植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化

趙圣明，趙巖巖，馬漢軍

(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化

趙圣明*，趙巖巖，馬漢軍

(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

將來源于東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中的植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，首先利用飽和度為80%的硫酸銨溶液對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行沉淀粗分離。復(fù)溶后利用Sephadex LH-20進(jìn)行凝膠層析純化，之后采用Hitrap QFF進(jìn)一步進(jìn)行離子交換層析純化，利用反相高效液相色譜(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC)C18柱進(jìn)行最終純化，得到單一活性抑菌組分，說明細(xì)菌素得到基本純化，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF/MS)確定該細(xì)菌素的分子質(zhì)量約為0.9 kDa左右。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了細(xì)菌素對(duì)常見的食源性致病菌和腐敗菌的抑菌效果，結(jié)果顯示該細(xì)菌素具有較好的抑制作用。

植物乳桿菌；細(xì)菌素；分離；純化；分子質(zhì)量

植物乳桿菌作為一種重要的乳酸菌，目前已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到食品加工相關(guān)領(lǐng)域中[1]。許多植物乳桿菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素，且細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性高，耐酸，抑菌譜廣以及能夠被蛋白酶降解等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為食品行業(yè)生物防腐劑開發(fā)的一個(gè)熱門方向[2-3]。目前從發(fā)酵食品中已經(jīng)獲得多種植物乳桿菌產(chǎn)的細(xì)菌素，例如plantaricin 163[4]，plantaricin A-1[5]，plantaricin 35d[6]，bacteriocin AMA-K[7]，plantaricin MG[8]以及plantaricin ZJ5[9]等。有的植物乳桿菌產(chǎn)的細(xì)菌素抑菌譜較廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都具有抑制效果，如分離自泡菜中的植物乳桿菌163產(chǎn)的細(xì)菌素plantaricin 163對(duì)食品中常見的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌等均具有較好的抑菌作用[4]。但有的細(xì)菌素抑菌譜卻很窄，僅能抑制少數(shù)種類的細(xì)菌，例如從山羊奶中分離獲得的植物乳桿菌 LC74產(chǎn)的細(xì)菌素plantaricin LC74，僅能夠抑制植物乳桿菌，短乳桿菌和布氏乳桿菌[10]。

細(xì)菌素的分離純化主要是根據(jù)細(xì)菌素的帶電性、分子質(zhì)量大小及疏水性等特點(diǎn)來進(jìn)行。一般的純化主要包括3個(gè)基本的步驟：即粗提取、初步純化和精細(xì)純化。粗提取大部分都是采用鹽析的方法，主要是在發(fā)酵上清液中加入無機(jī)鹽，最常用的是硫酸銨，使蛋白類細(xì)菌素的溶解度降低從而從液體中析出。SOUMAYA等利用鹽析的方法從唾液乳桿菌 SMXD51的發(fā)酵液中對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行粗分離，取得了很好的效果，回收率為1.36%[11]。RAMAKRISHNAN等利用硫酸銨沉淀粗分離鼠李糖乳桿菌 L34產(chǎn)的細(xì)菌素，得到了較好的分離效果[12]。也有少部分人選用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，主要是利用細(xì)菌素在互不相溶或者微溶的發(fā)酵上清液和有機(jī)溶劑中溶解度的不同，從而使細(xì)菌素從發(fā)酵上清液中轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中，然后將有機(jī)溶劑通過真空旋轉(zhuǎn)濃縮除去，最后得到粗提的細(xì)菌素，如TAYLOR等利用甲醇和乙醇提取nisin取得了較好的分離效果[13]。初步純化一般主要目的是除去大部分的雜質(zhì)，使細(xì)菌素的純度達(dá)到50%～90%，用于進(jìn)一步的純化鑒定，通常采用離子交換層析和凝膠層析等方式進(jìn)行純化。由于乳酸菌產(chǎn)的細(xì)菌素一般所帶的電荷大小不同，因此選用離子交換層析能夠達(dá)到對(duì)細(xì)菌素分離純化的目的，該方法具有操作簡(jiǎn)單及交換容量大等特點(diǎn)，已經(jīng)成為細(xì)菌素純化過程中的最常用的方法之一。ZHU等利用離子交換層析結(jié)合凝膠層析的方法，以0.15 mol/L NaCl 進(jìn)行洗脫分離得到植物乳桿菌 ZJ008產(chǎn)的細(xì)菌素plantaricin ZJ008，純化倍數(shù)達(dá)到24.8[14]。HATA等采用離子交換和凝膠層析對(duì)植物乳桿菌 A-1產(chǎn)的細(xì)菌素plantaricin ASM1進(jìn)行分離，純化倍數(shù)達(dá)到20倍[15]。一般精細(xì)純化作為整個(gè)純化的最后一步，目的是除去樣品中殘留的痕量雜質(zhì)，是樣品中的純度高于99%，以便于采用質(zhì)譜和氨基酸測(cè)序等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。目前大部分純化實(shí)驗(yàn)的最后一步都是采用反相高效液相色譜法，它可以顯著地提高樣品的純度，因此反相高效液相色譜技術(shù)已經(jīng)在細(xì)菌素純化中得到了廣泛的應(yīng)用[14-16]。

本課題組前期從東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離得到1株植物乳桿菌JLA-9，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。本研究擬選用硫酸銨沉淀，凝膠柱層析，離子交換層析和反相高效液相色譜等分離純化手段對(duì)植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，為深入研究其結(jié)構(gòu)及性質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌JLA-9，本實(shí)驗(yàn)室分離自吉林省蛟河市農(nóng)家自制發(fā)酵酸菜，現(xiàn)已保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.10686)。

指示菌菌株及來源：大腸桿菌(ATCC25922)、蠟樣芽孢桿菌(AS1.1846)、熒光假單胞菌(AS1.1802)、藤黃微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽孢桿菌(ATCC9943)和腸炎沙門氏菌(CICC21527)。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O0.25 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.4，115 ℃、20 min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加1.5%～2%的瓊脂。LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃、20 min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加1.5%～2%的瓊脂。

Sephadex LH-20，美國(guó)Phamarcia公司；乙腈、三氟乙酸(TFA)、甲醇：色譜純，美國(guó)Tedia公司；硫酸銨：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)高壓滅菌鍋TOMY-SX-70，日本Tomy公司；高速離心機(jī)5418，芬蘭Eppendorf公司；pH計(jì)Orion 3 STAR，美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-IBU，蘇州蘇凈集團(tuán)；冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)、Hitrap QFF離子交換層析柱，GE Healthcare公司；分光光度計(jì)UV-2450，日本Shimadzu公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；高效液相色譜儀Agilent 1100 series，美國(guó)Agilent公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，德國(guó)Bruker公司；電腦自動(dòng)部分收集器DBS-100，上海滬西分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌素粗提液的制備

將植物乳桿菌 JLA-9在試管斜面MRS瓊脂培養(yǎng)基上活化后接種于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成濃度為107～108CFU/mL的種子液。將植物乳桿菌JLA-9種子液以1%濃度接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37 ℃靜止培養(yǎng)36 h，得到細(xì)菌素發(fā)酵液后離心除去菌體得到無細(xì)胞上清液。將該上清液分為4組，分別經(jīng)60%、70%、80%、90%飽和硫酸銨攪拌過夜后，9 000 g離心10 min收集沉淀。用1/30體積的去離子水復(fù)溶后，用1 mol/L NaOH調(diào)至pH6.5，經(jīng)5.0 g/L的過氧化氫酶37 ℃處理2 h后即為獲得的細(xì)菌素粗提物。

1.3.2 細(xì)菌素抑菌圈直徑的測(cè)定

細(xì)菌素抑菌圈直徑的測(cè)定采用瓊脂孔擴(kuò)散法[17]，以蠟樣芽孢桿菌AS1.1846作為指示菌。

1.3.3 凝膠層析純化細(xì)菌素

采用Sephadex LH-20凝膠層析對(duì)細(xì)菌素的粗提物進(jìn)行層析純化。純化條件為：將2 mL細(xì)菌素粗提液上樣于Sephadex LH-20柱表面，采用色譜甲醇和純水(體積比為80：20)進(jìn)行洗脫,洗脫流速3 mL/min，利用電腦自動(dòng)收集器收集組分[4]。以蠟樣芽孢桿菌作為指示菌，通過檢測(cè)其抑菌活性，得到抑菌活性組分。

1.3.4 離子交換層析純化細(xì)菌素

采用Hitrap QFF離子交換層析柱，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對(duì)Sephadex LH-20純化得到的活性組分進(jìn)行層析純化。純化條件為：流速2 mL/ min, 最高柱壓0.3 MPa, 收集體積為1 mL, 洗脫體積為5個(gè)柱體積, 平衡體積為5個(gè)體積, 進(jìn)樣2 mL。分別用0.1 mol/L，0.25 mol/L，0.4 mol/L，1 mol/L的NaCl (pH8.5的 Tris-Hcl作為緩沖液)進(jìn)行梯度洗脫。255 nm 紫外光下檢測(cè)，收集各個(gè)洗脫組分，經(jīng)蒸餾水透析脫鹽后通過測(cè)定抑菌圈直徑檢測(cè)其抑菌活性。

1.3.5 反相高效液相色譜純化細(xì)菌素

將經(jīng)過Hitrap QFF離子交換層析純化得到的活性組分經(jīng)濃縮后采用反高效液相色譜Acchrom XCharge C18柱(4.6 mm×250 mm)進(jìn)行分離純化，純化條件：洗脫液為含0.1%體積的三氟乙酸的水和乙腈溶液(水和乙腈體積比為95∶5)等濃度洗脫，時(shí)間：50 min；進(jìn)樣量: 20 μL；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：255 nm。收集液相色譜洗脫組分，通過測(cè)定抑菌圈直徑檢測(cè)其抑菌活性。

1.3.6 細(xì)菌素分子質(zhì)量測(cè)定

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS) 對(duì)RP-HPLC最終純化得到的單一抑菌活性組分進(jìn)行細(xì)菌素分子質(zhì)量測(cè)定：儀器為Re Flex TM MALDI-TOF質(zhì)譜儀；質(zhì)譜基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸[18]；質(zhì)譜條件：激光源為波長(zhǎng)355 nm的Nd YAG激光器，加速電壓20 kV，激光強(qiáng)度4 100，正離子模式檢測(cè)，線性高分子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z700～3 500。

1.3.7 細(xì)菌素抑菌活性測(cè)定

采用經(jīng)Sephadex LH-20部分純化獲得的細(xì)菌素活性組分，利用瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定細(xì)菌素的抑菌活性，指示菌株包括：大腸桿菌(ATCC25922)、蠟樣芽孢桿菌(AS1.1846)、熒光假單胞菌(AS1.1802)、藤黃微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽孢桿菌(ATCC9943)和腸炎沙門氏菌(CICC21527)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌素硫酸銨沉淀粗提取

本試驗(yàn)中分別選用60%、70%、80%、90%飽和度的硫酸銨進(jìn)行沉淀，由表1可以看出80%和90%飽和硫酸銨沉淀的效果較好，由于90%飽和硫酸銨沉淀下來的雜蛋白會(huì)更多，因此選用80%飽和硫酸銨沉淀作為細(xì)菌素的粗提取方法。

表1 植物乳桿菌 JLA-9發(fā)酵上清液硫酸銨沉淀后抑菌活性

2.2 細(xì)菌素凝膠層析純化

經(jīng)硫酸銨沉淀得到的細(xì)菌素粗提樣品首先采用Sephadex LH-20凝膠層析進(jìn)行純化，以蠟樣芽孢桿菌AS1.1846作為抑菌指示菌，通過瓊脂孔擴(kuò)散法對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在收集管中的第36管至49管之間得到一個(gè)抑菌活性洗脫組分，因此將其收集后用于下一步分離純化。

圖1 植物乳桿菌JLA-9所產(chǎn)細(xì)菌素的Sephadex LH-20洗脫曲線Fig.1 Elution curve of bacteriocin from L. plantarum JLA-9 on Sephadex LH-20 gel

2.3 細(xì)菌素離子交換層析純化

將經(jīng)Sephadex LH-20純化得到的樣品進(jìn)行Hitrap QFF離子交換層析純化，以蠟樣芽孢桿菌作為抑菌指示菌，通過瓊脂孔擴(kuò)散法對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖2。經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，在NaCl的洗脫濃度為0.1mol/L時(shí)得到的洗脫組分1具有抑菌活性，在第16管至24管之間得到該抑菌活性組分，將其收集后用于下一步的分離純化。

圖2 植物乳桿菌JLA-9所產(chǎn)細(xì)菌素的Hitrap QFF Fast Flow洗脫曲線Fig.2 Elution curve of bacteriocin from L. plantarum JLA-9 on Hitrap QFF Fast Flow gel

2.4 細(xì)菌素反相高效液相色譜純化

由Hitrap QFF離子交換層析純化得到的抑菌活性洗脫組分經(jīng)濃縮后利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)一步純化結(jié)果見圖3。

圖3 植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)細(xì)菌素的RP-HPLC圖Fig.3 RP-HPLC of bacteriocin produced by L. plantarum JLA-9

由圖3可知，在保留時(shí)間為14.879 min時(shí)得到一個(gè)對(duì)蠟樣芽孢桿菌具有抑菌活性的洗脫組分，將該抑菌活性組分收集后用于下一步的分子量測(cè)定分析。

2.5 細(xì)菌素分子量測(cè)定

將經(jīng)RP-HPLC保留時(shí)間為14.879 min的抑菌活性組分收集后濃縮，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行質(zhì)譜分析，測(cè)定細(xì)菌素的分子量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，出現(xiàn)多個(gè)質(zhì)譜峰，說明樣品中仍存在多種物質(zhì)，這可能由于前面的分離純化效果不佳，但是主要質(zhì)譜峰都是集中在0.9 kD左右，初步可以判斷植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)細(xì)菌素的分子量約為0.9 kD左右，可以根據(jù)分子量測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步選用合適的純化方法對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行分離純化。

圖4 植物乳桿菌JLA-9所產(chǎn)細(xì)菌素的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS of bacteriocin produced by L. plantarum JLA-9

2.6 細(xì)菌素的抑菌活性

經(jīng)RP-HPLC純化得到的細(xì)菌素對(duì)常見的一些食源性致病菌及腐敗菌均具有較好的抑制作用。如圖5所示。

a：熒光假單胞菌；b：大腸桿菌；c：藤黃微球菌 d：蠟樣芽孢桿菌；e：枯草芽孢桿菌；f：腸炎沙門氏菌圖5 植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌活性Fig 5. The antibacterial activity of active bacteriocin from L. plantarum JLA-9

植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)的細(xì)菌素對(duì)熒光假單胞菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、蠟樣芽孢桿菌菌、枯草芽孢桿菌和腸炎沙門氏菌具有明顯的抑制效果。

3 討論

本研究從東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離得到一種細(xì)菌素，分子量大約在0.9 kDa左右，對(duì)食品中常見的一些食源性致病菌及腐敗菌具有較好的抑制作用。這與一些已經(jīng)報(bào)道的植物乳桿菌產(chǎn)的細(xì)菌素具有相似的抑菌活性，如plantaricin 163對(duì)食品中常見的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌等均具有較好的抑菌作用[4]，Plantaricin MG主要對(duì)革蘭氏陰性食源性致病菌具有較好的抑制作用，但也能抑制一些革蘭氏陽(yáng)性致病菌如枯草芽孢桿菌等[8]。到目前為止已經(jīng)有許多植物乳桿菌產(chǎn)的細(xì)菌素被報(bào)道，其分子量一般都在1 k～5kDa之間，如植物乳桿菌 ZJ008產(chǎn)的plantaricin ZJ008分子量為1.3 kDa[14]， 植物乳桿菌 NRIC 149產(chǎn)的plantaricin 149分子量為2.2 kDa[19]，植物乳桿菌423產(chǎn)的plantaricin 423分子量為3.5 kDa[20]，植物乳桿菌C19產(chǎn)的plantaricin C19分子量為3.8 kDa[21]，植物乳桿菌510產(chǎn)的plantaricin Y分子量為4.2 kDa[22]等。本研究獲得的細(xì)菌素在分子量在0.9 kDa左右，有可能為一種新的細(xì)菌素，以后的研究將對(duì)分離純化工作進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步對(duì)該細(xì)菌的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進(jìn)行深入的研究。

本研究在離子交換層析純化細(xì)菌素中，選用pH8.5的 Tris-Hcl作為緩沖液，分別以0.1、0.25、0.4、1 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)較好的分離效果，獲得細(xì)菌素的活性峰。一般在離子交換層析中，緩沖液的作用是維持待分離物質(zhì)性質(zhì)的穩(wěn)定，同時(shí)保證待分離物質(zhì)帶上穩(wěn)定的電荷從而更加容易結(jié)合離子交換介質(zhì)上，由于不同物質(zhì)帶電荷不同，與交換介質(zhì)結(jié)合能力也不同，通過鹽溶液的梯度洗脫，可以將它們進(jìn)行有效地分離。目前文獻(xiàn)報(bào)道中一般多采用磷酸鹽或者醋酸鹽作為緩沖液，如ZHU等用Na3PO4和NaCl為洗脫緩沖液對(duì)plantaricin ZJ008進(jìn)行分離純化[14]，BAUER等用Na3PO4和NaCl為洗脫緩沖液分離純化得到了Pediocin PD-1[23]，Deraz用NaAc和NaCl為洗脫緩沖液對(duì)Acidocin D20079 進(jìn)行了分離純化[24]。還有報(bào)道稱王輝等采用超純水和NaCl為洗脫緩沖液分離純化得到了植物乳桿菌KLDS1.0391產(chǎn)的細(xì)菌素[25]。一般較少采用水作為離子交換層析的緩沖液，可能由于這種細(xì)菌素具有特殊的性質(zhì)。本試驗(yàn)采用常用的磷酸鹽和醋酸鹽作為緩沖液所收集到的洗脫峰幾乎沒有洗脫峰，而采用Tris-Hcl作為緩沖液收集到的洗脫峰卻抑菌活性較強(qiáng)，說明本試驗(yàn)純化得到的細(xì)菌素與之前報(bào)道的細(xì)菌素可能具有一些不同的性質(zhì)，具體原因尚不清楚，有待對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

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Isolation and purification of bacteriocin produced byLactobacillusplantarum

ZHAO Sheng-ming*,ZHAO Yan-yan,MA Han-jun

(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

The bacteriocin produced byLactobacillusplantarumJLA-9 from fermented Chinese sauerkraut was purified. The cell-free supernatant ofLactobacillusplantarumJLA-9 was precipitated by ammonium sulfate and higher precipitation efficiency was obtained using 80% ammonium sulfate. Then, the samples were further purified by Sephadex LH-20 gel chromatography and Hitrap QFF ion exchange chromatography. The reverse-phase high-performance liquid chromatography with C18column was utilized for final purification. The bacteriocin produced byLactobacillusplantarumJLA-9 was essential purified to be a single peak by RP-HPLC chromatography. The molecular mass of purified bacteriocin was estimated by MALDI-TOF/MS to be approximately 0.9 kDa. The purified bacteriocin showed a high antibacterial activity against common food-borne pathogens and spoilage bacteria.

Lactobacillusplantarum; bacteriocin; isolation; purification; molecular mass

博士研究生，講師(本文通訊作者，E-mail:Zhao.sheng ming@hist.edu.cn)。

河南省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目(161100110600)；河南科技學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2016018,2016019)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(18B550003)

2016-11-29，改回日期：2017-02-09

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706010