宰后牦牛肉細(xì)胞凋亡對肌肉內(nèi)環(huán)境與嫩度的影響

王琳琳 馬君義 余群力 韓 玲 郭宗林 石紅梅

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730070;2．青海百德投資發(fā)展有限公司，西寧810008; 3．甘南藏族自治州畜牧科學(xué)研究所，合作747000)

宰后牦牛肉細(xì)胞凋亡對肌肉內(nèi)環(huán)境與嫩度的影響

王琳琳1馬君義2余群力1韓 玲1郭宗林1石紅梅3

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730070;2．青海百德投資發(fā)展有限公司，西寧810008; 3．甘南藏族自治州畜牧科學(xué)研究所，合作747000)

為探究牦牛肉宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡對肌肉內(nèi)環(huán)境、細(xì)胞凋亡因子及嫩度的影響，以經(jīng)環(huán)孢菌素A(CsA)處理的牦牛背最長肌為研究對象，測定了成熟過程中肌肉內(nèi)環(huán)境指標(biāo)、凋亡因子及嫩度指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，24～120 h時間內(nèi)，CsA組肌纖維直徑和肌纖維橫截面積均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)大于對照組;宰后6 h、72～120 h，CsA組pH值顯著低于對照組(P＜0.05)，宰后6～168 h，CsA組ATP含量均高于對照組，且在宰后12 h、72～168 h兩者之間ATP含量存在顯著差異(P＜0.05);成熟過程中CsA組MPTP開放程度極顯著低于對照組(P＜0.01);成熟前期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著低于對照組，成熟后期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著高于對照組;在整個成熟過程中(除72～120 h)，CsA組caspase-3活性均顯著或極顯著低于對照組，CsA組Hsp27表達(dá)量均顯著或極顯著低于對照組;12～24 h，CsA組剪切力顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于對照組。表明CsA能夠通過抑制MPTP的開放而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生并影響肌肉內(nèi)環(huán)境、caspase-3活性、Hsp27表達(dá)，剪切力及肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化，說明細(xì)胞凋亡的發(fā)生對肌肉內(nèi)環(huán)境變化及宰后牦牛肉嫩化具有重要影響，且可以通過控制宰后肌肉細(xì)胞凋亡發(fā)生進(jìn)程來調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)環(huán)境變化及肌肉嫩化程度。

耗牛肉;宰后成熟;細(xì)胞凋亡;肌肉內(nèi)環(huán)境;環(huán)孢菌素A;微觀結(jié)構(gòu)

引言

隨著國內(nèi)外學(xué)者對肌肉成熟嫩化機(jī)制的不斷探究，研究的熱點(diǎn)逐漸由組織蛋白酶系和鈣激活酶系轉(zhuǎn)向細(xì)胞凋亡酶系對宰后肌肉嫩度的改善作用。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主、有序的細(xì)胞死亡形式［1－2］，分為外源死亡受體途徑及內(nèi)源線粒體途徑，其中線粒體途徑被認(rèn)為是哺乳動物及其他細(xì)胞模型發(fā)生凋亡的主要途徑，而Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中這一關(guān)鍵步驟，是線粒體途徑發(fā)生的根本原因［3］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是位于線粒體內(nèi)外膜之間由多種蛋白質(zhì)共同組成的、具有非特異性、電壓依賴性的復(fù)合物孔道，眾多研究表明其與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因各種因素導(dǎo)致的MPTP的開放，被認(rèn)為是Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中的直接原因［4］。同時，MPTP的專一性抑制劑CsA能夠有效抑制MPTP的開放及細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5］。然而，關(guān)于在牦牛肉宰后成熟過程中，CsA是否通過抑制MPTP開放進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并對肌肉內(nèi)環(huán)境及牦牛肉嫩度造成影響的研究，國內(nèi)外尚未見報道。因此，有必要研究CsA處理對細(xì)胞凋亡的抑制作用及對肌肉內(nèi)環(huán)境和嫩度的影響，為細(xì)胞凋亡改善牦牛肉嫩度機(jī)制提供理論依據(jù)。

細(xì)胞凋亡對肌肉的嫩化作用是近年來肉品科學(xué)研究的熱點(diǎn)，尤其在細(xì)胞凋亡對肌原纖維蛋白降解方面國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究。SENTANDREU等［6］于2002年首次將細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡酶引入到宰后肌肉的蛋白水解及嫩化過程中，認(rèn)為在動物屠宰以后會發(fā)生細(xì)胞的死亡即細(xì)胞凋亡，而并非細(xì)胞壞死，這一理論為細(xì)胞凋亡嫩化機(jī)制提供了理論可行性及研究的必要性。KEMP等［7］研究發(fā)現(xiàn)宰后豬肉caspase-3活性與剪切力呈顯著相關(guān)性;孫志昶等［8］在研究宰后不同部位牦牛肉細(xì)胞凋亡與肉嫩度之間關(guān)系時，也發(fā)現(xiàn)caspase-3活性與剪切力呈顯著或極顯著的關(guān)系。CHEN等［9］研究指出凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿、依托泊苷及Ca2+均能提高肌原纖維的水解;HUANG等［10］利用 caspase-3的選擇性抑制劑DEVE-CHO處理宰后肉類時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的caspase-3選擇性抑制劑可以抑制肌肉骨架蛋白的降解，以上研究進(jìn)一步說明細(xì)胞凋亡酶能夠降解肌細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)而改善肌肉嫩度。

近年來在細(xì)胞凋亡對肌肉的嫩化方面，國內(nèi)外學(xué)者已作了大量的研究，然而關(guān)于肌肉在宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡如何發(fā)生，及其與肌肉內(nèi)環(huán)境的關(guān)系，以及進(jìn)而改善肌肉嫩度方面的研究報道較少。本文以經(jīng)CsA處理的牦牛肉為研究對象，測定成熟過程中肌肉內(nèi)環(huán)境變化指標(biāo)、細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)及嫩度相關(guān)指標(biāo)，初步探索CsA處理對細(xì)胞凋亡的抑制作用及對肌肉內(nèi)環(huán)境與嫩度的影響，最終明確細(xì)胞凋亡發(fā)生進(jìn)程與肌肉內(nèi)環(huán)境、肌肉嫩度變化的關(guān)系，以期為牦牛肉宰后實(shí)際生產(chǎn)嫩化過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料:牦牛由甘肅天瑪生態(tài)食品科技股份有限公司提供，選取在同一牧場，生長發(fā)育正常、健康無病、體重均勻、平均年齡2～4歲的甘南牦牛10頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。

試驗(yàn)試劑:環(huán)孢菌素A、蔗糖、甘露醇、EDTA、牛血清白蛋白、Hepes、二甲苯、連二亞硫酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、疊氮鈉、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、PVDF膜、免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑ECL、顯影粉、定影粉、Anti-Hsp27抗體;caspase-3活性測定試劑盒等。

1.2 主要儀器設(shè)備

Spectramax M2型酶標(biāo)儀，美國美谷分子儀器有限公司;RF5301-PC型熒光分光光度計，日本島津公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;C-LM4型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司;XH-B型旋渦混合器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司;Tanon-5200型全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，上海天能科技有限公司;SH-100型凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海四星生物技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集和制備

以背最長肌(Longissimus dorsi)為試驗(yàn)對象，從胴體上取下背最長肌約40 g，用錫箔紙包裹后立即放入液氮中作為0 h樣品。其余肉樣迅速切成小塊(40 g/塊)，隨機(jī)分成2組，1組不作任何處理為空白對照樣品，另1組注射200mmol/L的CsA溶液(料液比1 g/mL)，于4℃條件下，分別成熟6、12、24、72、120、168 h，并在相應(yīng)時間點(diǎn)測定pH值和剪切力，對于caspase-3活力、Cyt-c含量等不便立即測定的指標(biāo)，將肉樣在設(shè)計時間點(diǎn)采集并用液氮迅速冷卻后置于－80℃待測。

1.3.2 肌肉組織學(xué)觀察

將樣品切成長×寬 ×高為1.0 cm×0.5 cm× 0.5 cm的肉塊，用10%中性甲醛溶液浸泡48 h，然后將樣品放入70%、80%、90%、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中脫水1 h，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各10 min;二甲苯各透明15min后組織包埋、修片、切片、染色，中性樹膠封片后顯微拍照。然后用 Motic Images Advanced 3.2圖像處理系統(tǒng)軟件測量單根肌纖維直徑、肌細(xì)胞間距和肌纖維橫截面積，同時觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。

1.3.3 pH值測定

將便攜式pH計的探針插入肉樣中，使pH計的電極與肌肉組織充分接觸，讀數(shù)穩(wěn)定后記錄，每個肉樣重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.4 ATP含量測定

參照南京建成生物工程研究所的ATP含量測定試劑盒說明書測定ATP含量(摩爾質(zhì)量濃度)，用雙縮脲法測定樣品的蛋白含量，ATP含量的單位為μmol/g。

1.3.5 MPTP開放程度測定

參照LI等［11］及胡志剛等［12］研究方法，取牛背最長肌，剪碎后置于 10倍線粒體分離介質(zhì)中(220mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖和2.0mmol/L EDTA，5.0mmol/L 4-丙磺酸基嗎啉和0.5%牛血清白蛋白，pH值7.4)用勻漿機(jī)勻漿。勻漿液于4℃，1 000 g離心10 min，取上清1 000 g離心10 min，于4℃，8 000 g離心20min，所得沉淀為線粒體，上清液為胞漿。線粒體蛋白含量用雙縮脲法進(jìn)行檢測，使用前用MPTP測試介質(zhì)稀釋至0.3mg/mL蛋白質(zhì)量濃度。MPTP測試介質(zhì)(230 mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖，3.0mmol/L Hepes，pH值7.4)。在石英杯中加入3mLMPTP測試介質(zhì)，然后根據(jù)線粒體的蛋白濃度加入一定量的線粒體，用紫外分光光度計檢測540 nm處的吸光度，吸光度增大，表明孔的開放程度減小。

1.3.6 胞漿中Cyt-c濃度測定

參照辛國榮等［13］研究方法，取純化的1.5 mL胞漿，加少許連二亞硫酸鈉(0.025 g)，振搖后，在520 nm處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算胞漿中Cyt-c的濃度。

1.3.7 caspase-3活性測定

按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書并稍作改進(jìn)對caspase-3的活性進(jìn)行測定。取90 mg組織肉樣，剪碎后加入500μL caspase-3裂解液，用玻璃勻漿機(jī)于4℃勻漿30次。勻漿液于4℃，10 000 g離心10 min，離心完畢后取上清液待測。取85μL caspase-3反應(yīng)緩沖液，10μL待測上清液，5μL 2mmol/L caspase-3反應(yīng)底物DEVD-pNA，依次加入96孔酶標(biāo)板中，對照孔加入95μL反應(yīng)緩沖液，5μL caspase-3反應(yīng)底物DEVD-pNA，用封口膜封住，置于37℃恒溫箱中反應(yīng)1～2 h，取下封口膜，用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度。

1.3.8 Hsp27蛋白表達(dá)量測定

采用12%的分離膠和5%濃縮膠，將變性蛋白樣品離心吸取上清上樣，每條泳道上樣100μg總蛋白，電泳分離后用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫(20℃)封閉1 h，在1.5 mL的EP管中加入1 mL的封閉液，再加入適量的一抗，于4℃冰箱中放置12 h;將膜取出放入TBST洗膜盒中，在室溫條件下清洗3次，每次10 min;之后用1∶4 000稀釋的過氧化物標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，室溫條件下孵育1 h，再次清洗，隨后將ECL發(fā)光試劑滴加到膜上，5 min后，用濾紙盡量吸去膜邊緣多余的ECL發(fā)光試劑，將膜平放到壓片暗盒中，進(jìn)行壓片，5min后，在顯影液中顯影15 s，洗凈后將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中進(jìn)行定影。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，目的條帶的灰度與0 h條帶灰度之比即為Hsp蛋白表達(dá)量的百分?jǐn)?shù)。

1.3.9 剪切力

取厚約4 cm、質(zhì)量100 g左右的肉樣(除去表面脂肪和結(jié)締組織)，裝入塑料薄膜袋，用夾子封口，放入80℃水浴鍋中，加熱到中心溫度為75℃，取出冷卻至室溫，然后用1.27 cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取測定樣品，用剪切力儀測定剪切力，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.10 肌原纖維及線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

參照HORN等［14］研究方法，取尺寸為0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm的肉塊，用3%戊二醛磷酸鹽緩沖液固定，再用鋨酸固定，磷酸緩沖液沖洗，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片機(jī)切片，用Hitachi H-7650型透射電鏡進(jìn)行成像觀察。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均平行測定3次，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA，P＜0.01，P＜0.05)，多重比較采用新復(fù)極差法(P＜0.05)，用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞核及骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.1.1 細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化

如圖1所示，宰后成熟過程中對照組與CsA組牦牛骨骼肌細(xì)胞核形態(tài)存在一定差異。宰后6～24 h，牦牛骨骼肌細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)完整(如箭頭所示)，輪廓清晰，并且核質(zhì)分布均勻;但隨著成熟時間的延長，部分骨骼肌細(xì)胞核開始向邊緣遷移，同時細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間距逐漸增大，這是典型的細(xì)胞凋亡特征。KWAK等［15］及孫志昶等［8］研究也證實(shí)細(xì)胞核向邊緣移動，發(fā)生邊緣化，肌肉發(fā)生了明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。同時，在整個成熟過程中，CsA組骨骼肌細(xì)胞核形態(tài)較對照組骨骼肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，表明CsA組顯著抑制了骨骼肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生程度。

圖1 CsA處理對牦牛肉成熟過程中細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化的影響Fig．1 Effect of CsA treatment on morphological changes of yak skeletalmuscle nucleus during postmortem aging

2.1.2 骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

成熟是肌肉宰后發(fā)生的一個復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，機(jī)體在缺血缺氧情況下，肌肉pH值、ATP含量、線粒體形態(tài)及功能、骨骼肌細(xì)胞形態(tài)等均會發(fā)生不同程度的改變甚至破壞，同時細(xì)胞也進(jìn)入了一個不可逆的凋亡狀態(tài)［2］。肌纖維形態(tài)是評價肌肉嫩度的指標(biāo)之一，肌纖維直徑越小，嫩度越好［16］。由表1和圖1可知，2組骨骼肌肌纖維直徑和肌纖維橫截面積均隨著成熟時間延長而減小，肌纖維間距隨時間延長而增大，且在成熟的中后期肌纖維形態(tài)皺縮較明顯，王莉［16］研究結(jié)果也表明隨著成熟時間延長，骨骼肌肌纖維直徑和橫截面積逐漸減小且肌纖維間距逐漸增大;同時，宰后6 h，24～120 h，CsA組肌纖維直徑顯著或極顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01);12～120 h，CsA組橫截面積顯著或極顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，宰后12 h、120～168 h，CsA組肌纖維間距顯著或極顯著小于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，說明CsA組肌纖維皺縮速度較對照組慢，嫩度改善作用較弱，綜合上述指標(biāo)說明，CsA處理顯著抑制了成熟過程中肌纖維的皺縮，進(jìn)一步表明抑制細(xì)胞凋亡也可抑制骨骼肌細(xì)胞形態(tài)的改變。

表1 CsA處理對牦牛肉成熟過程中骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響Tab．1 Effect of CsA treatment on morphological changes of yak skeletalm uscle cells

2.2 肌肉內(nèi)環(huán)境變化

2.2.1 pH值

宰后細(xì)胞缺血缺氧條件造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸化，這種變化有利于凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，有研究表明，肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH值在7.4以上時能夠嚴(yán)重抑制caspase-3酶原的活化，從而抑制caspase-3的激活，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生［17］。由表2可知，對照組pH值在成熟過程中呈先下降后上升的變化，宰后24 h pH值顯著低于12 h(P＜0.05)，宰后168 h pH值較宰后0 h顯著降低14.58%(P＜0.05);宰后6 h、72～120 h，CsA組pH值顯著低于對照組(P＜0.05)，12～24 h時2組pH值無顯著差異，此研 究 結(jié) 果 與 賈 青［18］研 究 結(jié) 果 一 致，BOUDJELLAL等［19］研究發(fā)現(xiàn)pH值下降能夠?qū)е戮€粒體釋放Cyt-c到胞漿中，啟動caspases級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，也有研究發(fā)現(xiàn)pH值下降到6.3時，細(xì)胞凋亡發(fā)生，本研究指出宰后6 h、72～120 h，CsA組pH值顯著低于對照組，說明CsA處理能夠顯著影響肌肉內(nèi)環(huán)境的變化，且隨著成熟時間的延長，CsA抑制作用減弱，pH值下降程度降低，此研究結(jié)果與賈青［18］研究結(jié)果不同，其研究表明宰后24 h后，抑制劑處理組pH值在72～120 h顯著高于對照組，造成此現(xiàn)象的原因可能是所用凋亡抑制劑的種類及作用機(jī)理不同。

2.2.2 ATP含量

ATP是caspases家族發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)的必要條件，有研究表明肝臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要依賴ATP。由表2可知，隨著成熟時間的延長，對照組及CsA組中ATP含量呈不同程度的下降。宰后6～168 h，CsA組ATP含量均高于對照組，且在宰后12 h、72～168 h兩者之間ATP含量存在顯著差異(P＜0.05)，12 h時CsA組ATP含量比對照組高31.71%，說明CsA能夠抑制ATP含量的下降，ADRAIN等［20］研究指出ATP含量的降低會直接抑制caspases級聯(lián)反應(yīng)，使caspases降解蛋白的作用減弱，且抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生也會抑制ATP含量的下降，與本研究的結(jié)果相似，說明宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生與ATP含量的變化密不可分。

表2 CsA處理對牦牛肉成熟過程中肌肉內(nèi)環(huán)境變化的影響Tab．2 Effect of CsA treatment on internal environment changes of yak skeletalmuscle cells

2.3 MPTP開放程度及胞漿中Cyt-c濃度變化

2.3.1 MPTP開放程度

目前，關(guān)于線粒體凋亡途徑中Cyt-c的釋放機(jī)制主要有2種解釋:通過Bcl-2家族蛋白的調(diào)控;線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔外膜特異性斷裂，導(dǎo)致Cyt-c的釋放，在多種細(xì)胞模型中都表明Cyt-c通過MPTP釋放［21］。在牦牛肉宰后成熟過程中關(guān)于Cyt-c的釋放機(jī)制相關(guān)研究不足，HUANG等［1］研究表明在牛肉宰后成熟過程中，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)量沒有顯著變化，而促凋亡因子Bax表達(dá)量顯著增加。由表3可知，對照組MPTP的開放程度呈先增大后減小的變化且隨著成熟時間的延長MPTP呈不可逆的開放狀態(tài)。在整個成熟過程中，CsA組MPTP開放程度極顯著低于對照組(P＜0.01)，說明CsA處理確實(shí)抑制了MPTP的開放，VALERY等［22］的研究也證實(shí)CsA能夠抑制血細(xì)胞MPTP的開放，間接抑制Cyt-c的釋放并影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時，在諸如腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞模型中也證明CsA能夠抑制MPTP的開放，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，然而也有部分研究表明Cyt-c的釋放與MPTP無關(guān)，原因可能與所用細(xì)胞模型、MPTP的結(jié)構(gòu)組成及功能有關(guān)。

表3 CsA處理對牦牛肉成熟過程中MPTP開放程度及胞漿中Cyt-c濃度的影響Tab．3 Effect of CsA treatment on MPTP opening and Cyt-c content

2.3.2 胞漿中Cyt-c濃度

Cyt-c在多種細(xì)胞的凋亡過程中起著關(guān)鍵的凋亡信號放大作用，Cyt-c從線粒體釋放到胞漿是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟［7］。由表3可知，成熟前期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著低于對照組，而在成熟后期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著高于對照組，由此說明CsA處理抑制了線粒體中Cyt-c向胞漿中的釋放，但隨著CsA抑制作用的減弱，Cyt-c被抑制的程度也相應(yīng)減弱，導(dǎo)致在成熟后期CsA組中Cyt-c被大量釋放到胞漿中，由此證明CsA通過抑制MPTP的開放間接抑制了Cyt-c的釋放及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。HUANG等［1］研究表明，胞漿中Cyt-c呈先上升后下降的變化，與本研究對照組Cyt-c濃度變化趨勢一致，同時本研究結(jié)果與PETRONILLI等［23］及KUMARSWAMY等［24］的研究結(jié)果也一致，說明抑制MPTP開放能夠抑制線粒體Cyt-c釋放及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2.4 細(xì)胞凋亡因子變化

caspases在細(xì)胞凋亡過程中的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)變化中起著至關(guān)重要的作用，有研究表明活化的caspase-3能介導(dǎo)多種細(xì)胞模型中蛋白的水解過程，也有研究表明宰后成熟過程中細(xì)胞骨架蛋白的降解主要由caspase-3來完成，具有不可替代的地位［25］。由圖2可知，在整個成熟過程中(除72～120 h)，CsA組caspase-3活性均顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，表明CsA通過抑制Cyt-c的釋放進(jìn)而抑制下游caspase-3的激活，CHEN等［9］研究表明抑制細(xì)胞凋亡能夠顯著影響caspase-3的活性。PANDEY等［26］及FU等［27］研究表明caspase-9能夠激活下游的caspase-3發(fā)生細(xì)胞凋亡，也有研究指出在caspases蛋白酶水解的級聯(lián)放大反應(yīng)中，細(xì)胞內(nèi)的caspase-3酶原裂解成2種亞基，隨后這2種亞基異構(gòu)聚合，使caspase-3活化［28］。

圖2 CsA處理對caspase-3活性的影響Fig．2 Effect of CsA treatment on caspase-3 activity

Hsp27是機(jī)體中細(xì)胞維持和修復(fù)的重要成分，能特異性抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，有研究者通過免疫共沉淀試驗(yàn)證明，Hsp27可與Cyt-c和caspase-3的酶原結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［29］。圖3表明，對照組中Hsp27蛋白表達(dá)量隨著成熟時間的延長而顯著降低(P＜0.05)，72 h時達(dá)到最小值后又呈上升趨勢，此結(jié)果與李婕等［30］研究結(jié)果相一致; CsA組中，0～24 h時間內(nèi)的Hsp27蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)，說明在成熟過程中Hsp27蛋白表達(dá)量會受到成熟時間及CsA處理的影響，同時CsA組Hsp27蛋白表達(dá)量在整個成熟過程中均顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，表明細(xì)胞凋亡發(fā)生程度降低時，Hsp27蛋白表達(dá)量也會下降，說明CsA通過抑制細(xì)胞凋亡可以間接影響機(jī)體的某些應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 CsA處理對Hsp27蛋白表達(dá)量的影響Fig．3 Effect of CsA treatment on Hsp27 expression amount

圖4 CsA處理對牦牛肉成熟過程中剪切力變化的影響Fig．4 Effect of CsA treatment on shear force

2.5 剪切力變化

嫩度是在成熟過程中評價肉質(zhì)成熟程度的重要指標(biāo)，主要決定于成熟過程中肌肉組織各組分及肌肉內(nèi)部的生物化學(xué)變化對各組分特性的改變［2］。而剪切力是目前肉品研究中評價成熟過程中肌肉嫩度的代表性指標(biāo)。由圖4可知，2組肉樣在成熟過程中剪切力都呈先上升后下降的變化，且因蛋白凝固、肌纖維硬化，肌肉進(jìn)入僵直期，導(dǎo)致剪切力達(dá)到最大值，此研究結(jié)果與李婕等［30］的研究報道相一致;同時，在12～24 h時間內(nèi)，CsA組剪切力顯著或極顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，而在成熟72 h后，CsA組剪切力均顯著或極顯著低于對照組;以上研究結(jié)果表明，CsA通過抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，間接抑制了凋亡效應(yīng)酶對肌細(xì)胞骨架蛋白的降解，且隨著CsA抑制作用的減弱，肌肉嫩度得到改善，進(jìn)一步證明細(xì)胞凋亡對宰后肌肉的嫩化起到非常重要的作用，CHEN等［9］的研究結(jié)果也支持此結(jié)論。

2.6 肌原纖維及線粒體超微結(jié)構(gòu)

從圖5可以看出，2組牦牛肉肌原纖維超微結(jié)構(gòu)在形態(tài)上基本一致，明帶中間的Z線清晰，每一條肌原纖維都呈現(xiàn)規(guī)則的明帶和暗帶。對照組牦牛肉在成熟過程中肌原纖維超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，宰后24 h，肌原纖維連接緊密，肌原纖維框架結(jié)構(gòu)清晰，肌節(jié)完整且排列有序，同時，線粒體結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，線粒體的脊突明顯，隨著時間的延長，肌纖維的正常排列被破壞，肌間距離變寬，肌纖維發(fā)生皺縮，線粒體體積增大并發(fā)生腫脹，呈氣泡狀，宰后168 h，肌原纖維大面積斷裂、溶解，出現(xiàn)大量肌原纖維小片，Z線斷裂程度加重且部分線粒體溶解消失;CsA組中，宰后120～168 h，肌原纖維結(jié)構(gòu)均較對照組完整，依然能夠看到肌原纖維超微結(jié)構(gòu)變化不大，但是部分線粒體也呈空泡狀，脊突消失并發(fā)生了溶解;CsA組肌原纖維及線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞程度小于對照組，說明CsA通過抑制Cyt-c的釋放，間接抑制了成熟過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而降低了細(xì)胞凋亡對嫩度的改善作用，降低了超微結(jié)構(gòu)的破壞程度。

圖5 CsA處理對牦牛肉成熟過程中肌原纖維及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig．5 Effect of CsA treatment onmyofibrils and mitochondrial ultrastructure

3 結(jié)論

(1)CsA顯著抑制了牦牛肉宰后成熟過程中骨骼肌肌纖維的皺縮，影響肌肉內(nèi)環(huán)境變化，抑制MPTP的開放程度、胞漿中Cyt-c的濃度及caspase-3活性變化，同時也抑制了成熟過程中Hsp27的表達(dá)、肌原纖維及線粒體微觀結(jié)構(gòu)變化，且隨著成熟時間的延長，CsA的抑制作用減弱，細(xì)胞凋亡反應(yīng)進(jìn)程加快。

(2)CsA通過抑制MPTP開放程度間接抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并抑制凋亡效應(yīng)酶對肌細(xì)胞骨架蛋白的降解，且隨著MPTP被抑制作用的降低，肌肉嫩度得到改善，說明細(xì)胞凋亡對牦牛肉宰后內(nèi)環(huán)境變化及肌肉嫩化具有重要作用。

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Effects of Apoptosis on Muscle Internal Environment and Tenderness during Yak Meat Postmortem Aging

WANG Linlin1MA Junyi2YU Qunli1HAN Ling1GUO Zonglin1SHIHongmei3
(1．College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China 2．Qinghai Baide Investment Development Limited Company，Xining 810008，China 3．Gannan Institute of Animal Science and Veterinary，Hezuo 747000，China)

With the aim to explore the effects of apoptosis on muscle internal environment，apoptosis factors and tenderness during postmortem aging，the longissimus dorsi muscles injected with specific inhibitor cyclosporin A(CsA)of MPTP were taken as experiment objects．The muscle internal environment factors，apoptosis factors and tenderness index were measured．The results indicated that myofiber diameter and cross section area in the CsA group were significantly or extremely significantly larger than those in the control group(P＜0.05，P＜0.01);after 6 h and 72～120 h of postmortem，the pH value in the CsA group was lower than that in the control group(P＜0.05)，and at 6～168 h of postmortem，ATP contents in the CsA group were higher than those in control group，specially，after12 h and 72～168 h of postmortem，ATP contents in the two groups had significant difference(P＜0.05);the degree of MPTP opening in the CsA group was lower than that in the control group(P＜0.01);Cyt-c content in the cytoplasm was significantly or extremely significantly lower in the early aging stage，and the resultwas opposite in the late aging time;caspase-3 activities in the CsA group was lower than those in the control group during the whole time except after 72～120 h of postmortem;Hsp27 expression in the CsA group was lower than that in the control group，after 12～24 h of postmortem，the shear force of the CsA group was higher compared with the control group．Cyclosporin A could suppress the changes ofinternal environment，caspase-3 activities，Hsp27 expression level and the shear force and changes of myofibrils and mitochondrial ultrastructure by suppressing the opening of MPTP，the apoptotic process played a significant role in the changes of internal environment and yak meat tenderness during postmortem aging and the changes of internal environmentand tenderness could be adjusted by controlling the apoptosis process．

yak meat;postmortem aging;apoptosis;muscle internal environment;cyclosporine A; ultrastructure

TS251.1

A

1000-1298(2017)07-0317-08

2017-02-04

2017-04-05

青海省重點(diǎn)研發(fā)與轉(zhuǎn)化計劃項(xiàng)目(2017-NK-C6)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560463)、2015甘肅省財政廳專項(xiàng)和國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-38)

王琳琳(1988—)，女，博士生，主要從事畜產(chǎn)品加工研究，E-mail:jiayouwl123@163．com

余群力(1962—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事畜產(chǎn)品加工研究，E-mail:yuqunlihl@163．com

10．6041/j．issn．1000-1298．2017．07．040