基于在線參數(shù)動(dòng)態(tài)調(diào)控的雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉新工藝

蘇立宇，趙偉，杭海峰*，儲(chǔ)炬*

1(華東理工大學(xué)，生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200237) 2(山東福洋生物科技有限公司，山東 德州，253100)

基于在線參數(shù)動(dòng)態(tài)調(diào)控的雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉新工藝

蘇立宇1，趙偉2，杭海峰1*，儲(chǔ)炬1*

1(華東理工大學(xué)，生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200237) 2(山東福洋生物科技有限公司，山東 德州，253100)

采用葡萄糖酸鈉生產(chǎn)過程中在線參數(shù)氧消耗速率(OUR)和溶氧(DO)作為調(diào)控參數(shù)，開發(fā)出階段性實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)補(bǔ)加葡萄糖氧化酶的雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉新型工藝，酶催化過程中葡萄糖氧化酶酶活始終不是限制因素。50 L反應(yīng)器初始葡萄糖濃度在330 g/L條件下，能夠有效將生產(chǎn)時(shí)間從原始工藝的17.0 h縮短至11.6 h，得率由1.167(g/g)提高至1.176(g/g)，最終消耗的葡萄糖氧化酶的量也由2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖。與生物發(fā)酵相比，改進(jìn)后的酶法工藝也更具優(yōu)越性，生產(chǎn)時(shí)間縮短了42.85%，得率提升了4.91%。改進(jìn)后的雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉新工藝具有更廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

葡萄糖氧化酶；葡萄糖酸鈉；在線參數(shù)；工藝優(yōu)化

葡萄糖酸鈉(Sodium Gluconate, SG)是一種易溶于水，微溶于醇，不溶于醚的多羥基羧酸鈉[1]，它作為葡萄糖酸的重要衍生物之一，在建筑、醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)都發(fā)揮著的重要作用[2-5]?，F(xiàn)今葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)方法大致可分為5類：多相催化氧化法、均相氧化法、電催化方法、生物發(fā)酵法和酶催化法[6-8]?，F(xiàn)今工業(yè)上大批量生產(chǎn)葡萄糖酸鈉大多采用的是生物發(fā)酵法(主要以黑曲霉深層發(fā)酵為主)和雙酶法直接催化。生物發(fā)酵和雙酶法涉及的反應(yīng)機(jī)理可簡(jiǎn)化如圖1所示。

圖1 葡萄糖酸合成途徑Fig.1 Gluconic acid synthesis pathway

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脫氫生成1分子葡萄糖-δ-內(nèi)酯和1分子過氧化氫。過氧化氫在過氧化氫酶作用下分解成水和氧氣，葡萄糖-δ-內(nèi)酯則在內(nèi)脂酶作用下或自發(fā)水解形成葡萄糖酸[9]。最后通過流加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，同時(shí)也生成葡萄糖酸鈉。

相比于黑曲霉生物發(fā)酵而言，雙酶法直接催化具有如下優(yōu)勢(shì)：1.由于沒有了制備種子的時(shí)間，且酶促反應(yīng)快速高效，可以顯著縮短生產(chǎn)所用時(shí)間。2.由于雙酶法沒有菌體生長(zhǎng)，且副產(chǎn)物少，所以得率相對(duì)更高[10]。3.最終產(chǎn)品白度好、質(zhì)量高且穩(wěn)定[11]。但是雙酶法同時(shí)也存在以下的缺陷，導(dǎo)致了它還未大規(guī)模取代黑曲霉深層發(fā)酵成為葡萄糖酸鈉發(fā)酵的首選：1.酶法生產(chǎn)所用的關(guān)鍵酶，葡萄糖氧化酶的價(jià)格始終居高不下，這就導(dǎo)致了最終生產(chǎn)成本高于黑曲霉深層發(fā)酵。而成本因素在工業(yè)生產(chǎn)上是判斷一項(xiàng)工藝好壞的重要指標(biāo)之一。2.由于酶本質(zhì)上是蛋白質(zhì)，不能夠進(jìn)行高溫滅菌操作，所以染菌問題也是困擾雙酶法的問題之一。雙酶法不適宜進(jìn)行多次帶放或者不滅罐的多次反應(yīng)。

現(xiàn)階段采用酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的操作過程是在開始時(shí)向原料液內(nèi)投加所有的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，中途不進(jìn)行任何補(bǔ)料補(bǔ)加酶的舉措，等生產(chǎn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行放罐到下游分離提取葡萄糖酸鈉[12]。本研究以生產(chǎn)過程中在線攝氧率(Oxygen uptake rate，OUR)、溶氧(Dissolved oxygen, DO)的相關(guān)性變化為依據(jù)，研究并開發(fā)了階段性實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)補(bǔ)加葡萄糖氧化酶的新型雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用黑曲霉(Aspergillusniger)由山東福洋生物科技有限公司提供。

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)，過氧化氫酶(Catalase, CAT,)均為工業(yè)級(jí)液態(tài)粗酶液，購(gòu)自諾維信(中國(guó))有限公司。其中葡萄糖氧化酶酶活為6.5×105U/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)采用上海國(guó)強(qiáng)生化裝備有限公司的15 L和50 L攪拌式生物反應(yīng)器，同時(shí)配備有Omega公司的溫度電極和Mettler公司的溶氧及pH電極。發(fā)酵尾氣通過尾氣質(zhì)譜儀(MAX300-LG，Extrel，USA)進(jìn)行在線檢測(cè)。所有的數(shù)據(jù)處理及相關(guān)分析通過華東理工大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海)自行開發(fā)的上位機(jī)軟件包《發(fā)酵過程檢測(cè)系統(tǒng)BIORADR 2.0》完成。

1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，尿素0.2，KH2PO40.13，MgSO40.15，玉米漿1.0，CaCO35.0，瓊脂1.0。

15 L種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖250，KH2PO40.5，(NH4)2HPO41.8，MgSO40.19，玉米漿2.1。消泡劑0.2ml/L。

50 L發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖330，KH2PO40.17，(NH4)2HPO40.25，MgSO40.2。消泡劑0.2ml/L。

50 L酶法培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖330，消泡劑0.2 ml/L。

所有培養(yǎng)基在配制完成后用1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至pH7.0,115℃高溫滅菌20 min。

1.4 發(fā)酵方法

1.4.1 生物發(fā)酵

用50 mL無菌水洗下茄子瓶培養(yǎng)好的黑曲霉孢子斜面，接種到含有9 L培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵18 h。過程中通氣比、攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、罐壓分別控制在0.8 vvm，500 r/min, 38 ℃, 0.1 MPa，pH通過流加7.5 mol/L NaOH溶液維持在pH5.8。

在種子培養(yǎng)18.0 h之后，將4.5 L的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有30.0 L新鮮培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，維持通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、罐壓分別在1.2 vvm，550 r/min，38.0 ℃，0.1 MPa，pH通過流加7.5 mol/L NaOH溶液維持在pH5.2。當(dāng)發(fā)酵液中檢測(cè)出的殘余葡萄糖濃度低于10.0 g/L時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

1.4.2 原工藝雙酶法生產(chǎn)

50 L發(fā)酵罐工作體積30 L，初始葡萄糖濃度控制在330 g/L。初期加入9.25×106U過氧化氫酶粗酶液(950 U/g葡萄糖)，2.02×107U葡萄糖氧化酶粗酶液(2100 U/g葡萄糖)，過程中不再補(bǔ)入酶液。過程中控制條件與生物發(fā)酵法相同。

1.4.3 根據(jù)在線參數(shù)變化趨勢(shì)實(shí)時(shí)階段性補(bǔ)入酶液的雙酶法工藝

50 L發(fā)酵罐工作體積30 L，初始葡萄糖濃度控制在330 g/L。發(fā)酵初期加入1.11×107U過氧化氫酶粗酶液之后過程中不再補(bǔ)加，再加入7.8×106U葡萄糖氧化酶粗酶液，過程中出現(xiàn)OUR下降，DO上升時(shí)，及時(shí)補(bǔ)加6.5×105U葡萄糖氧化酶酶液。其他的控制條件與初始酶法發(fā)酵相同。

1.5 分析檢測(cè)方法

1.5.1 葡萄糖濃度檢測(cè)

取發(fā)酵液過濾所得清液，稀釋到適當(dāng)濃度，用試劑盒對(duì)殘?zhí)呛窟M(jìn)行測(cè)定[13]。

1.5.2 葡萄糖酸鈉(SG)濃度檢測(cè)

SG濃度通過高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定。具體測(cè)定條件為：色譜分離柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(磷酸)=1∶1(10%甲醇，2.4%磷酸);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為1 mL/min；柱溫為26 ℃；進(jìn)樣量為20 μL[14]。

1.5.3 葡萄糖氧化酶酶活檢測(cè)

在反應(yīng)試管中依次加入2.4 mL 0.21 mol/L的鄰聯(lián)茴香胺，0.5 mL 0.1%的葡萄糖溶液以及0.1 mL 0.1 mg/mL的辣根過氧化物酶。待溶液充分混勻之后，放置于35 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)加熱保溫5 min。測(cè)樣時(shí)取提前預(yù)熱的0.1 mL 待測(cè)樣品加入到保溫試管內(nèi)，迅速混勻后倒入比色皿中。每隔30 s記錄下紫外分光光度計(jì)A500 nm下的吸光度數(shù)值。最后用吸光度對(duì)時(shí)間作圖，找出其斜率ΔA/min。根據(jù)公式(1)計(jì)算葡萄糖氧化酶的酶活。

定義葡萄糖氧化酶在1 h內(nèi)催化生成1 μL氧氣為1個(gè)酶活單位(U)。

葡萄糖氧化酶活性(U·mL-1)=

(1)

其中，7.5為氧化型鄰聯(lián)茴香胺的消光系數(shù)。ΔA/min為吸光度對(duì)時(shí)間作圖所得斜率。

1.6 二氧化碳消耗速率CER和攝氧率OUR的檢測(cè)及呼吸商RQ的計(jì)算

在線生理參數(shù)CER、OUR通過過程質(zhì)譜儀對(duì)發(fā)酵尾氣進(jìn)行檢測(cè)，并由BioStar軟件依據(jù)公式(2)、(3)、(4)進(jìn)行計(jì)算[15]：

(2)

(3)

(4)

上述方程中，F(xiàn)in為進(jìn)氣的流量,mmol/L;V為發(fā)酵罐的體積，L;CCO2in為進(jìn)氣中氧氣濃度(20.95%);CO2in是進(jìn)氣中二氧化碳的濃度(0.03%);Cinertin是進(jìn)氣中惰性氣體氮?dú)獾臐舛?CO2out為尾氣中氧氣濃度;CCO2out為尾氣中二氧化碳的濃度;Tin是溫度;h是尾氣的濕度;Pin是進(jìn)氣的壓力。

2 結(jié)果分析

2.1 黑曲霉深層分批發(fā)酵法生產(chǎn)SG

常規(guī)的SG發(fā)酵工藝以黑曲霉作為生產(chǎn)菌株。經(jīng)過多次參數(shù)優(yōu)化后黑曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)SG的過程如圖2所示。整個(gè)發(fā)酵過程持續(xù)20.5 h 左右。在發(fā)酵初期，CER、OUR隨著菌體生長(zhǎng)逐漸升高，DO也在這一階段快速下降，前期限制反應(yīng)速度的因素可能是菌體濃度。菌體量不夠?qū)е铝藷o法合成足量的發(fā)酵過程所需要的3種關(guān)鍵酶葡萄糖氧化酶(GOD)、過氧化氫酶(CAT)和內(nèi)脂酶(LAC)。氧氣在黑曲霉深層發(fā)酵中主要有兩個(gè)去處，參與呼吸作用和生成產(chǎn)物SG。在呼吸作用中，1分子葡萄糖經(jīng)呼吸鏈徹底氧化需要6分子氧氣，同時(shí)生成6分子二氧化碳。所以菌體呼吸作用耗氧速率在數(shù)值上應(yīng)該與二氧化碳生成速率相等。在圖2發(fā)酵過程初期，與CER相比OUR數(shù)值始終較高，說明此時(shí)氧氣除了用作菌體呼吸之外，也已經(jīng)開始參與產(chǎn)物SG的合成[16]。而合成所需要的3種酶，GOD，LAC和LAC在種子罐階段就已經(jīng)開始合成并糖基化附著在黑曲霉菌體細(xì)胞壁上[17],隨著種子液進(jìn)入發(fā)酵罐直接開始利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到5 h左右，CER開始出現(xiàn)回落，但是OUR和DO并未受到影響依舊分別持續(xù)上升和下降，說明原先用于菌體呼吸的那部分氧氣此時(shí)已經(jīng)被用來生成SG。當(dāng)DO跌落到30%左右時(shí)，此時(shí)OUR也達(dá)到了整個(gè)過程中的最大值不再上升，說明DO可能已經(jīng)達(dá)到了臨界氧濃度。同時(shí)可以看出，在高的OUR條件下葡萄糖濃度下降很快，而SG濃度也提升迅速?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：當(dāng)菌體量足夠可以合成過量的3種關(guān)鍵酶GOD，CAT和LAC，限制反應(yīng)的因素就是設(shè)備的供氧能力OTR。任何能夠提高OTR水平的操作都能夠增加產(chǎn)物的合成[18]。最終整個(gè)發(fā)酵過程在初始葡萄糖330 g/L濃度下轉(zhuǎn)化生成了327.7 g/L SG，最大OUR達(dá)到了54.53 mmol/(L·h)，平均耗糖速率16.1 g/(L·h)，平均SG成速率15.9 g/(L·h),得率為 1.141(g/g)。

圖2 黑曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉參數(shù)圖Fig.2 Time course of on-line and off-line data of the SG fermentations process by Aspergillus niger

2.2 原始雙酶法(GOD和CAT)生產(chǎn)SG

由于SG的生產(chǎn)過程本質(zhì)上就胞外酶促反應(yīng)，所以為直接利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶進(jìn)行生產(chǎn)SG提供了可能。按照所用酶使用說明，初始雙酶法工藝保證在初期投加完所有酶液之后，能消耗完反應(yīng)器內(nèi)所有的葡萄糖，同時(shí)在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，關(guān)鍵的葡萄糖氧化酶的酶活也接近于零。反應(yīng)初期，在50 L的發(fā)酵體系內(nèi)初期一次性加入2.02×107U的葡萄糖氧化酶粗酶液和9.25×106U過氧化氫酶粗酶液，反應(yīng)過程中不再補(bǔ)加任何粗酶液。整個(gè)生產(chǎn)過程中參數(shù)變化如圖3所示。由于過程中過氧化氫酶量始終處于過量的狀態(tài)，所以在整個(gè)過程中過氧化氫酶始終不是限制反應(yīng)的因素。整個(gè)生產(chǎn)周期約為17.0 h，較圖2過程縮短了3.0 h。

與黑曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)SG不同，利用雙酶法生產(chǎn)SG不需要利用任何菌體。在反應(yīng)初期加入過量的2種粗酶液之后，發(fā)酵液中所測(cè)得的酶活達(dá)到了過程的最大值，約為6 800.0 U/mL。同時(shí)OUR也升至72.7 mmol/L/h。在高的OUR條件下，反應(yīng)器內(nèi)底物葡萄糖快速消耗，分解成葡萄糖內(nèi)酯并水解成葡萄糖酸。相應(yīng)地，由于OUR數(shù)值很高，所以DO降到了整個(gè)過程的最低點(diǎn)，約在20.0%左右。可以注意到的是，與圖2黑曲霉深層發(fā)酵過程相比，雙酶法所能達(dá)到的DO的最低值更小(20.0%比30.0%)，最大OUR更高(72.7 mmol/(L·h)比55.1 mmol/(L·h))，表明直接利用雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的臨界氧濃度更低，過程中的OTR與黑曲霉深層發(fā)酵相比更高。這可能是由于直接加入反應(yīng)體系內(nèi)的酶蛋白在發(fā)酵液中均勻分散，而且它們直接與發(fā)酵液中的氧氣接觸，這大大提升了液固兩相的接觸面積，從而提高了過程的OTR水平[19]。

圖3 原始雙酶法(GOD和CAT)生產(chǎn)葡萄糖酸鈉參數(shù)圖Fig.3 Time course of comparative data of initial SG production using enzymes of GOD and CAT

如圖3所示，在初期一次性加入生產(chǎn)所需的全部粗酶液之后，DO、OUR和酶活均達(dá)到了整個(gè)過程的最值。隨著時(shí)間的推移，酶活水平不斷降低，當(dāng)酶活下降到2 500.0 U/mL至3 000.0 U/mL范圍時(shí)，OUR開始逐漸下降，DO也逐步回升。這說明在此時(shí)的反應(yīng)條件下，葡萄糖氧化酶的酶量已經(jīng)開始成為了此時(shí)反應(yīng)的限制性因素。而且從圖3看出，當(dāng)酶活成為限制性因素之后，底物葡萄糖的消耗速率以及產(chǎn)物SG的合成速率均有所放緩。以上幾點(diǎn)說明，在反應(yīng)初期一次性投加的葡萄糖氧化酶的酶量是過量的，大部分酶因?yàn)檠鯕庀拗撇]有參與反應(yīng)但是隨著時(shí)間推移酶活也逐步降低，這就不可避免地造成了葡萄糖氧化酶的浪費(fèi)。而酶活與OUR和DO存在一定的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，所以提出以在線參數(shù)OUR和DO為參考標(biāo)準(zhǔn)的過程補(bǔ)加葡萄糖氧化酶粗酶液的雙酶法生產(chǎn)新工藝。

2.3 利用在線參數(shù)階段性加入葡萄糖氧化酶生產(chǎn)SG的雙酶法新工藝

在圖3所示的原始雙酶法生產(chǎn)SG過程中，反應(yīng)初期一次性投加所有的葡萄糖氧化酶，過程中前期葡萄糖氧化酶是過量的，隨時(shí)間推移酶活逐漸降低，當(dāng)酶活降低到一定程度時(shí)葡萄糖氧化酶的酶活會(huì)成為限制酶反應(yīng)的因素。此時(shí)OUR出現(xiàn)回落，DO開始逐步上升?；诖它c(diǎn)，開發(fā)了以在線參數(shù)OUR和DO為調(diào)控指標(biāo)的階段性加入葡萄糖氧化酶的雙酶法生產(chǎn)SG的新工藝。由于現(xiàn)在市場(chǎng)過氧化氫酶價(jià)格低廉，所以在反應(yīng)初期一次性加入過量的過氧化氫酶，保證在整個(gè)生產(chǎn)過程中過氧化氫酶不會(huì)成為反應(yīng)的限制因素。而初期選擇加入適量的葡萄糖氧化酶，保證在當(dāng)前操作參數(shù)條件下加入葡萄糖氧化酶的量能夠使OUR升至的最高點(diǎn)，DO跌至最低點(diǎn)。這時(shí)候限制反應(yīng)的條件是OTR而非葡萄糖氧化酶的酶量。隨著生產(chǎn)的進(jìn)行葡萄糖氧化酶逐漸失活，OUR回落而DO上升，此時(shí)表明葡萄糖氧化酶酶活成為了反應(yīng)的限制條件，此時(shí)應(yīng)及時(shí)補(bǔ)加適量的葡萄糖氧化酶，來保證在當(dāng)前設(shè)備所能提供的最大OTR條件下，最大限度達(dá)到高的OUR。

在圖3中明顯看出酶活低于2 500 U/mL時(shí)OUR開始明顯下降，那么只要將初始酶活保持在3 000 U/mL左右就不會(huì)出現(xiàn)酶量限制。因此反應(yīng)初期一次性添加GOD酶液7.8×106U，使初期酶活達(dá)到3 000 U/mL左右。此時(shí)可保證反應(yīng)一開始便是處于供氧限制。在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)DO逐步回升、OUR開始下降時(shí)，補(bǔ)充6.5×105U葡萄糖氧化酶至反應(yīng)器中，隨后OUR和DO快速響應(yīng)，恢復(fù)至與初期相當(dāng)?shù)乃?。完整生產(chǎn)過程如圖4所示。

圖4 利用在線參數(shù)階段性加入GOD的葡萄糖酸鈉生產(chǎn)過程Fig.4 Enzyme reaction for SG production bystepwiseaddition of GOD solution based on on-line parameters

整個(gè)反應(yīng)過程中OUR始終維持在70.0 mmol/(L·h)左右，DO也穩(wěn)定在20.0%上下，酶活水平始終高于2 500 U/mL?？梢哉J(rèn)為在這種操作模式下，SG始終是以當(dāng)前設(shè)備供氧條件下最大的速率合成。最終整個(gè)生產(chǎn)過程持續(xù)12.0 h。且過程中所添加了葡萄糖氧化酶的量由原先酶法的2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖，減少了31.2%。顯然，改進(jìn)后的雙酶法生產(chǎn)工藝較之前的原始工藝更具優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，此新工藝也已經(jīng)成功推廣到了工業(yè)規(guī)模，最終效果與上述結(jié)果相差無幾，與生物發(fā)酵和原始酶法相比，縮短了發(fā)酵時(shí)間，提高了最終SG的得率。

2.4 生物發(fā)酵、原始雙酶法和改進(jìn)雙酶法生產(chǎn)SG結(jié)果對(duì)比

3種不同的生產(chǎn)工藝對(duì)比如表1所示。新工藝雙酶法相較于原工藝雙酶法和生物發(fā)酵法，優(yōu)勢(shì)巨大。生產(chǎn)時(shí)間降低至(11.6±0.5) h，而原工藝酶法生產(chǎn)和生物發(fā)酵分別需要(17±0.5) h和(20.3±0.4) h，對(duì)比生產(chǎn)時(shí)間分別降低了31.67%和42.85%。雙酶法生產(chǎn)中葡萄糖氧化酶均勻分撒在發(fā)酵液中，提高了液固之間傳質(zhì)的面積，從而提高了反應(yīng)過程的OTR水平，使最大OUR能夠達(dá)到72.70 mmol/(L·h)左右，而相比之下生物發(fā)酵法最大OUR只能夠達(dá)到55.12 mmol/(L·h)，比雙酶法低了24.18%。新工藝雙酶法由于始終處于操作參數(shù)條件下最大的反應(yīng)速率，因此耗糖速率和產(chǎn)物生成速率均是3者中最高。值得注意的是，雖然2種雙酶法工藝OUR峰值基本相同，但是原先工藝初期所添加的葡萄糖氧化酶是過量的，在初始葡萄糖濃度330 g/L條件下，通過合理調(diào)節(jié)過程中葡萄糖氧化酶的添加量添加時(shí)間，所需的葡萄糖氧化酶的量由原先的2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖，用量減少了31.2%。由于生物發(fā)酵法中葡萄糖不僅作為底物生成葡萄糖酸，而且還要被菌體利用維持自身基本的生理代謝，所以最終得率較原始雙酶法和新工藝雙酶法，分別低了3.94%和4.68%。

表1 不同工藝計(jì)算的參數(shù)對(duì)比

注：發(fā)酵液的體積變化已經(jīng)計(jì)算在內(nèi)。

3 討論

本文主要研究了利用在線參數(shù)OUR和DO的相關(guān)性變化，在生產(chǎn)過程中實(shí)時(shí)階段性加入葡萄糖氧化酶生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的雙酶法新工藝。新工藝避免了初期過多的葡萄糖氧化酶的浪費(fèi)，階段性地補(bǔ)加酶液也使整個(gè)過程酶活始終不受限，在過程中始終維持了穩(wěn)定快速的耗糖速率。在50L體系初始葡萄糖濃度為330 g/L條件下，生產(chǎn)時(shí)間由原先酶法的17±0.5h縮短到(11.6±0.5) h，縮短了31.76%。添加葡萄糖氧化酶酶量也能由2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖。過程中耗糖速率、SG生成速率和得率分別為28.55±0.70 g/(L·h)、30.66 g/(L·h)和1.176±0.009 (g/g),較原先工藝分別提高了48.31%、52.08%和0.77%。而與生物發(fā)酵相比，新工藝酶法也更有優(yōu)勢(shì)。整個(gè)生產(chǎn)時(shí)間縮短42.85%，過程中耗糖速率、SG生成速率和得率分別提高了78.55%、92.59%和4.91%。

雙酶法生產(chǎn)SG的可行性已經(jīng)得到驗(yàn)證，較之原生的生物發(fā)酵更具有應(yīng)用前景。同時(shí)利用在線參數(shù)的相關(guān)性變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過程實(shí)時(shí)理性的控制優(yōu)化。但是現(xiàn)今酶液價(jià)格居高不下，成為雙酶法應(yīng)用到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中的最大障礙。生產(chǎn)過程階段改善葡萄糖氧化酶的添加量和添加時(shí)間只是雙酶法工藝優(yōu)化中的一個(gè)方面，而過程中葡萄糖氧化酶的失活機(jī)理是一個(gè)值得關(guān)注的焦點(diǎn)，具有繼續(xù)探究的價(jià)值。

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A novel approach for sodium gluconate production using two-enzyme method by on-line parameter monitoring and dynamic regulation

SU Li-yu1, ZHAO Wei2, HANG Hai-feng1*, CHU Ju1*

1(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)2(Shandong Fuyang Biological Technology Company, Dezhou 253100, China)

In this paper, much attention was paid on the on-line parameters oxygen uptake rate (OUR) and dissolved oxygen (DO) monitoring and control. Based on the changing trends of these parameters, a novel approach of sodium gluconate production was proposed by stepwise addition of glucose oxidase solution dynamically, and the activity of glucose oxidase was kept at an unlimited level during the whole production period. The results showed that in the 50 L reactor with 330 g/L initial glucose concentration, the production time was shortened form 17.0 h to 11.6 h, the yield was enhanced from 1.167 g/g to 1.176 g/g and the overall dosage of used glucose oxidase declined from 2 100 U/g glucose to 1 444 U/g glucose respectively. Compared to the biological fermentation, the novel direct enzymatic reaction displayed significant advantages. The production time was cut down by 42.85% and the yield was 4.91% higher than the traditional biological fermentation. The improved direct enzymatic production had more potential value in the further industrial application.

glucose oxidase; sodium gluconate; on-line parameters; process optimization

碩士研究生(杭海峰、儲(chǔ)炬為通訊作者,E-mail:hanghaifeng@ecust.edu.cn;juchu@eucst.edu.cn)。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB733600)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2015AA021005)

2016-12-28，改回日期：2017-02-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706004