接骨草總黃酮提取工藝及其抑菌作用的研究

黃國(guó)文,管天球,趙雨云,陳莫林,劉宏輝

(湖南科技學(xué)院生化系,湖南永州 425199)

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接骨草總黃酮提取工藝及其抑菌作用的研究

黃國(guó)文,管天球,趙雨云,陳莫林,劉宏輝

(湖南科技學(xué)院生化系,湖南永州 425199)

以堿溶酸沉法研究接骨草總黃酮的提取條件和抑菌作用。以料液比、溫度、時(shí)間、提取液pH為影響因素,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),研究提取接骨草總黃酮的最優(yōu)條件,調(diào)節(jié)提取液pH來(lái)沉淀總黃酮,并用比濁法和濾紙圓片法研究總黃酮的抑菌作用。結(jié)果表明,提取接骨草總黃酮的最優(yōu)條件是料液比1∶40 (g/mL)、溫度為80 ℃、時(shí)間為45 min、提取液pH10,此條件下接骨草總黃酮的得率為3.11%。調(diào)節(jié)總黃酮提取液pH3.5沉淀接骨草總黃酮的量較多,其得率為2.15%。接骨草總黃酮在酸性pH4～5時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng),并能夠增加三種細(xì)菌的電導(dǎo)率,對(duì)三種菌最小抑菌濃度分別為0.63、1.25、2.50 mg/mL。用堿溶酸沉法提取接骨草總黃酮的工藝簡(jiǎn)單,總黃酮具有較高的抑菌活性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)接骨草的總黃酮打下了基礎(chǔ)。

接骨草,總黃酮,提取工藝,抑菌作用

接骨草(SambucuschinensisLindl)為忍冬科接骨木屬多年生草本或半灌木植物[1],產(chǎn)于陜西、河南、湖南、貴州、云南等省區(qū)的路旁和林緣等地。莖無(wú)毛有棱;葉片無(wú)柄,橢圓形;雌雄異株,花期4～5月,果熟期8～9月。全草藥用,有活血散瘀、祛風(fēng)濕功效,能治療風(fēng)濕痹痛、腎炎、腳氣、慢性氣管炎、跌打損傷、骨折等疾病[2]。接骨草含有很多生物活性物質(zhì),已經(jīng)分離出黃酮類、三萜、甾體、酚酸、揮發(fā)油和苯丙素類等50多個(gè)化合物,其中,黃酮類主要以黃酮醇為主,具有由兩個(gè)羥基的苯環(huán)通過(guò)中央三個(gè)碳原子連接而成的母核,母核上羥基的氫原子可以被不同糖苷中的半縮醛羥基取代生成不同的黃酮苷[3]。植物中黃酮類化合物的含量與植物的木質(zhì)化程度有關(guān),存在于微管植物中[4],特別在植物的葉和花等器官中含量較高[5-6],黃酮類化合物具有保護(hù)心血管系統(tǒng)[7]、抗氧化[8]、抗菌[9-10]、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲(chóng)等作用[11-12],是保健食品的一種活性成分[13]。接骨草可以用于外敷、內(nèi)服,炮制的接骨草藥茶含有較多的黃酮類物質(zhì)[14]。接骨草黃酮的抗氧化作用已有報(bào)道[15],其抗菌作用報(bào)道較少,因此,有必要研究接骨草總黃酮提取及其抑菌作用。黃酮類化合物的提取方法有熱水提取、有機(jī)溶劑提取、堿溶酸沉、超聲波輔助提取、半仿生法、酶解、超臨界CO2萃取法等[16-17]。目前報(bào)道,用80%乙醇提取的接骨草成分含有槲皮素為苷元的黃酮醇,總黃酮含量為41.43 mg/g[18];用超聲輔助50%乙醇提取接骨草黃酮,其得率為8.352 mg/g[15]。與有機(jī)溶劑浸提和超聲輔助浸提法相比,堿溶酸沉法提取黃酮類物質(zhì)的得率低,但是具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)環(huán)境污染、不使用有機(jī)溶劑、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[19-21]。本文采用堿溶酸沉法研究接骨草總黃酮的提取條件,并研究其對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用,為開(kāi)發(fā)和利用接骨草總黃酮打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在湖南科技學(xué)院周圍的西山林緣于2015年11月份采集接骨草地上部分,在100 ℃殺青后烘干粉碎成粉末。按1∶8 (g/mL)比例加入石油醚,80 ℃回流60 min,過(guò)濾除去脂溶性成分,取干燥后的濾雜來(lái)提取總黃酮。供試菌種(大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis) 由湖南科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。試劑:蘆丁,瓊脂粉,蛋白胨,牛肉膏,氯化鈉,硝酸鋁,亞硝酸鈉,氫氧化鈉等均為分析純 均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

HH三用恒溫水箱 江蘇國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠;TG16G型離心機(jī) 上海趙迪生物科技有限公司;DHG-9070AS型新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠;AUY120型電子分析天平 日本島津;H722B可見(jiàn)分光光度計(jì) 天津市拓普儀器有限公司;DDS-11A上海雷磁電導(dǎo)率儀 上海右一儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取接骨草總黃酮條件的研究

1.2.1.1 提取接骨草總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn) 以堿性pH溶液(用10% NaOH調(diào)節(jié)成的水溶液)為溶劑用浸提法來(lái)提取接骨草總黃酮,固定提取條件:提取時(shí)間60 min,溫度60 ℃,料液比1∶40 (g/mL)和浸提pH10。改變因素料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL),提取液pH8、9、10、11、12,溫度為60、70、80、90、100 ℃,時(shí)間為30、45、60、75、90 min。將各條件下提取的總黃酮溶液離心(6000 r/min,10 min),取上清液測(cè)定總黃酮含量。對(duì)四次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作圖分析,并用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較,確定各因素的適合水平。

1.2.1.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)正交因素水平表(表1),通過(guò)L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析,優(yōu)化總黃酮的提取條件。

表1 提取接骨草總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Orthogonal experiment design of the extraction of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl

1.2.2 pH沉淀總黃酮 準(zhǔn)確稱取5份烘干后的接骨草粉末各10.0 g,脫脂后按照最佳提取條件提取總黃酮。待材料浸出液冷卻后,離心(6000 r/min,10 min)收集上清液。分別緩慢滴加濃鹽酸調(diào)pH為2、3、4、5,靜置過(guò)夜,離心(3500 r/min,15 min),收集沉淀,沉淀物用乙醚洗滌2次后再用蒸餾水洗滌2次,60 ℃干燥后稱量其總黃酮質(zhì)量,計(jì)算其得率。

1.2.3 制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 用30%乙醇配制0.10 mg/mL[22]的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL。在6個(gè)10 mL容量瓶中分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL。各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻后放置6 min,加入0.3 mL10%硝酸鋁溶液,搖勻后放置6 min,加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液,再用30%乙醇定容,搖勻后放置10 min。以沒(méi)有加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合溶液為空白參比,在波長(zhǎng)400～600 nm之間測(cè)定各樣品的吸收光譜,確定最大吸收波長(zhǎng)為510 nm[23]。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.119X-0.0182,R2=0.9994,式中Y為吸光度,X為蘆丁的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.2.4 總黃酮含量測(cè)定方法 根據(jù)蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定接骨草提取液的總黃酮濃度,再計(jì)算黃酮的得率?？傸S酮的得率=(CV/103W)×100%,式中:W為接骨草干粉的質(zhì)量(g),C為提取液的濃度(mg/mL),V為提取液的體積(mL)。其值表示生物學(xué)重復(fù)樣品三次測(cè)定的平均值±SD。

1.2.5 菌懸液的制備方法 在超凈工作臺(tái)中,在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌分別劃線培養(yǎng)(37 ℃,24 h),用接種環(huán)挑取一個(gè)菌落接種到液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min,24 h)。菌液用無(wú)菌水稀釋到吸光度為0.6～0.8時(shí),用于抑菌研究。

1.2.6 不同濃度的接骨草總黃酮對(duì)三種菌的抑制作用 用濾紙圓片法。將最佳提取條件和最優(yōu)pH沉淀?xiàng)l件下制備的接骨草總黃酮用蒸餾水溶解,配制成濃度為0.31、0.63、1.25、2.5、5.0、10 mg/mL的溶液,浸泡濾紙圓片(直徑6 mm)1 h。在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上加入200 μL菌懸液,用涂布棒涂勻菌液并干燥。用無(wú)菌鑷子夾取濾紙圓片貼在含菌培養(yǎng)基表面,每個(gè)培養(yǎng)皿上放置3個(gè)處理濾紙片和1個(gè)水處理的濾紙圓片(陰性對(duì)照),置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。

圖1 提取條件對(duì)接骨草總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of extracting conditions on the extracting rate of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

1.2.7 不同作用時(shí)間的接骨草總黃酮對(duì)三種菌抑制作用 用比濁法。在無(wú)菌狀態(tài)下,向5 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基里加入菌懸液200 μL,并加入一定濃度的接骨草總黃酮。于37 ℃搖床里振蕩培養(yǎng)(200 r/min),以培養(yǎng)液作為對(duì)照,在600 nm下測(cè)定細(xì)菌懸液的吸光度(A)。每個(gè)菌設(shè)定3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每培養(yǎng)2 h測(cè)定各個(gè)重復(fù)樣品3次,求平均值,計(jì)算抑菌率,計(jì)算公式如下:

抑菌率(%)=(菌懸液的吸光度-含有總黃酮的菌懸液的吸光度)/菌懸液的吸光度×100

1.2.8 不同pH接骨草總黃酮對(duì)三種菌抑制作用 用濾紙圓片法。稱取一定量的接骨草總黃酮5份,分別加入到用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制成的pH為4、5、6、7、8的溶液中,配成總黃酮質(zhì)量體積濃度10%(g/mL),混勻。將濾紙圓片浸泡到總黃酮溶液中1 h,取出瀝干后貼在含菌培養(yǎng)基表面,每個(gè)培養(yǎng)皿上放置3個(gè)濾紙片,置于37 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.9 電導(dǎo)率的測(cè)定 取18只大試管,分別加入5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和200 μL OD600為0.6～0.8的三種細(xì)菌培養(yǎng)物以及10%總黃酮提取物。其中三個(gè)試管只加入蒸餾水代替總黃酮作為對(duì)照組。將試管放在200 r/min,37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 h。分別測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值,從電導(dǎo)率變化趨勢(shì)來(lái)說(shuō)明菌膜的完整性。

2 結(jié)果與分析

2.1 接骨草總黃酮的提取條件

2.1.1 料液比對(duì)接骨草總黃酮得率的影響 料液比對(duì)總黃酮得率有顯著影響(圖1A),隨著料液比的增加,接骨草總黃酮的得率逐漸增加,當(dāng)料液比達(dá)到1∶40 (g/mL)以后,總黃酮得率增加較少?？赡茉蚴且欢w積的溶劑能夠增加死細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)的溶脹作用,引起細(xì)胞膜的通透性增加或者膜破裂,從而溶解并釋放出接骨草總黃酮,再增加溶劑的體積總黃酮量也很難增加。方差分析結(jié)果表明料液比對(duì)總黃酮得率有重要影響,選擇1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)料液比作為優(yōu)化條件。

2.1.2 提取溫度對(duì)接骨草總黃酮得率的影響 提取溫度明顯影響總黃酮得率(圖1B),隨著溫度增高總黃酮得率逐漸增高,但90 ℃之后得率增加相對(duì)不多,表明在一定的溫度范圍內(nèi),較高溫度能夠疏松或破碎細(xì)胞壁而使黃酮容易滲出;過(guò)高的溫度(100 ℃)雖然會(huì)破壞更多的細(xì)胞壁和滲出更多黃酮,但是也引起溶劑蒸發(fā)和破壞黃酮結(jié)構(gòu),導(dǎo)致總黃酮增加不多,并且增加了耗能。方差分析結(jié)果表明,提取溫度對(duì)總黃酮得率有重要影響,選擇70、80、90 ℃作為優(yōu)化條件。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)接骨草總黃酮得率的影響 提取時(shí)間對(duì)總黃酮的得率有明顯影響(圖1C),隨提取時(shí)間增加,接骨草總黃酮得率逐漸增高,但75 min之后,黃酮得率的增加量不明顯,可能是大部分總黃酮已經(jīng)完全溶解。另外,提取的時(shí)間越長(zhǎng),提出的雜質(zhì)就越多[24],也不利于后續(xù)分離純化。方差分析結(jié)果表明,提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率有重要影響,選擇45、60、75 min作為優(yōu)化條件。

2.1.4 pH對(duì)接骨草總黃酮得率的影響 提取液pH對(duì)總黃酮得率有較大影響(圖1D)。在pH10.0時(shí)提取效果最好,在pH10.0之前隨著pH增大得率相應(yīng)提高,但在pH10.0之后隨著pH增大得率反而逐漸降低。說(shuō)明過(guò)高pH可能引起黃酮結(jié)構(gòu)的破壞,導(dǎo)致得率下降[25]。方差分析結(jié)果表明,pH對(duì)總黃酮得率有重要影響,選擇pH為9、10、11作為優(yōu)化條件。

2.1.5 提取接骨草總黃酮的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間和浸提液pH這四個(gè)因素,以正交表為(L9(34))安排實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 提取接骨草總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 2 L9(34)experimental results and analysis of extracting total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl

表3 提取接骨草總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Mean standard deviation analysis of L9(34)experimental results of extracting total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl

注：a.R2=0.897(調(diào)整R2=0.851)。

分析接骨草總黃酮的提取結(jié)果(表2和表3),影響提取接骨草總黃酮的因素順序?yàn)榻嵋簆H>提取時(shí)間>料液比>提取溫度,表明提取液pH是影響接骨草總黃酮提取的主要因素。提取接骨草總黃酮的最佳條件是浸提液pH10,提取時(shí)間為45 min,料液比為1∶40 (g/mL)、提取溫度為80 ℃。

2.2 驗(yàn)證結(jié)果

稱取接骨草粉末20.0 g三份,按照總黃酮的最佳提取條件提取黃酮,分別測(cè)定總黃酮含量,計(jì)算總黃酮得率的平均值為3.11%。

2.3 酸沉pH對(duì)接骨草總黃酮得率的影響

以提取總黃酮的最佳工藝條件提取脫脂后(可以去除脂溶性物質(zhì)如色素和磷脂等)接骨草粉末中的總黃酮,提取液經(jīng)過(guò)用濃鹽酸調(diào)酸性pH來(lái)沉淀總黃酮,測(cè)定酸性pH沉淀接骨草總黃酮的得率(圖2)。結(jié)果表明,在調(diào)節(jié)成pH3.5的溶液中沉淀的總黃酮含量較大。此后,調(diào)節(jié)的pH越大,沉淀的黃酮含量越少。說(shuō)明不同類型的黃酮化合物在酸性過(guò)強(qiáng)的溶液中生成烊鹽而析出[26]。用酸沉pH3.5溶液來(lái)沉淀接骨草總黃酮,其得率2.15%。比較最佳提取條件下提取的總黃酮得率3.11%,pH3.5溶液來(lái)沉淀接骨草總黃酮得率少,說(shuō)明提取液中還有部分黃酮沒(méi)有成鹽析出。

圖2 酸性pH對(duì)接骨草總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of pH on extracting rate of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl

2.4 接骨草總黃酮的抑菌作用

2.4.1 不同濃度接骨草總黃酮對(duì)三種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 以pH3.5沉淀提取液得到的總黃酮,用無(wú)菌水溶解,配制成濃度為0.31、0.63、1.25、2.5、5.0、10 mg/mL的溶液,檢測(cè)其抑菌作用(圖3)。表明,隨著濃度的增大,接骨草總黃酮對(duì)這三種細(xì)菌的抑制作用逐漸增強(qiáng);對(duì)照組無(wú)抑菌作用。根據(jù)抑菌圈明顯大于6 mm有抑菌性,接骨草總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng),最小抑菌濃度約為0.63 mg/mL;對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng),最小抑菌濃度約為1.25 mg/mL;對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱,最小抑菌濃度約為2.5 mg/mL。因此,接骨草總黃酮對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強(qiáng),對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌作用較弱?？赡苁桥c這兩種菌的細(xì)胞壁不同有關(guān)。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖和磷壁酸組成的,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單;而革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁除了含有少量肽聚糖以外,還含有蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、脂多糖等成分,使得陽(yáng)性菌對(duì)理化因子的敏感性強(qiáng)于陰性菌[27]。

圖3 不同濃度接骨草總黃酮對(duì)三種菌抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentrations of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl on the three bacteria fruit

2.4.2 不同作用時(shí)間接骨草總黃酮對(duì)三種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 在液體培養(yǎng)基中加入10%接骨草總黃酮來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌以研究對(duì)三種菌的抑制作用。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),接骨草總黃酮對(duì)三種菌的抑制作用逐漸增強(qiáng),并且抑菌強(qiáng)弱為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌,在處理10 h以后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率達(dá)到100%(圖4)。由于黃酮類物質(zhì)通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成、抑制細(xì)菌的能量代謝和核酸合成起作用[10],這種作用不是瞬時(shí)就可以完成,因此隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)抑菌率逐漸增加。

圖4 接骨草總黃酮不同處理時(shí)間對(duì)三種菌的抑制作用Fig.4 Inhibiton of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl of diffrent incubation times on the three bacteria

2.4.3 不同pH接骨草總黃酮溶液對(duì)三種細(xì)菌的抑制作用 測(cè)定不同pH的10%接骨草總黃酮溶液對(duì)三種菌的抑制作用(圖5)。結(jié)果表明,在pH4～5時(shí)接骨草總黃酮對(duì)這三種菌都有較強(qiáng)抑制作用,在pH6以后抑菌作用大幅度降低,在pH8時(shí)抑菌作用很弱了?？赡苁怯捎诖蠖鄶?shù)黃酮化合物含有酚羥基呈酸性,在酸性溶液中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在強(qiáng)堿性條件下可能會(huì)破壞其母核[28],因而降低了其抑菌活性。

圖5 不同pH接骨草總黃酮對(duì)三種菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl of different pH on the three bacteria

2.4.4 接骨草總黃酮對(duì)三種細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響 為了檢測(cè)接骨草總黃酮處理?xiàng)l件下細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性,用10%的接骨草總黃酮提取物培養(yǎng)三種菌一段時(shí)間測(cè)量其電導(dǎo)率。表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),三種菌液的電導(dǎo)率都增加(圖6)。結(jié)果說(shuō)明,接骨草總黃酮破壞了三種菌的細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的電解質(zhì)外滲,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生了抑菌作用[29]。與對(duì)照相比,在培養(yǎng)5 h時(shí),菌液的電導(dǎo)率以金黃色葡萄球菌的增加的幅度最多,而大腸桿菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加的最少,枯草芽孢桿菌的電導(dǎo)率增加的幅度居中。因此,接骨草總黃酮對(duì)菌膜的傷害作用以金黃色葡萄球菌的最強(qiáng),枯草芽孢桿菌次之,大腸桿菌的最差。

圖6 接骨草總黃酮對(duì)三種菌電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effects of total flavonoids of Sambucus chinensis Lindl on the electrical conductivity of the three bacteria注:A:大腸桿菌;B:枯草芽孢桿菌;C:金黃色葡萄球菌。

3 結(jié)論

本文用堿溶酸沉法研究了接骨草總黃酮的提取條件,確定了堿提工藝的最優(yōu)條件為浸提液pH10,提取時(shí)間45 min,料液比1∶40 (g/mL)、溫度為80 ℃;在這種條件下接骨草總黃酮的得率為3.11%。最優(yōu)提取工藝條件下的接骨草總黃酮提取液經(jīng)過(guò)用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH3.5時(shí)能夠沉淀2.15%的總黃酮。用堿溶酸沉法提取的接骨草總黃酮抑制金黃色葡萄球菌作用最強(qiáng)、抑制枯草芽孢桿菌的作用較強(qiáng)、抑制大腸桿菌的作用較弱,其最小抑菌濃度分別是0.63、1.25、2.50 mg/mL。接骨草總黃酮對(duì)這三種菌的抑制作用隨著處理時(shí)間(0～10 h)的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),在處理時(shí)間為10 h時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率可以達(dá)到100%,同時(shí)引起三種菌的電導(dǎo)率增加。接骨草總黃酮在酸性pH時(shí)對(duì)這三種菌都有抑制作用,且在pH4～5時(shí)抑制作用強(qiáng),在堿性pH8時(shí)抑制作用很弱。由于接骨草總黃酮具抑菌作用,所以,接骨草總黃酮用于食品的保鮮防腐有待于研究。這種研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用接骨草總黃酮提供了積極的指導(dǎo)作用。

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Study on the extraction and antibacterial effect oftotal flavonoids fromSambucuschinensisLindl

HUANG Guo-wen,GUAN Tian-qiu,ZHAO Yu-yun,CHEN Mo-lin,LIU Hong-hui

(Department of Biological Sciences and Chemical Engineerings,Hunan College ofScience and Technology,Yongzhou 425199,China)

By using alkali soluble and acid sinking method,total flavonoids ofSambucuschinensisLindlwere extracted,and its antibacterial effect were studied in this paper. The extraction conditions including solid-liquid ratio,extraction temperature,extraction time,pH of xetraction liquid of flavonoids fromSambucuschinensisLindlwere optimized by single factor experiments and orthogonal experiments,and meanwhile the sinking efficiency of total flavonoids were studied by acidic pH precipitation,and the antibacterial activity of total flavonoids was studied by filter paper discs method and turbidimetric method. The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids ofSambucuschinensisLindlwere as follow:solid-liquid ratio 1∶40 (g/mL),extraction temperature 80 ℃,extraction time 45 min,extraction liquid pH10,in which the extraction rate of total flavonoids ofSambucuschinensisLindlwas 3.11%. Adapting the extract to pH3.5 with HCl could better precipitate about 2.15% total flavonoids ofSambucuschinensisLindl. Total flavonoids ofSambucuschinensisLindlhad a stronger antibacterial activity onStaphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Escherichiacoliat acidic pH4～5 than at neutral pH and alkaline pH value,and these bacteria conductivity was increased by total flavonoids. The minimum inhibitory concentration of total flavonoids ofSambucuschinensisLindlon three bacteria were 0.63,1.25,2.50 mg/mL,respectively. The extracting process of total flavonoids fromSambucuschinensisLindlby using alkali soluble and acid sinking method was simple and inexpensive,and its total flavonoids had a great antibacterial activity,in which played a foundation on the development and utilization of total flavonoids ofSambucuschinensisLindl.

SambucuschinensisLindl;flavonoids;extraction process;antibacterial effect

2016-12-29

黃國(guó)文(1965-)，男，博士，講師，從事植物生物學(xué)的教學(xué)和研究工作，E-mail：huanggwdax@163.com。

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NK2021)；湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(XNZW15C19)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0036-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.007