聚糖在癌癥和傳染病治療中的應(yīng)用[4]。水溶性熱凝膠作為無分支均一的一種微生物胞外多糖，產(chǎn)品具有更大的利用價值。β-1,3-低聚糖具有抗腫瘤活性[5]、誘導(dǎo)動物產(chǎn)生細(xì)胞因子[6]、提高人體免疫力等功能。針對目前有關(guān)低分子量β-1,3-葡聚糖的制備研究較少，本文以土壤桿菌和哈茨木霉混合發(fā)酵的發(fā)酵液為研究對象，進(jìn)行可溶性熱凝膠的提取工藝研究。

共培養(yǎng)發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中主要存在水溶性熱凝膠、哈茨木霉分泌的β-1,3-葡聚糖酶以及少量未被酶解的大分子不溶性熱凝膠。因此，對發(fā)酵液的主要處理在于離心去除不溶物后，脫去上清液中蛋白。多糖去蛋白的方法主要有Sevag法(氯仿和正丁醇按一定體積混合)[7]、三氟三氯乙烷法(TTF法)、三氯乙酸法(TCA法)等。Sevag法是經(jīng)典溫和的去蛋白方法，但該方法需要多次重復(fù)操作才能達(dá)到較好效果；TCA法沉淀效果比Sevag法好，但有機(jī)酸會造成多糖降解，導(dǎo)致多糖損失率高[8]，該法常用于植物多糖。本研究選擇Sevag法去除發(fā)酵液中的蛋白，并采用單因素結(jié)合響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化Sevag法。

去蛋白后的發(fā)酵液上清中大部分為可溶性熱凝膠。對于水溶性胞外多糖，可根據(jù)其溶于水而不溶于一些有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，降低其在溶液中的溶解度從而析出以達(dá)到分離的目的。主要的方法有有機(jī)溶劑沉淀法和鹽析法[9]，其中常用的有機(jī)溶劑有小分子醇類(如甲醇、乙醇、異丙醇)或丙酮等。

低分子量的水溶性熱凝膠是一類新型功能性低聚糖，它具有特殊的生理活性，正在被廣泛研究。但是目前國內(nèi)對其研究相對較少，本文是在了解熱凝膠結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的基礎(chǔ)上，針對目前涉及較少的可溶性熱凝膠的制備進(jìn)行了研究，為水溶性熱凝膠的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)ATCC 31749 ，哈茨木霉(Trichodermaharzianum) GIM 3.442均由江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)研究中心保藏。

土壤桿菌斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40.0，酵母粉 5.0，CaCO310.0，瓊脂粉 20.0，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，酵母膏1.0，MgSO40.5，KH2PO41.74，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 80.0，酵母膏1.0，KH2PO42.7，(NH4)2SO42.0，MgSO40.5，無機(jī)鹽濃縮液10 mL，pH 7.0。

哈茨木霉種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20.0，酵母粉 15.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO42.5，MgSO40.5，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30.0，米糠 20.0，KH2PO45.0，MgSO40.5，無機(jī)鹽濃縮液10 mL，pH 6.0。

無機(jī)鹽濃縮液(g/L)：FeCl31.0，NaCl 1.0，MnCl21.0，CaCl21.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

斜面保存的哈茨木霉和土壤桿菌在相應(yīng)的種子

液中分別培養(yǎng)18 h和16 h，然后以5%的接種比接入相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)18 h最后按照/(土壤桿菌)∶/(哈茨木霉發(fā)酵液)=5∶4，將哈茨木霉發(fā)酵液離心棄去上清，沉淀接入到土壤桿菌發(fā)酵液中，繼續(xù)培養(yǎng)126 h，獲得含有水溶性熱凝膠的發(fā)酵液。

1.2.2 水溶性熱凝膠提取工藝流程

1.2.3 Sevag法去蛋白單因素優(yōu)化策略(表1)

表1 去蛋白單因素優(yōu)化策略

1.2.4 Sevag法去蛋白響應(yīng)面優(yōu)化策略

通過單因素實驗，確定響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素與水平，選取氯仿與正丁醇的體積比(A)、發(fā)酵液上清與Sevag試劑的體積比(B)、萃取靜置時間(C)的最優(yōu)實驗點(diǎn)為中心點(diǎn)，對3個顯著因子進(jìn)行中心組合設(shè)計(Central Composite Design，CCD)優(yōu)化。通過Design-Expert V 8.0.6輔助設(shè)計，根據(jù)CCD實驗設(shè)計原理，進(jìn)行3因素5水平的響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計如表2所示[10]。

表2 中心組合設(shè)計實驗中的因素及水平

1.2.5 水溶性熱凝膠提取優(yōu)化(表3)

表3 水溶性熱凝膠提取優(yōu)化

1.2.6 蛋白含量和去除率測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[11]測定去蛋白后的發(fā)酵液中殘留蛋白質(zhì)含量。取1 mL稀釋至合適濃度的待測液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，室溫反應(yīng)5 min，選擇波長595 nm測其吸光度，并測定去蛋白前發(fā)酵液中總蛋白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=4.275 7x+0.002 94(R2=0.999)計算相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，按照公式(1)計算蛋白質(zhì)的去除率。

(1)

1.2.7 水溶性熱凝膠含量和提取率測定

采用蒽酮-硫酸法[12]測定去蛋白后的發(fā)酵液中總糖含量。取1 mL稀釋至合適濃度的待測液，加入4 mL濃H2SO4，酸解5 min后加入0.5%的蒽酮-乙酸乙酯試劑1 mL，搖勻后沸水浴10 min，選擇波長600 nm測其吸光度，并測定去蛋白前發(fā)酵液中總糖含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.003 9x-0.000 5(R2=0.999)計算相應(yīng)的糖含量，最后按照式(2)計算水溶性熱凝膠的回收率。

(2)

1.2.8 水溶性熱凝膠純度的測定

采用國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法[13]，即苯酚-硫酸法測定最終獲得的可溶性熱凝膠純度。取1 mL稀釋至合適濃度的待測液，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液和5 mL濃H2SO4，混勻后立即冷卻，在波長490 nm處測其吸光度，與相同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，最后按照式(3)計算水溶性熱凝膠的純度。

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 Sevag法去蛋白單因素優(yōu)化結(jié)果

Sevag試劑是氯仿和正丁醇(或戊醇)按一定比例混合得到的。其中，氯仿能使蛋白質(zhì)變性，與蛋白質(zhì)形成一種溶膠類型的復(fù)合物，正丁醇可以抑制泡沫的形成，因此，氯仿與正丁醇的比例對其蛋白去除效果影響較大。

氯仿與正丁醇體積比的優(yōu)化結(jié)果如圖1所示。隨著氯仿添加量的增加，蛋白去除效果也越佳，當(dāng)氯仿與正丁醇比例大于4∶1后，其去除蛋白質(zhì)的能力達(dá)到飽和，繼續(xù)加入氯仿蛋白的去除率并未增加，氯仿的加入也會造成多糖的損失。因此，選擇V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1的Sevag試劑進(jìn)行后續(xù)的蛋白去除，此條件下的蛋白去除率為56.18%，可溶性熱凝膠回收率為92.06%。

圖1 氯仿與正丁醇體積比對去蛋白影響Fig.1 Effect of chloroform and n-butanol volume ratio on deprotentinizaiton

Sevag試劑與發(fā)酵上清液體積比的優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。Sevag試劑添加量越大，蛋白去除率越高，但是水溶性熱凝膠的損失率也越大。綜合考慮，選擇V(Sevag試劑)∶V(發(fā)酵液上清)=1∶5，該條件下，蛋白去除率為60.39%，可溶性熱凝膠回收率為94.88%。

圖2 Sevag試劑與發(fā)酵液上清體積比對去蛋白影響Fig.2 Effect of Sevag reagent and treatment solution volume ratio on deprotentinizaiton

萃取靜置時間的優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。靜置時間延長，蛋白去除率也越高，靜置30 min后，蛋白去除率也不再增加，并且時間的延長會導(dǎo)致變性的蛋白膠體吸附多糖沉降[14]。因此，振搖后靜置30 min最佳，此時蛋白去除率為68.42%，可溶性熱凝膠回收率為93.87%。

圖3 萃取靜置時間對去蛋白影響Fig.3 Effect of extraction times on deprotentinizaiton

萃取次數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示。隨著萃取次數(shù)的增多，蛋白去除效果也越好，當(dāng)萃取次數(shù)超過5次時，蛋白去除率不再增大，并且萃取次數(shù)的增多也會造成可溶性熱凝膠的損失，導(dǎo)致回收率降低。在氯仿與正丁醇體積比為4∶1，Sevag試劑與樣液體積比1∶5，振搖后靜置30 min，重復(fù)5次的條件下進(jìn)行去蛋白實驗，最終蛋白去除率為76.54%，可溶性熱凝膠的回收率為93.87%。

圖4 萃取次數(shù)對去蛋白的影響Fig.4 Effect of extraction times on deprotentinizaiton

2.2 Sevag法去蛋白響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 實驗設(shè)計方案

利用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素的中心組合實驗設(shè)計，按照表2編碼要求，生成實驗方案見表4，其中每組實驗做3個平行實驗，結(jié)果取3個平行實驗的平均值，將實驗結(jié)果記入表4中。

表4 中心組合設(shè)計的實驗方案及響應(yīng)值

2.2.2 結(jié)果分析

通過Design-Expert軟件對表2 的實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立多元二次回歸方程如下，Y1= -3.245 72+3.307 76×A+8.454 06×B+3.601 80 ×C-0.081 570×A×B-0.034 088×A×C+0.22 403×B×C+0.263 68×A2-1.943 12×B2-0.066 882×C2，Y2=+89.556 21+22.417 90×A-12.468 55×B-0.656 80×C+0.866 94×A×B-0.244 66×A×C+1.213 33×10-3×B×C-2.930 51×A2+1.011 29×B2+0.023 854×C2。分別對Y1、Y2兩個方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5、表6所示[15]。

表5 二次模型方差分析結(jié)果(蛋白去除率)

表6 二次模型方差分析結(jié)果(可溶性熱凝膠回收率)

圖5 不同因素對蛋白去除率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contours and response surfaces between different variables on the rate of deprotentinizaiton

圖6 不同因素對水溶性熱凝膠回收率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Contours and response surfaces between different variables on therecovery of water-soluble curdlan

利用Design-Expert軟件求解方程Y1和Y2，以蛋白去除率和可溶性熱凝膠回收率兩者為指標(biāo)，求解當(dāng)?shù)鞍兹コ屎涂扇苄詿崮z回收率都最高時，得到最佳工藝：氯仿與正丁醇體積比3.52，發(fā)酵液上清與Sevag試劑體積比3.75，靜置時間32.81 min，此條件下的蛋白去除率為84.75%，多糖回收率為87.09%。

方便起見，將氯仿與正丁醇體積比設(shè)為3.5，發(fā)酵液上清與Sevag試劑體積比3.75，靜置33 min，重復(fù)5次，進(jìn)行工藝驗證，實際測得響應(yīng)面優(yōu)化條件下蛋白去除率85.73%，水溶性熱凝膠回收率為90.29%，這與理論預(yù)測值相比無顯著差異，因此采用CCD的中心組合實驗設(shè)計優(yōu)化的水溶性熱凝膠去蛋白工藝條件可靠。

2.3 水溶性熱凝膠提取優(yōu)化結(jié)果

以4倍體積的溶劑進(jìn)行水溶性熱凝膠的提取，提取溶劑的種類對提取率的影響如圖7所示。由圖7可以看出，在4倍體積提取溶劑的濃度下，乙醇和丙酮提取效果較好，提取率分別為22.0%和22.8%。對該數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可知，乙醇和丙酮對水溶性熱凝膠的提取率無顯著性差異(P=0.826>0.05)?？紤]到乙醇更加安全、可靠[18]，而且在提取過程中也發(fā)現(xiàn)乙醇脫除發(fā)酵液中色素能力明顯優(yōu)于丙酮，因此選擇乙醇作為水溶性熱凝膠的最佳提取試劑[19]。

圖7 不同提取溶劑的影響Fig.7 Effect of different extraction solutions

終體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇對水溶性熱凝膠的提取率如圖8所示，隨著乙醇的加入，越來越多的糖會析出，當(dāng)乙醇體稷分宭達(dá)到90%時，水溶性熱凝膠的提取率可達(dá)32.41%。

圖8 乙醇終濃度的影響Fig.8 Effect of different final ethanol concentration

以終體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇對去蛋白后的樣液進(jìn)行處理，分別靜置1、2、3、4、5 h后水溶性熱凝膠的提取率如圖9所示。從圖9中可以看出，1 h后多糖基本全部析出。但在靜置過程中發(fā)現(xiàn)，加入乙醇后，多糖會慢慢沉淀至底部，1 h時體系中的多糖并未完全沉降至底部，到4h時，多糖全部沉降至底部，可直接將上清傾倒出來，減少了離心的次數(shù)，簡化工藝。因此選擇靜置4 h為水溶性熱凝膠的提取時間，此時水溶性熱凝膠提取率為40.12%，得到水溶性熱凝膠純度為89.10%。

圖9 提取時間的影響Fig.9 Effect of different extraction time

3 結(jié)論

熱凝膠不溶于中性和酸性溶液，僅溶于pH大于12的堿性溶液和少數(shù)有機(jī)溶劑(如DMSO)中，因此發(fā)酵過程中熱凝膠的提取多采用酸沉堿溶的方法。通過共培養(yǎng)發(fā)酵所得的熱凝膠多糖可溶于水中，發(fā)酵結(jié)束后多糖溶于發(fā)酵液中，無法通過調(diào)節(jié)pH的方法提取，因此可溶性熱凝膠的提取需要探索出一種新的方法。本研究建立了一種從發(fā)酵液中提取純化β-1,3-低聚糖(水溶性熱凝膠)的方法。單因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化Sevag法去除發(fā)酵液上清中的蛋白，配制氯仿與正丁醇的體積比3.5∶1的Sevag試劑，按Sevag試劑與發(fā)酵上清液的體積比3.75∶1的比例進(jìn)行萃取，振搖后靜置33 min，重復(fù)去除5次，最終發(fā)酵液中蛋白去除率達(dá)到85.73%，可溶性熱凝膠回收率為90.29%；然后，在脫蛋白后的處理液中加入乙醇至終濃度90%，混合均勻后靜置4 h，棄去上清，離心回收沉淀，真空干燥得到可溶性的熱凝膠多糖，提取率達(dá)40.12%，純度達(dá)到89.10%。

可溶性熱凝膠作為一種功能性低聚糖，具有活性強(qiáng)、毒副作用低的特點(diǎn)，是目前多糖領(lǐng)域中比較重要的一種。本文建立了一種可溶性熱凝膠的提取純化工藝，得到的低分子量熱凝膠可復(fù)溶于水中，拓寬了熱凝膠在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，為其后續(xù)在生理方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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The optimal extraction of soluble curdlan from fermentation liquid

DING Han1,LIANG Ying1,ZHU Li2,GAO Min-jie1,LIN Li1,ZHAN Xiao-bei1*

1(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Jiangsu Rayguang Biotech Co. Ltd., Wuxi 214125, China)

In order to extract and purify the water-soluble curdlan from the fermentation broth, the single-factor experiment combined with response surface analysis was used to optimize the Sevag method to remove the protein in the fermentation broth. Based on the results of single-factor tests and the Central Composite Design experimental design principles, a response surface methodology which has three factors and five levels was designed to optimize the process. The optimal conditions for deprotenizing by these methods were found to be five treatment cycles with a mixture of chloroform and n-butyl alcohol (3.5∶1，V/V) at a solid-to-solvent ratio of 3.75∶1(V/V) for 33 minutes. Under these conditions, the rate of deprotentinizaiton and polysaccharide recovery was 85.7307% and 90.2974%, respectively. Then, the optimum extraction technology of the organic solvent was optimized. The ethanol was added as the best extraction reagent to the final concentration of 90%. After the mixture was left to stand for 4 hours，extraction rate of water-soluble curdlan could reach 40.12%.

water-soluble; curdlan deprotentinizaiton; single-factor experiment; response surface analysis; extraction of polysaccharides

碩士研究生(詹曉北教授為通訊作者，E-mail:xbzhan@yahoo.com)。

江南大學(xué)自主科研計劃-重點(diǎn)項目( JUSRP51632A)；國家自然科學(xué)基金(31171640)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151122)

2017-01-06，改回日期：2017-02-24

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706018