宰后牦牛肉保水性變化與差異蛋白的生物信息學分析

左惠心 殷元虎 韓 玲 馬君義 宋仁德 余群力

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，蘭州730070;2．黑龍江省畜牧研究所，齊齊哈爾161005; 3．青海百德投資發(fā)展有限公司，西寧810008;4．玉樹藏族自治州畜牧獸醫(yī)工作站，玉樹815000)

宰后牦牛肉保水性變化與差異蛋白的生物信息學分析

左惠心1殷元虎2韓 玲1馬君義3宋仁德4余群力1

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，蘭州730070;2．黑龍江省畜牧研究所，齊齊哈爾161005; 3．青海百德投資發(fā)展有限公司，西寧810008;4．玉樹藏族自治州畜牧獸醫(yī)工作站，玉樹815000)

牦牛肉營養(yǎng)豐富，但保水性較低，影響了食用加工品質(zhì)。為了探究牦牛肉保水性影響機制，利用蛋白質(zhì)組學及生物信息學方法對高、低保水性組間差異蛋白質(zhì)進行了研究。以牦牛背最長肌為實驗材料，根據(jù)滴水損失和蒸煮損失，將18份樣品分為高保水性組(HWHC)和低保水性組(LWHC)，利用雙向電泳(2DE)技術(shù)篩選出6個差異倍數(shù)大于3倍且達到顯著水平(P＜0.05)的蛋白點，通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF/TOF)質(zhì)譜進行鑒定，并利用生物信息學方法對差異蛋白質(zhì)進行了疏水性分析和亞細胞定位分析。結(jié)果表明，HWHC和LWHC組間的差異蛋白分別是乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶M型(CKM)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)、肌球蛋白輕鏈(MLC)、肌鈣蛋白T(TnT)和熱休克蛋白27 kDa(HSP27)。對影響牦牛肉蒸煮損失的6種關(guān)鍵蛋白質(zhì)進行了疏水性分析，結(jié)果顯示LDH、CKM和TIM蛋白疏水性較高，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的高疏水性可以增強蛋白質(zhì)和水之間的排斥，這可能是導致牦牛肉中保水性差異的原因之一。亞細胞定位分析顯示，差異表達的蛋白質(zhì)在細胞中分為5個位置，差異蛋白質(zhì)均位于細胞質(zhì)和細胞核中。研究結(jié)果明確了宰后牦牛肉保水性變化趨勢，并通過差異蛋白的生物信息學分析揭示了蛋白質(zhì)影響牦牛肉保水性的作用機理。

牦牛;滴水損失;蒸煮損失;雙向電泳;生物信息學

引言

牦牛(Bos grunniens)是世界上唯一能在海拔3 000m以上生長的牛種，在高海拔、冷季長、飼草短缺等嚴酷條件下，具有極高的適應(yīng)力和抗逆性［1］。牦牛肉營養(yǎng)豐富，但保水性(Water-holding capacity，WHC)較低，影響了食用加工品質(zhì)［2］。因此，控制宰后汁液損失，減少經(jīng)濟損失是牦牛肉加工產(chǎn)業(yè)中亟待解決的問題。

滴水損失是描述生鮮肉保水性最常用的指標［3］，蒸煮損失是描述加工肉保水性最常用的指標［4］。肉中滴水損失和蒸煮損失的升高會引起肉胴體和分割肉的質(zhì)量損失［5］，還可能影響加工肉的產(chǎn)量和品質(zhì)［6］，滴水損失和蒸煮損失的共同研究可以較為全面地研究肉的保水性。雖然影響肉與肉制品保水性的因素很多，但這些影響的最終結(jié)果往往是改變了肌肉蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其空間排布［7］。因此，宰后肌肉蛋白質(zhì)的變化是研究保水性變化機理的重點之一。前期研究對比了黃牛和牦牛的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)牦牛為適應(yīng)高原低氧環(huán)境，存在特有的肌肉生物學特性和肉品質(zhì)形成途徑［8］。然而，目前對宰后牦牛肉保水性機制尚未進行深入研究，采用蛋白質(zhì)組學方法研究生鮮、加工牦牛肉保水性形成的機制也未見報道，采用生物信息學分析方法挖掘差異蛋白質(zhì)中所包含的生物學信息的研究也較少［9］。

本文以牦牛背最長肌為研究對象，通過比較高、低保水性組中宰后牦牛肉滴水損失率、蒸煮損失率變化，進而鑒定出高、低保水性組中的差異蛋白質(zhì)，并結(jié)合生物信息學方法分析差異蛋白質(zhì)的疏水性和亞細胞定位，探討蛋白質(zhì)影響肌肉保水性的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于甘肅省臨夏回族自治州臨夏市，采集18頭 48月齡放牧牦牛的左、右側(cè)背最長肌各1 500 g，經(jīng)屠宰后，去除表面脂肪、筋腱及結(jié)締組織后，立即用磷酸鹽緩沖液清洗表面血跡后進行宰后成熟。在成熟的不同時間點(0、1、3、5、7 d)分別取樣，使用左側(cè)背最長肌測定肉品質(zhì)指標，之后將右側(cè)背最長肌切成厚2 cm的肉塊，裝在聚乙烯食品保鮮袋中，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

固定化pH梯度(IPG)膠條(pH值3～10，非線性，長度17 cm)，載體兩性電解質(zhì)(Bio-lyte)(pH值3～10)，美國Bio-rad公司;3-［(3-膽酰胺丙基)二乙胺］-1-丙磺酸(CHAPS)，二硫蘇糖醇(DTT)，α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)，乙腈(ACN)，三氟乙酸(TFA)，美國Sigma公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器廠;UV-250型紫外分光光度計，日本島津公司;TGL-24MC型臺式高速冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司;CP214型電子天平，奧豪斯儀器有限公司;DHG9070A型電熱鼓風干燥箱，上海越眾儀器設(shè)備有限公司;Protean i12 IEF型雙向電泳儀，Protein II型垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司;5800型MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀，AB SCIEX公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 滴水損失率測定

參照OTTO等［10］的方法并做改進，即取屠宰后的樣品50 g，精確稱量后用細線系起一端，小心將肉樣懸空于袋中，使肉樣不與袋接觸，用細線將袋口扎緊，懸掛于4℃條件下靜置24 h，根據(jù)2次稱量的質(zhì)量差異計算肉的滴水損失率。滴水損失率越大，則肉的保水性越差。滴水損失率計算公式為

式中 m1——懸掛前肉樣質(zhì)量

m2——懸掛后肉樣質(zhì)量

1.3.2 蒸煮損失率測定

參照MONTOWSKA等［6］的方法并做改進，將尺寸不小于6 cm×3 cm×3 cm的肉樣(約60 g)稱量后放入80℃恒溫水浴鍋中加熱，當肉樣中心溫度達到70℃時開始計時，使肉樣中心溫度保持在70℃繼續(xù)煮30 min。用濾紙吸去肉樣表面水分后再次稱量，根據(jù)2次稱量的質(zhì)量差異計算肉的蒸煮損失率。蒸煮損失率越大，則肉的保水性越差。蒸煮損失率計算公式為

式中 m3——蒸煮前肉樣質(zhì)量

m4——蒸煮后肉樣質(zhì)量

1.3.3 pH值測定

參照BEE等［11］的方法，取50 g肉樣，用蒸餾水沖洗肉樣上的血漬，并用干凈濾紙吸干表面殘留水分，隨機選擇3個不同位置的肉樣進行pH值測定，取其平均值。

1.3.4 肌肉蛋白質(zhì)的提取

取出－80℃條件下保存的肌肉組織5 g，冰凍狀態(tài)下放入研缽中，加入適量液氮研磨至粉末狀，然后加入8mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.01 g/mL DTT、0.02 g/mL CHAPS和體積分數(shù)2%的Bio-lyte，并進行勻漿［12］。4℃條件下10000 g離心30min，離心后的上清液于 －80℃分裝保存。蛋白質(zhì)定量參照BRADFORD［13］的方法進行。

1.3.5 不同保水性牦牛肌肉雙向凝膠電泳

參照ZUO等［2］的方法進行雙向凝膠電泳(Two dimensional electrophoresis，2DE)分析，根據(jù)蛋白質(zhì)定量濃度，取400μg蛋白質(zhì)上樣提取液，在以下程序進行等電聚焦:50 V主動水化14 h，500 V快速升壓1 h，1 000 V快速升壓1 h，2 000 V快速升壓，9 000 V線性升壓6 h，聚焦到80 000 V·h，500 V保持。聚焦結(jié)束后，分別用含質(zhì)量濃度2 g/(100mL) DTT和2.5 g/(100mL)碘乙酰胺(IAA)的膠條平衡緩沖液平衡膠條各15min［2］。將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移到雙向凝膠上端，將電泳緩沖液倒入電泳槽中。設(shè)置電泳儀參數(shù):100W電泳2 h，然后150W下電泳約10 h，直到溴酚藍到達膠底部后關(guān)閉電泳，撥膠，用快速考馬斯亮藍染色法進行膠的染色。隨后將凝膠放于圖像掃描器上，根據(jù)PDQuest 8.0.1軟件匹配結(jié)果篩選差異蛋白點，并進行質(zhì)譜鑒定。

1.3.6 質(zhì)譜鑒定

(1)膠內(nèi)酶解

將膠粒切碎后加入200～400μL 100mmol/L碳酸氫銨(NH4HCO3)以及30%ACN脫色液，清洗脫色，加入 100 mmol NH4HCO3，室溫(20℃)孵育15min。加入5μL質(zhì)量濃度2.5～10 ng/μL的測序級胰蛋白酶溶液，37℃反應(yīng)后靜置20 h左右;吸出酶解液，加入100μL 60%ACN與0.1%TFA，超聲處理15min，合并酶解液凍干［6］。

(2)質(zhì)譜分析

凍干后的酶解樣品，取2μL 20%ACN復溶。再取0.5μL過飽和CHCA基質(zhì)溶液點至對應(yīng)靶位上并干燥。用AB SCIEX 5800型串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行測試分析，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)［8］。

1.3.7 生物信息學分析

(1)差異蛋白質(zhì)的疏水性分析

利用ExPASy服務(wù)器中的ProtScale程序分析牦牛肉不同保水性組間差異蛋白質(zhì)的疏水性。輸入ExPASy-ProtScale，序列框中輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫中牦牛差異蛋白質(zhì)所對應(yīng)基因的氨基酸序列，選擇Hphob．/Kyte＆ Doolittle，即計算基于 K-D(Kyte-Doolittle)法的蛋白質(zhì)疏水性，點擊提交［14］。

(2)差異蛋白質(zhì)的亞細胞定位

使用Wolf PSORT軟件對牦牛肉不同保水性組間差異蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行預測。連接Wolf PSORT服務(wù)器，輸入以Uniprot數(shù)據(jù)庫中牦牛差異蛋白質(zhì)所對應(yīng)基因的FASTA格式序列［15］。得分最高的選項即為蛋白質(zhì)基于KNN算法的主要定位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進行方差分析，采用一般線性模型、SNK(Student-Newman-Keuls)測試進行顯著性分析。凝膠圖像的比對分析軟件為PDQuest 8.0.1(美國Bio-rad公司)，蛋白點豐度差異倍數(shù)為3倍以上且P＜0.05判定為差異顯著。質(zhì)譜測試用Mascot 2.2軟件檢索數(shù)據(jù)庫。利用在線數(shù)據(jù)庫ExPASy(http:∥web．expasy．org/protparam/)服務(wù)器、Uniprot(http:∥www．uniprot．org/)數(shù)據(jù)庫和Wolf PSORT(http:∥www．genscript．com/wolf-psort．htm l)軟件進行蛋白質(zhì)的疏水性和亞細胞定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚類分析

如圖1所示，以宰后1 d牦牛肉背最長肌的滴水損失率、蒸煮損失率為變量對18頭牦牛進行聚類分析。根據(jù)聚類分析結(jié)果，分別挑選出高保水性組(High water-holding capacity，HWHC，滴水損失率2.01%～2.43%，蒸煮損失率29.98%～32.34%)和低保水性組(Low water-holding capacity，LWHC，滴水損失率3.62% ～4.15%，蒸煮損失率36.02%～38.07%)各6頭(P＜0.05)。選取高、低保水性組的牦牛肉樣進行宰后肉品質(zhì)變化及2DE分析。

圖1 不同保水性牦牛肉的聚類分析結(jié)果Fig．1 Cluster analysis result in differentWHC groups in yak muscle

2.2 牦牛肉中pH值的變化

pH值用來直觀體現(xiàn)機體生成的酸性物質(zhì)(主要是乳酸)含量［16］。如圖2所示，隨著成熟時間的延長，宰后初期0～1 d牦牛肉的pH值顯著降低(P＜0.05)，隨著成熟時間延長，3 d后緩慢回升，在整個成熟過程中，高保水性組和低保水性組差異不顯著。圖2中a、b不同字母表示pH值隨成熟時間差異顯著(P＜0.05)，x表示高、低保水性組間差異不顯著(P＞0.05)。主要原因可能是宰后初期，糖原被分解而產(chǎn)生大量乳酸使得pH值大幅度下降，接近肌球蛋白等電點;但當pH值降低到一定程度后，H+濃度的升高使得與糖酵解相關(guān)的酶被鈍化，酵解速度和程度逐漸減小，pH值回升［16］。

圖2 不同保水性組牦牛肉宰后成熟過程pH值的變化Fig．2 pH values changes in yak muscle during postmortem aging in differentWHC groups

2.3 牦牛肉中滴水損失率的變化

滴水損失率是衡量肌肉保水性的重要指標［17］，如圖3所示，高保水性組和低保水性組的牦牛背最長肌滴水損失率隨著成熟時間的延長，先增大后減小，在成熟前期(0～3 d)和成熟后期(3～5 d)，滴水損失率差異顯著(P＜0.05)。在宰后成熟過程中，高、低保水性組之間差異顯著(P＜0.05)。在宰后第3天，高、低保水性組的滴水損失率分別達到3.56%和6.03%。圖3中a～d不同字母表示滴水損失隨成熟時間差異顯著(P＜0.05)，x、y不同字母表示高、低保水性組間差異顯著(P＜0.05)。宰后成熟過程中，肌纖維束和單個肌肉細胞會分離，它們之間就留下了一些空隙。水從細胞外空隙移動到肉的表面形成滴水損失的過程，主要是把最大的空隙當作滴水通道，使液體沿著肌纖維方向流到切割肉的表面［18］。

圖3 不同保水性組牦牛肉宰后成熟過程中滴水損失率的變化Fig．3 Changes of drip loss rate in yak muscle during postmortem aging in differentWHC groups

圖4 不同保水性組牦牛肉宰后成熟過程中蒸煮損失率的變化Fig．4 Changes of cooking loss rate in yak muscle during postmortem aging in differentWHC groups

2.4 牦牛肉中蒸煮損失率的變化

蒸煮損失率也是評價肌肉保水性的重要指標，如圖4所示，隨著宰后成熟時間的延長，高保水性組和低保水性組的牦牛背最長肌蒸煮損失率先增大后減小。兩組的蒸煮損失率先隨著成熟時間(0～3 d)的增加顯著增大(P＜0.05)，高、低保水性組分別在宰后3 d時達最大值36.61%和44.52%。兩組的蒸煮損失率在成熟3～7 d逐漸降低。高、低保水性組除開始時，在整個成熟過程中差異顯著(P＜0.05)。圖4中a～d不同字母表示蒸煮損失率隨成熟時間差異顯著(P＜0.05)，x、y不同字母表示高、低保水性組間差異顯著(P＜0.05)。高、低蒸煮損失率組在宰后初期，蒸煮損失率均呈現(xiàn)上升趨勢，可能是因為pH值下降誘導肌原纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)收縮，同時在加熱條件下，由于蛋白質(zhì)的熱變性作用使肌原纖維緊縮，能潴留不易流動水的空間變小，部分不易流動水變成自由水流出［19］。

2.5 牦牛肉2DE差異表達蛋白點的確定

將高、低保水性組2DE凝膠均放于圖像掃描器上，選擇透射模式，以300 dpi分辨率掃描16位灰度圖像，設(shè)置優(yōu)化靈敏度、算符大小和背景噪聲等參數(shù)，初步識別凝膠圖像中的點。創(chuàng)建參考膠，手工匹配部分蛋白點，由PDQuest 8.0.1軟件自動匹配后進行手工校正，所得結(jié)果進一步在參考膠中驗證，選擇差異倍數(shù)大且有統(tǒng)計學意義的蛋白點作為保水性相關(guān)的差異表達蛋白點。如圖5所示，根據(jù)2DE圖譜中的點豐度分析，在宰后高、低保水性組牦牛背最長肌中，共確定6個差異倍數(shù)大于3倍且達到顯著水平(P＜0.05)的蛋白點。

圖5 宰后不同保水性組牦牛肉2DE差異蛋白點標記Fig．5 2DE gel images of differentially abundant proteins in postmortem yak muscle between HWHC and LWHC groups

2.6 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定

通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定，共成功鑒定出可信度大于95%的6種蛋白質(zhì)，點編號、蛋白名稱、檢索號、數(shù)據(jù)庫來源、分子量、等電點、蛋白表達量和差異倍數(shù)如表1所示。其中3個點在高保水性組的牦牛肉中表達量較高，3個點在低保水性組的牦牛肉中表達量較高。這些差異蛋白質(zhì)的等電點(pI值)大多集中在 6～9左右，分子量在30～45 kDa之間。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，差異蛋白質(zhì)主要在2DE凝膠中性或堿性區(qū)被發(fā)現(xiàn)，分別為代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白和應(yīng)激蛋白。

表1 宰后不同保水性組牦牛肉差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab．1 Identification results of differentially abundant proteins in postmortem yak muscle between HWHC and LWHC groups

WU等［20］研究發(fā)現(xiàn)，影響牛肉肉色穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)主要涉及宰后的氧化代謝，這些蛋白質(zhì)可延緩宰后pH值下降。DICK等［21］對豬肌肉保水性進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)豐富度出現(xiàn)顯著差異的蛋白質(zhì)中，磷酸肌酸激酶的高豐富度能使磷酸肌酸快速降解的遲滯階段相對縮短，進而使pH值下降更快、肌肉收縮加強，最終導致汁液流失的大量增多。本文結(jié)果也顯示代謝酶在宰后肉保水性變化中起重要作用。

2.7 生物信息學分析

生物信息學作為一門生物學、數(shù)學和計算機相互交叉融合而產(chǎn)生的新興學科，近年來隨著基因組學和蛋白質(zhì)組學的興起而迅速發(fā)展起來。為了充分挖掘差異蛋白質(zhì)包含的生物學信息，目前在互聯(lián)網(wǎng)上已經(jīng)建立了許多蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，如 NCBInr、Swiss-Prot、PIR、Prosite等，這些數(shù)據(jù)庫通過對生物學實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析，進而達到提取數(shù)據(jù)所蘊含的生物學意義的目的［9］。

2.7.1 差異蛋白質(zhì)的疏水性分析

氨基酸側(cè)鏈的一個重要特性是其具有親水性和疏水性，不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)其親、疏水性殘基的分布不同，分析蛋白質(zhì)的親、疏水性模式可揭示某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和折疊信息。20種氨基酸的疏水性指數(shù)分別為:Ala，1.800;Arg，－4.500;Asn，－3.500; Asp，－3.500;Cys，2.500;Gln，－3.500;Glu，－3.500;Gly，－0.400;His，－3.200;Ile，4.500; Leu，3.800;Lys，－3.900;Met，1.900;Phe，2.800; Pro，－1.600;Ser，－0.800;Thr，－0.700;Trp，－0.900;Tyr，－1.300;Val，4.200［22］。

對與牦牛肉保水性相關(guān)的6個差異蛋白質(zhì)進行了疏水性分析。在本實驗中設(shè)定窗口寬度為9個氨基酸殘基，系統(tǒng)自動繪制出了牦牛乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶M型(CKM)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)、肌球蛋白輕鏈(MLC)、肌鈣蛋白T(TnT)和熱休克蛋白27 kDa(HSP27)6個蛋白的疏水性圖，6個蛋白均存在顯著的疏水區(qū)(圖6)。牦牛LDH蛋白在75～100和340～350氨基酸之間有2個典型的疏水性區(qū)域，峰值約為2.6。CKM在70～80個氨基酸之間有一個典型的疏水性區(qū)域，峰值大于2。TIM在約第125個氨基酸位置有一個典型的疏水性區(qū)域，峰值約為2.25。MLC蛋白疏水區(qū)域較密集，在約第800個氨基酸處有最高峰，峰值約為3。TnT蛋白的疏水性最高峰位于60～80個氨基酸之間，峰值約為1.0。HSP27蛋白在第70～80和130～140個氨基酸之間有2個典型的疏水性區(qū)域，峰值約為2.2。

圖6 牦牛肉差異蛋白的疏水性分析Fig．6 Prediction analysis of hydrophobicity of differentially abundant proteins in yak muscle

由圖6a～6c可知，在LDH、CKM和TIM蛋白中，大于1的疏水性區(qū)域較廣，因此LDH、CKM和TIM蛋白疏水性較高，保水性較差，與前文2DE結(jié)果一致(表1)，即表明LDH、CKM和TIM的高疏水性可以增強蛋白質(zhì)和水之間的排斥，這可能導致低保水性組中水分流失。另一方面，LDH、CKM和TIM均為代謝酶，宰后糖酵解和能量代謝使乳酸堆積，肌肉pH值迅速降低，首先會使肌漿蛋白凝結(jié)到肌原纖維上，蛋白質(zhì)溶解度下降，增加了自由水的流失，造成保水性下降［23］。其次，隨著pH值的快速下降，肌球蛋白變性作用的敏感性提高，肌球蛋白變性會降低保水性［24］。另外，pH值下降破壞了肌肉蛋白質(zhì)電荷間的平衡，蛋白質(zhì)帶凈負電荷的數(shù)量減少，大量水分被壓迫擠出，此時吸附水的能力下降。當pH值下降到接近肌肉蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，此時肌肉的保水性最低［25］。

2.7.2 差異蛋白質(zhì)的亞細胞定位

蛋白質(zhì)的亞細胞定位預測一直是生物信息學研究的重點，亞細胞定位與蛋白質(zhì)的功能存在著非常緊密的聯(lián)系。如表2所示，高、低保水性組間的6個差異蛋白在細胞中位于5個位置，主要位于細胞質(zhì)和細胞核中。其中，LDH在線粒體中得分最高，CKM、TIM和MLC在細胞質(zhì)中得分最高，TnT和HSP27在細胞核中得分最高，得分最高的位置即為該蛋白的主要亞細胞定位。FOUCAULT等［26］研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解酶和肌酸激酶在肌漿內(nèi)存在相互作用，以完成能量運輸和傳導，肌漿是改變細胞內(nèi)pH值及代謝酶活性的重要場所。代謝酶主要位于肌漿和線粒體中，且差異蛋白質(zhì)主要位于細胞質(zhì)和細胞核中。

表2 牦牛肉差異蛋白的亞細胞定位Tab．2 Subcellular unit positioning of differentially abundant proteins in yak muscle

細胞質(zhì)是細胞膜內(nèi)的一種凝膠狀物質(zhì)，是細胞新陳代謝的主要場所，對細胞核有一定的調(diào)控作用［27］。細胞質(zhì)包含除細胞核以外的所有細胞器，在細胞發(fā)揮生理功能中起重要的作用，主要包括細胞質(zhì)基質(zhì)、內(nèi)膜系統(tǒng)、細胞骨架和中心體。細胞核在細胞的代謝、生長、發(fā)育、分化中起著重要作用，是生物體遺傳物質(zhì)的主要存在部位，主要是由核膜、染色質(zhì)、核仁和核骨架構(gòu)成［28］。因此，細胞核和細胞質(zhì)作為蛋白質(zhì)合成和發(fā)揮作用的場所，在肌細胞中發(fā)揮了重要的作用，可以通過對蛋白質(zhì)亞細胞定位的預測為未來專一研究差異蛋白質(zhì)的性質(zhì)提供理論依據(jù)。

3 結(jié)束語

通過比較高、低保水性組中宰后牦牛肉pH值、滴水損失率、蒸煮損失率變化，得到了宰后牦牛肉保水性變化規(guī)律。通過蛋白質(zhì)組學分析，鑒定出與保水性相關(guān)的6個差異蛋白質(zhì)，分別為乳酸脫氫酶、肌酸激酶M型、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白T和熱休克蛋白27 kDa。通過生物信息學方法分析差異蛋白質(zhì)的疏水性，表明氨基酸的疏水性對蛋白質(zhì)保水性產(chǎn)生重要影響，亞細胞定位分析顯示，差異蛋白質(zhì)主要位于細胞質(zhì)和細胞核中。本文從肌肉保水性、蛋白質(zhì)分子、肌肉細胞3個不同層面，闡明宰后成熟過程中牦牛肉的保水性機制，為解釋牦牛肌肉生物學特性和肉品質(zhì)差異提供了有意義的理論依據(jù)。

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Changes of Postmortem W ater-holding Capacity in Yak Muscle and Bioinformatic Analysis of Differentially Abundant Proteins

ZUO Huixin1YIN Yuanhu2HAN Ling1MA Junyi3SONG Rende4YU Qunli1
(1．College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China 2．Animal Husbandry Research Institute of Heilongjiang Province，Qiqihar 161005，China 3．Qinghai Baide Investment Development Limited Company，Xining 810008，China 4．Animal Husbandry and Veterinary Station of Yushu，Yushu 815000，China)

Yak meat is rich in nutrients，but has low water-holding capacity(WHC)，which affects its edible and processing quality．Therefore，control of postmortem juice loss and reduction of economic loss are crucial issues needing urgent resolution in the yak meat processing industry．Existing research suggested that changes in proteins affected the WHC of postmortem muscle，but relevantmechanism was still not entirely clear because of the complexity of protein composition．Thus，it is very important to explore the variation mechanism of postmortem WHC of yak meat by combining multiple analytical and testingmethods．Proteomics research combined with bioinformatics approach was studied by comparing high-WHC(HWHC)and low-WHC(LWHC)groups．Based on the data obtained from drip loss and cooking loss，totally 18 longissimus dorsi of yak can be classified into HWHC and LWHC groups．Totally six proteinswere found to be abundant differentially between HWHC and LWHC groups and identified by matrix assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight(MALDI-TOF/TOF)．Matched spots exhibited a three fold or more intensity difference in the meantime associated with 5%statistical significance(P＜0.05)．Then hydrophobicity analysis and subcellular localization prediction were usedto validate the representative proteins．Results showed that differentially abundant proteins were lactate dehydrogenase(LDH)，creatine kinase M-type(CKM)，triosephosphate isomerase(TIM)，myosin light chain(MLC)，troponin T(TnT)and heat shock 27 kDa(HSP27)．The analysis of hydrophobicity performed that LDH，CKM and TIM had more hydrophobic regions．The results showed that the high hydrophobicity could enhance the rejection of protein and water，which might lead to the weak water retention of yak meat．In subcellular localization prediction，the differentially abundant proteins in the cells were divided into five positions．All of the differentially abundant proteins were located in the cytoplasm and nucleus．Accordingly，proteomics and bioinformatics analyseswere proven to be excellent tools to quantify the changes of proteins and biological information linked to WHC，and thus helping to explain the processes behind characteristicmeat quality traits in yak muscle．

yak;drip loss;cooking loss;two dimensional electrophoresis;bioinformatics

TS207.3

A

1000-1298(2017)07-0325-07

2017-05-18

2017-06-13

國家自然科學基金項目(31460402、31560463)、青海省重點研發(fā)與轉(zhuǎn)化計劃項目(2017-NK-C6)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)(肉牛牦牛)技術(shù)體系項目(CARS-38)

左惠心(1988—)，女，博士生，主要從事畜產(chǎn)品加工研究，E-mail:likevvhappy@163．com

余群力(1962—)，男，教授，博士生導師，主要從事畜產(chǎn)品貯藏加工研究，E-mail:yuqunlihl@163．com

10．6041/j．issn．1000-1298．2017．07．041