pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化性的影響

李超，蒲彪，羅松明，劉興艷，徐丹萍，付本寧，潘姝璇，蔣培基，王春霞，李強(qiáng)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化性的影響

李超，蒲彪*，羅松明，劉興艷，徐丹萍，付本寧，潘姝璇，蔣培基，王春霞，李強(qiáng)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

以花椒籽仁分離蛋白為原料，測定不同pH和NaCl濃度條件下花椒籽仁分離蛋白的乳化活性、乳化穩(wěn)定性、乳化顆粒粒徑分布，并用光學(xué)顯微鏡觀察乳化液的顯微結(jié)構(gòu)以及SDS-PAGE凝膠電泳檢測具有乳化作用蛋白質(zhì)條帶。結(jié)果表明，pH和NaCl對花椒籽仁分離蛋白的乳化特性具有顯著影響，隨著pH值的增大，乳化活性、乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，在pH=3時都達(dá)到了最低值，具有較高的一致性；相反乳化顆粒平均粒徑(D4,3)則是先增大后減小，pH=3時乳化顆粒粒徑最大(D4,3=1.87 μm)。NaCl的添加對花椒籽仁分離蛋白的乳化活性、乳化穩(wěn)定性有減弱作用，促進(jìn)了乳化顆粒的絮集，增大乳化顆粒的平均粒徑(D4,3)。通過對乳化液的顯微結(jié)構(gòu)觀察，在pH=3和NaCl濃度達(dá)到1.2 mol/L時，乳化顆粒大且存在明顯絮集現(xiàn)象。此外，通過SDS-PAGE凝膠電泳得出具有乳化作用的蛋白質(zhì)有3個條帶，分子質(zhì)量分別約為5、7、21 kDa。

花椒籽仁；分離蛋白；pH；NaCl；乳化性

花椒籽，中醫(yī)名椒目，球型，是花椒的主要副產(chǎn)物，可分為籽皮與籽仁兩部分，其中籽仁質(zhì)軟色白，含有豐富的油脂和蛋白質(zhì)[1]?；ń纷讶手写值鞍缀繛?1.17%[2]，高于南瓜籽[3]，核桃[4-5]，鷹嘴豆[6-8]等，與大豆蛋白的蛋白質(zhì)含量接近[9]。而且其氨基酸組成較為全面，含有人體必需的8種氨基酸[2]，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。

乳化性是蛋白質(zhì)主要的功能性質(zhì)之一，在食品、營養(yǎng)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都扮演著重要的角色，尤其應(yīng)用于諸多食品的配方，例如黃油、牛奶、冰淇淋[10-11]。蛋白質(zhì)乳化性除了受到自身理化性質(zhì)的影響，包括分子構(gòu)象、溶解性、疏水性等[12-14]以外，還受環(huán)境因素的影響，如溫度、pH、NaCl濃度、蛋白質(zhì)濃度、油相體積分?jǐn)?shù)[15-20]。由于植物蛋白具有良好的乳化性和脂肪吸附能力，更多的應(yīng)用于食品加工中[21]。近年來許多研究者以南瓜籽蛋白[16, 22]、棗椰樹種子蛋白[23]、油菜籽蛋白[17]、甘薯蛋白[18]等新型植物蛋白質(zhì)資源作為實(shí)驗(yàn)原料，研究不同因素對其乳化性的影響。有關(guān)花椒籽蛋白質(zhì)乳化性的研究甚少，寇明鈺[24]和楊令葉[2]以乳化活性(emulsifing activity index, EAI)及乳化穩(wěn)定性(emulsifing stability index, ESI)作為分析指標(biāo)，分別對花椒籽全籽蛋白和花椒籽仁蛋白的乳化性進(jìn)行了初步的研究。本實(shí)驗(yàn)通過分析EAI、ESI、乳化顆粒粒度、乳化顆粒分布，較為全面地研究pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化性的影響并測定了參與乳化作用蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽，蛋白質(zhì)含量約為22.67%，四川省洪雅縣幺麻子食品有限公司；大豆油，雅安市吉選超市；十二烷基硫酸鈉(SDS)，美國Sigma公司； SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、蛋白質(zhì)MARKER，上海源葉生物科技有限公司；考馬斯R-250，美國Sigma公司；NaCl、HCl、乙醇、醋酸、NaOH、蔗糖等均為AR。

1.2 儀器與設(shè)備

CP225D型電子天平，德國Sartorius公司；LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；KDN-C型凱氏定氮儀，上海新嘉電子有限公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠制造；MICROMAX型高速離心機(jī)，美國Thermo公司；Varionskan flash型全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo fisher公司；Rise2008型激光粒度分析儀，濟(jì)南潤之科技有限公司；CX31RTSF型生物顯微鏡，日本Olympus公司；1658000小型垂直電泳儀，Geldoc XR System型凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

(1)原料預(yù)處理?；ń纷呀?jīng)破碎去殼、烘干、粉碎至過40目篩，以石油醚作為提取劑在料液比為1∶13(g∶mL)的條件下脫去花椒籽仁中的油脂，脫脂后的花椒籽仁再次烘干并粉碎至80目備用；

(2)鹽提法提取花椒籽仁蛋白質(zhì)。脫脂后的花椒籽仁按照1∶20(g∶mL)的料液比加入1.2 mol/L NaCl溶液，并用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11，50 ℃氣浴振蕩提取35 min，在此條件下蛋白質(zhì)提取率為88.77%。離心(4 000 r/min, 20 min)后取上清液透析72 h，再經(jīng)真空冷凍干燥制得分離蛋白樣品，并按照GB5009.5-2010測得蛋白質(zhì)純度為93.17%，存放4 ℃?zhèn)溆茫?/p>

(3)取上述花椒籽仁分離蛋白樣品于室溫下分別溶解于不同pH值(1、3、5、7、9、11、13)和不同NaCl濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L)溶液中，渦旋混勻后調(diào)至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10 g/L的溶液；

(4)取3 mL蛋白質(zhì)溶液與1 mL大豆油混合，經(jīng)高速均質(zhì)(16 000 r/min, 60 s)，得到新鮮乳化液。

1.3.2 pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

采用濁度法，參照PEARCE 等[25]并做改進(jìn)。均質(zhì)后立即取5 μL乳化液，加入1 g/L的SDS至5 mL并混勻，于500 nm處測定吸光值，記為A0。10 min后另取5 μL乳化液體再次測定，記為A10。EAI與ESI的計(jì)算如公式(1)、(2)：

(1)

(2)

式中：c，蛋白質(zhì)溶液濃度，g/mL；1，光徑，cm；φ，油相體積分?jǐn)?shù)，25%；t，靜置時間，10 min；N，稀釋倍數(shù)，1 000；A0，均質(zhì)后0 min乳化液吸光值；A10，均質(zhì)后10 min乳化液吸光值。

1.3.3 pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化顆粒粒徑分布的影響

取1.3.1蛋白質(zhì)乳化液1 mL用10 g/L的SDS溶液稀釋到10 mL并混勻，測定乳化顆粒粒徑分布，以乳化顆粒的平均粒徑(D4,3)作為分析指標(biāo)。

1.3.4 pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化液的微觀結(jié)構(gòu)的影響

取1.3.1蛋白質(zhì)乳化液1 mL加入1 g/L的SDS溶液稀釋到5 mL，混勻后采用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照處理。

1.3.5 界面蛋白質(zhì)分子量的測定

將1.3.1蛋白質(zhì)乳化液與500 g/L蔗糖溶液等體積混合，從底部吸取混合液2 mL置于7 mL 50 g/L的蔗糖溶液，渦旋后離心(4 000 r/min, 30 min)，-20 ℃放置24 h；取乳化液滴層與適量10 g/L的SDS溶液混合，做SDS-PAGE分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白EAI及ESI的影響

2.1.1 pH對花椒籽仁分離蛋白EAI及ESI的影響

pH對花椒籽仁分離蛋白EAI及ESI均有顯著影響(P<0.05)。如圖1所示，隨著pH的增大，花椒籽仁分離蛋白EAI先減小后增大，pH=3時，乳化活性(EAI=56.58 m2/mg)相對較差。

這可能是因?yàn)?pH的變化引起蛋白質(zhì)表面凈電荷的變化，改變?nèi)芙舛鹊拇笮?，從而引起乳化性的變化。楊令葉[2]的研究得出花椒籽仁等電點(diǎn)在3.5～4，pH=3接近其等電點(diǎn)，溶解度低，參與乳化作用的蛋白質(zhì)量少，EAI也?。籶H值偏離等電點(diǎn)使得埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的官能團(tuán)暴露出來，蛋白質(zhì)溶解性增加，參與乳化作用的蛋白質(zhì)量增大，EAI隨之增大。LESTARI等[13]、YULIANA等[26]、FIDELIS NNADOZIE[27]分別研究了麻風(fēng)樹種子蛋白、腰果殼蛋白、甜瓜籽蛋白的乳化性，也得出隨著pH值的增大，EAI有先減小后增大的趨勢，并猜測這與蛋白質(zhì)的溶解性關(guān)聯(lián)較大。相比于酸性條件，堿性條件下花椒籽仁分離蛋白具有更好的乳化活性，這可能是花椒籽仁蛋白質(zhì)在堿性條件下發(fā)生改性，增強(qiáng)了與油相之間的作用[28]。

隨pH值的變化，花椒籽仁分離蛋白ESI與EAI整體變化趨勢一致，總體呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，這與LESTARI等[13]、鄭亞軍等[29]、AKASHA等[23]研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)作為大分子的乳化劑，可在油滴表面生成大分子的薄膜，穩(wěn)定O/W乳液，蛋白質(zhì)變性后可被吸附在界面形成單分子層，其中所含氨基酸殘基的疏水集團(tuán)指向油相，而親水性基團(tuán)指向水。pH=3時，花椒籽仁分離蛋白質(zhì)溶解度減小，O/W界面處吸附得蛋白質(zhì)變少，穩(wěn)定界面的薄膜受破壞，容易絮集在一起甚至發(fā)生合并，ESI小。pH值偏離等電點(diǎn)，更多的蛋白質(zhì)吸附到O/W界面處，被吸附的蛋白質(zhì)一層層的堆積在油滴外，結(jié)構(gòu)緊密，防止了合并作用的發(fā)生，提高了乳化穩(wěn)定性。

2.1.2 NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白EAI及ESI的影響

如圖2所示，NaCl的添加使花椒籽仁分離蛋白EAI及ESI降低且影響顯著(P<0.05)。

圖2 NaCl對花椒籽仁分離蛋白乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響Fig.2 Emulsification activity and stability indices for Zanthoxylum bungeanum Maxim seed kernel protein isolate as a function of NaCl concentration

未添加NaCl時，乳化活性高(EAI=68.26 m2/mg)，乳化液穩(wěn)定(ESI=52.94 min)。NaCl濃度從0到0.2 mol/L，EAI顯著降低，隨著NaCl濃度不斷增大，其乳化活性略有下降并逐漸趨于平穩(wěn)。NaCl添加使蛋白質(zhì)表面電荷減少[30]，蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力減小，發(fā)生了鹽析作用，與油滴結(jié)合的蛋白質(zhì)量降低，EAI減小；穩(wěn)定O/W界面的薄膜穩(wěn)定性變差。同時較高濃度NaCl可能破壞了油滴表面的大分子薄膜，導(dǎo)致了乳化顆粒合并作用的發(fā)生，ESI減小。ZHANG等[31]通過研究NaCl濃度對鷹嘴豆蛋白乳化性影響，得出NaCl的添加會降低鷹嘴豆蛋白質(zhì)EAI及ESI。

2.2 pH和NaCl濃度對乳化顆粒粒徑分布的影響

2.2.1 不同pH對乳化顆粒的粒徑分布的影響

乳化顆粒粒徑分布的測定以乳化顆粒平均直徑(D4,3)表示。蛋白質(zhì)與油脂發(fā)生乳化作用，形成的乳化顆粒D4,3越小，蛋白質(zhì)的乳化性越好。pH對乳化顆粒D4,3影響顯著(P<0.05)，如圖3所示，在pH值為3時達(dá)到最大值，遠(yuǎn)離pH=3，D4,3逐漸減小，整體表現(xiàn)為先增大后減小趨勢，對乳化性的影響則是乳化性先增大后減小，這與乳化活性所測結(jié)果相吻合。這可能是因?yàn)樵趐H=3時，吸附在油滴表面的蛋白質(zhì)含量最少，且蛋白質(zhì)表面電荷減少，相互之間的靜電排斥力減小，少量吸附在油滴表面的蛋白質(zhì)通過范德華力使乳化顆粒絮集在一起，此時D4,3最大。當(dāng)溶液pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時，更多的蛋白質(zhì)吸附到吸附到油滴表面，形成更加穩(wěn)定的大分子薄膜，同時蛋白質(zhì)之間靜電排斥力增大，防止了絮集與合并的發(fā)生，D4,3較小。LIANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白在pH=5時乳化作用形成乳化顆粒D4,3最大，遠(yuǎn)離pH=5時D4,3減小。

圖3 pH對花椒籽仁分離蛋白乳化顆粒平均粒徑的影響Fig.3 The emulsified particles volume-weighted mean diameters (D4,3) of Zanthoxylum bungeanum Maxim seed kernel protein isolate as a function of pH

2.2.2 不同NaCl濃度對乳化顆粒粒徑分布的影響

圖4 NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化顆粒平均粒徑的影響Fig.4 The emulsified particlesvolume-weighted mean diameters (D4,3) of Zanthoxylum bungeanum Maxim seed kernel protein isolate as a function of NaCl concentration

NaCl濃度對乳化顆粒粒徑分布的影響如圖4所示。在NaCl濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L時，D4,3分別為1.77、1.83、1.85、1.85、1.92、1.98、2.06 μm，呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，其原因是NaCl降低使吸附在油滴表面蛋白質(zhì)減少，油滴表面起保護(hù)作用的薄膜遭到破壞，乳化顆粒絮集在一起甚至合并，D4,3增大。這與ETTOUMI等[32]、HOSSEINI-PARVAR等[33]的研究結(jié)果一致。

2.3 pH和NaCl濃度對乳化液的微觀結(jié)構(gòu)的影響

pH對乳化液微觀結(jié)構(gòu)影響如圖5-I所示，在pH值較低的環(huán)境中乳化顆粒大小不一，pH值逐漸增大乳化顆粒趨于均一。在pH值為3時，可清晰看到較大的乳化顆粒，且整體之間大小差異大，由于蛋白質(zhì)表面電荷接近于0乳化顆粒容易絮集在一起，乳化顆粒粒徑大，這與以上測定結(jié)果相符。pH=13時，乳化顆粒小，大小均一，蛋白質(zhì)之間靜電排斥力最大，分散的最開。

NaCl濃度對乳化顆粒的影響如圖5-II所示，隨著NaCl濃度增高，乳化顆粒逐漸增大，并且乳化顆粒有絮集在一起的趨勢。NaCl濃度達(dá)到1.2 mol/L時，乳化顆粒大小不一并發(fā)生明顯的聚集。

(Ⅰ-A、Ⅰ-B、Ⅰ-C、Ⅰ-D、Ⅰ-E、Ⅰ-F、Ⅰ-G)分別代表pH(1、3、5、7、9、11、13)(Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C、Ⅱ-D、Ⅱ-E、Ⅱ-F、Ⅱ-G)分別代表(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L)NaCl溶液圖5 pH值和NaCl濃度對花椒籽仁分離蛋白乳化液微觀結(jié)構(gòu)影響(40×)Fig.5 Microphotographs at various pH(I) and NaCl(II) concentration of Zanthoxylum bungeanum Maxim seed kernel protein isolate emulsion microstructure(40×)

2.4 界面蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

如圖6所示，在β-巰基乙醇存在的條件下，花椒籽仁分離蛋白共有6個條帶，分子質(zhì)量分布廣泛，其中分子質(zhì)量為7 kDa的條帶帶寬目色深，可以推測其所占比例相對大。在油滴上解吸附出來的界面蛋白質(zhì)，主要有3個條帶，分子質(zhì)量分別為5、7、21 kDa，表明花椒籽仁分離蛋白中參與乳化作用的蛋白質(zhì)集中在這3個條帶上，因此可以在本試驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上對這3個分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離純化，得到乳化性能更好的蛋白質(zhì)，這或許能開發(fā)成為食品加工中一種新型的乳化添加劑，從而提高花椒籽的利用價(jià)值。

3 結(jié)論

pH和NaCl濃度的改變對花椒籽仁分離蛋白的乳化性具有顯著的影響。在pH=3時，花椒籽仁蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最小、乳化顆粒平均粒徑最大；相比于酸性條件，花椒籽仁蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境中乳化活性更好。NaCl的添加降低花椒籽仁蛋白質(zhì)的乳化活性性和乳化穩(wěn)定性、增大了乳化顆粒的平均粒徑。通過SDS-PAGE凝膠電泳得出具有乳化作用的蛋白質(zhì)共有3個條帶，分別在分子量分別約為5、7、21 kDa，通過進(jìn)一步的研究或許能開發(fā)成為食品加工中一種新型的乳化添加劑，從而提高花椒籽的利用價(jià)值。

圖6 花椒籽仁分離蛋白與界面蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳Fig.6 SDS-PAGE patterns of Zanthoxylum bungeanum Maxim seed kernel protein isolate and protein absorbed at o/w interface

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Emulsifing properties ofZanthoxylumbungeanumMaxim seed kernel protein isolate: effect of pH and NaCl concentration

LI Chao, PU Biao*, LUO Song-ming, LIU Xing-yan, XU Dan-ping, FU Ben-ning, PAN Shu-xuan, JIANG Pei-ji, WANG Chun-xia, LI Qiang

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The effect of pH and NaCl concentration on the properties of stabilized emulsions ofZanthoxylumbungeanumMaxim seed kernel protein isolates were investigated by measuring the characters of emulsifying activity, emulsifying stability, droplet size, optical microscopy measurements and SDS-PAGE gel electrophores. The results showed that pH and NaCl concentration have significant influence on the above parameters: with the increase of pH value, emulsifying activity and emulsion stability decreased first and then increased at pH 3. In contrast, emulsion particle size (D4, 3) increased first and then decreased, and reached the maximum (D4, 3=1.87 μm) at pH 3. The NaCl content decreased the emulsifying activity and emulsifying stability, which caused the flocculation of emulsified particles and increased the average particle size (D4, 3). Optical microscopy clearly demonstrated that droplet aggregates formed at pH=3 and c (NaCl)=1.2 mol/L. In addition, SDS-PAGE gel electrophoresis showed that there were three proteins having emulsifying effect, and their molecular weight was 5、7、21 kDa. This will provide reference for the application ofZanthoxylumbungeanumMaxim seed kernel protein in food processing.

ZanthoxylumbungeanumMaxim seed kernel; protein isolate; pH; NaCl; emulsifing properties

碩士研究生(蒲彪教授為通訊作者,E-mail：pubiao2002@163.com)。

國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304703);國家林業(yè)局 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目(2015-LY-184)

2016-10-14，改回日期：2017-03-09

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706015